CC BY
175
раздел ХИМИЯ
УДК 577.113.4+577.113.6+577.113.7
ХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ ДНК-ЧИПОВ Гарафутдинов P.P., Шепелевич И.С., Чемерис А.В., Талипов РФ.*
Рассмотрены основные направления создания ДНК-чипов: in situ и non in situ.
Указаны преимущества и недостатки используемых в настоящее время методов.
Проведен сравнительный анализ способов иммобилизации олигонуклеотидов на стекло. Представлены варианты постсинтетической модификации олигонуклеотидов и функционализации стеклянных подложек.
Введение
Бурное развитие молекулярной биологии и генетики во второй половине XX в. привело к накоплению значительного объема данных о строении и роли нуклеиновых кислот в живых организмах. Разработка и применение химических методов секвенирования ДНК позволили полностью расшифровать геномы большого числа вирусов, бактерий, грибов, частично исследовать генетический аппарат высших растений и животных, в том числе человека [1]. Поэтому возникла необходимость анализа и систематизации полученных данных. Кроме того, с развитием ДНК-технологий появилась возможность изучения экспрессии известных генов, определения мутаций в геномах различных организмов и проведения диагностики ряда инфекционных заболеваний.
В решении этих задач наиболее перспективным является использование ДНК-чипов, представляющих собой небольшие пластины с нанесенными на их поверхность фрагментами ДНК [2,3]. В настоящее время наблюдается повышенный интерес к проблеме создания чипов. Разрабатываются различные способы их изготовления, совершенствуются методики иммобилизации молекул нуклеиновых кислот на подложку [4].
Способы изготовления ДНК-чипов
Различают два способа создания ДНК-чипов. Первый способ объединяет методы, основанные на адресном синтезе олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа (направление in situ). Синтез проводят путем поэтапного добавления к растущей олигонуклеотидной цепи нуклеотидов, содержащих на 5’-конце лабильную защитную группу, снятие которой возможно под действием светового излучения, электрического напряжения или в ходе кислотного гидролиза (рис. 1).
Рис. 1. Способы депротекции в ходе синтеза олигонуклеотидов на чипах in situ.
* Талипов Рифкат Фаатович - доктор химических наук, профессор , проректор по научной работе БашГУ, заведующий кафедрой биоорганической химии БашГУ
Чемерис Алексей Викторович - доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией молекулярной биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики УфНЦ РАН Шепелевич Игорь Станиславович - кандидат химических наук, доцент кафедры биоорганической химии БашГУ Гарафутдинов Равиль Ринатович - аспирант кафедры биоорганической химии БашГУ
Электрохимическая депротекция включает два варианта. В случае прямой депротекции снятие защитной группы происходит при непосредственном приложении напряжения к ячейке-электроду. Основная сложность заключается в выборе электролабильных защитных групп: во избежание окисления азотистых оснований наиболее предпочтительно снимать их путём восстановления. В настоящее время набор групп, удовлетворяющих данному условию, ограничен. Наибольшее применение имеет и-нитробензоильная защита
[5]: ' '
Следует отметить, что существующие электролабильные группы имеют низкую эффективность удаления. Так, использование и-нитробензоильной группы требует 15-30 минутной депротекции, при этом эффективность составляет 60-90%.
Непрямая электрохимическая депротекция основана на образовании под действием тока кислоты. Ячейки чипа, в которых осуществляется синтез олигонуклеотидов, служат электродами, на поверхности которых в результате действия приложенного напряжения генерируется кислотный депротектор. Образующиеся протоны катализируют отщепление кислотолабильной защитной группы, преимущественно диметокситритильной (I )\П п: ' ' '
БМГЮ— основание НО-
Однако данный подход имеет ряд недостатков. Во-первых, большая подвижность протона делает невозможным создание ячеек малого размера, что приводит к снижению емкости чипа. Во-вторых, использование положительного потенциала способно вызвать окисление нуклеотидов и образование на электроде активных радикалов.
Термическая де протекция основана на использовании термолабильных катализаторов, в частности, термолабильных эфиров, гидролиз которых приводит к образованию протона. Чаще всего применяют эфиры пентафторбензойной кислоты:
C6F5COOR
Н20, 75°С
C6F5COOH ^ROH
Невозможность создания четкой разницы температур на границе ячеек обусловливает ограниченную применимость термической депротекции в изготовлении ДНК-чипов.
К настоящему времени наибольшее распространение получил фотоактивируемый in situ синтез олигонуклеотидов, в основе которого лежит применение фотолитографических масок, выполняющих функцию “трафарета”. Прямая фотодепротекция возможна при использовании мономеров с фотолабильными защитными группами, такими как [(X -метил-2-нитропиперонил)окси] карбонильная (MeNPOC),
диметоксибензоинкарбонатная (DMBOC), 2-(2-нитрофенил)пропоксикарбонильная (NPPOC) группы [6,7]. Они легко удаляются при облучении светом с высвобождением 5’-гидроксигрупп на концах олигонуклеотидных цепей:
MeNPOCO— основание НО-
hv
основание
В случае непрямой фотодепротекции кислотный депротектор образуется под действием светового излучения. Однако процесс образования кислоты в ходе фотолиза имеет относительно низкую эффективность: концентрация протонов оказывается недостаточной, поэтому приходится использовать дополнительный этап усиления каталитического действия, заключающийся в применении специальных фоточувствительных систем, легко генерирующих ионы 0 при облучении светом. Среди фотоактивируемых предшественников кислот, отвечающих требованиям олигонуклеотидного синтеза, выделим три группы соединений:
1) 1,2,4- и 1,2,5-диазонафтохинонтрисульфонатные эфиры;
2) производные триазина с и -галогенированными алкильными заместителями, например, трихлорометилтриазин;
3) ониевые соли, такие как диарилдиазониевые, арилсульфониевые и сульфоксониевые, четвертичные аммониевые, фосфониевые соли и др.
К последней группе относятся предложенные недавно иодониевые соли [8]:
ОМТгО—| основание ,,+ .—тт .-и НО —
Реакция носит автокаталитический характер, благодаря чему обеспечивается высокая чувствительность системы к облучению.
В целом методы фотоактивируемого синтеза олигонуклеотидов в приложении к созданию ДНК-чипов достаточно удобны. В качестве главного недостатка следует отметить необходимость изготовления большого набора фотолитографических масок, что является достаточно длительной и трудоемкой процедурой.
Вторым способом создания ДНК-чипов является иммобилизация предварительно синтезированных олигонуклеотидов на подложке (non in situ). Данный подход выдвигает ряд требований к выбору материала подложки, способам иммобилизации олигонуклеотидов, их химической модификации. Наиболее общими и важными, с нашей точки зрения, представляются следующие:
1. высокая функциональность поверхности подложки;
2. ковалентные связи между ДНК и поверхностью;
3. доступность прикрепленной ДНК для взаимодействующих с ней молекул;
4. низкий уровень неспецифических взаимодействий.
С целью создания прочной ковалентной связи между поверхностью подложки и молекулой прикрепляемого олигонуклеотида последний подвергают модификации. Преимущественно используют олигонуклеотиды, несущие гидроксильную или аминогруппы на 5’-конце:
5 ’ -НО-спейсер-олигонуклеотид-3 ’
5 ’ -КН2-спейсер-олигонуклеотид-3 ’
В качестве спейсерного фрагмента обычно выступают линейные цепи олигомеров этиленгликоля:
X II |
ОЛ О—Р—О—5 - олигонуклеотид-3
п О
где n = 2-10, X = -NH2, -ОН, -SH и др.
Прикрепление олигонуклеотидов осуществляется различными способами [9]. Наиболее распространенным является непосредственное нанесение раствора модифицированного олигонуклеотида на подготовленную поверхность подложки. В результате протекающей реакции конденсации полинуклеотидная цепь оказывается фиксированной на ней [10].
В качестве подложек для иммобилизации могут выступать различные материалы: кремний, стекло, золото, полимеры. Наиболее часто используется стекло в силу ряда его характерных свойств:
• нерастворимость в органических и неорганических растворителях;
• относительная химическая инертность;
• низкая фоновая флуоресценция;
• отсутствие неспецифических взаимодействий;
• достаточная прочность;
• доступность и простота в обращении.
Перед прикреплением молекул олигонуклеотидов стекло подвергают очистке, в результате которой поверхность становится более гладкой, с нее удаляются возможные органические загрязнения, ионы тяжелых металлов и освобождаются гидроксильные группы [11]. Затем проводят функционализацию стекла действием алкоксисиланов [12]:
стекло
(В.О)38і(СН2)3У
Зі-----------ОН
-В. ОН
стекло
\
\
\
ч
\
\
-а-----О-----8і(СН3)3Т
где У = -Ш2, -ЭН,
И=А1к
Возможна дальнейшая функционализация, осуществляемая путем взаимодействия поверхностных групп с различными соединениями. Так, обработка ТН2-стекол ангидридами дикарбоновых кислот приводит к созданию свободных карбоксильных групп, диизотиоцианатом - ТСБ-групп. Наличие высокореакционных групп и/или применение конденсирующих реагентов, чаще всего дициклогексилкарбодиимида, позволяет проводить присоединение олигонуклеотидов [9]. Варианты методик иммобилизации многочисленны [13-15], основные приведены в таблице 1.
Таблица 1. Способы пришивки олигонуклеотидов к стеклу.
№ функциональная группа на поверхности стекла функциональная группа на конце цепи ОДН* образующаяся связь
1 ^1Ш2 ОНС-спеЙ сер-0 ДН НООС-спейсер-ОДН КЕ=СН-с п е й с ер - О ДН |™'-1ШСО-спей сер-0 ДН
2 ^-8Н Н8-спейсер-ОДН |™^-8-8-спейсер-ОДН
3 Ксоон Н2М-спейсер-ОДН і^^-СОЇШ-спейсер-ОДН
4 ^1 Н2М-спейсер-ОДН КсН(ОН)СН2Ш-спейсФ-ОДН
5 Ксно Н2]>Т-спейсер-ОДН Н2ШНССШН-спейсер-ОДН |л™- СН=1Ш-с п е й с ер - О ДН ^СН=ШШНС0Ш1-спейсер-0ДН
6 І—нсг Н2М-спейсер-ОДН 1—ЮКгаНН-спйсер-ОДН
7 Ь~шсомшн2 ОНС-спей сер-0 ДН ^ШСО№ШН=СН-спейсер-ОДН
* ОДН - олигодезоксирибонуклеотид
Из данных таблицы 2 следует, что иммобилизация, как правило, осуществляется за счет реакций конденсации. В связи с этим вполне обоснованным является использование в качестве модификатора такого сильного нуклеофила, как аминогруппа. В случае образования азометиновой группировки дополнительно проводят ее восстановление боргидридом натрия, приводящее к более устойчивым вторичным аминам. Для всех остальных случаев образующаяся между олигонуклеотидом и подложкой ковалентная связь имеет достаточную для проведения гибридизации прочность.
В [11] приведены результаты сравнения некоторых способов иммобилизации олигонуклеотидов. Авторы использовали в качестве подложек стекла с электрофильными и нуклеофильными поверхностными группами, изготовленные как в условиях лаборатории, так и коммерческие. Полученные ими результаты сведены нами в таблицу 2.
Таблица 2. Зависимость интенсивности гибридизационного сигнала от вида модификации стеклянной подложки и способа иммобилизации олигонуклеотидов
№ Условия иммобилизации Оптическая плотность, 10з (450-655 нм)
l коммерческое ЫН2-стекло, РО43"-ОДН, 10 нМ 250 і 60
2 ЫН2-стекло, изготовленное в условиях лаборатории (ЛУ), РО43--ОДН, 10 нМ 190 і 45
З ЫН2-стекло (ЛУ), НООС-ОДН, 50 нМ 250 і 15
4 НООС-стекло (ЛУ), ЫН2-ОДН, 50 нМ З75 і 25
5 коммерческое СНО-стекло, ЫН2-ОДН, 3 мкМ З70 і 60
6 СНО-стекло (ЛУ), ЫН2-ОДН, 3 мкМ З40 і 40
Анализ приведенных данных показывает, что наилучшими подложками являются стекла, несущие электрофильные группы. Подложки, изготовленные в лабораторных условиях, дают чуть более низкие значения гибридизационного сигнала. Следует отметить более высокую воспроизводимость результатов для образцов 3 и
4.
Разработана группа методов, основанных на реакциях сополимеризации [16,17]. Олигонуклеотиды, несущие на 5’-конце остатки акриламида, вовлекают в реакцию сополимеризации согласно упрощенной схеме:
Олигонуклеотидные пробы оказываются фиксированными в тонком слое полиакриламидного геля. Иммобилизация в объеме геля значительно увеличивает емкость чипа, что повышает чувствительность измерений. Жесткая фиксированность исключает взаимодействие молекул олигонуклеотидов друг с другом и с поверхностью подложки, где гетерофазные процессы протекают более сложным образом [7]. Однако полиакриламид имеет высокую фоновую флуоресценцию, что вносит некоторую погрешность в результаты анализа.
Интересен подход, в котором для иммобилизации используется электросополимеризация пиррола и олигонуклеотидов, несущих на конце цепи остатки пиррола [18]. Приложение напряжения к электроду приводит к полимеризации пиррол-мономеров, в результате молекулы ОДН оказываются фиксированными на поверхности:
олигонуклеотид олигонуклеотид
пиррол J
полипиррол с включением молекул олигонуклеотидов
Несколько отличный от предыдущих метод предложен Kumar A. et. al. [19]. Стекло не фунционализируют, а проводят взаимодействие алкоксисилана с олигонуклеотидом, получая силилированные нуклеиновые кислоты, которые затем прикрепляют к стеклу согласно обычной методике модификации стекла.
Для повышения емкости ДНК-чипов предложены методы создания дендримерных структур [20,21]. Увеличение количества функциональных групп на поверхности обеспечивает более плотную посадку молекул олигонуклеотидов. Однако в случае чрезмерной загрузки поверхности при проведении гибридизации возникают стерические затруднения, что приводит к уменьшению величины детектируемого сигнала [22].
Заключение
Рассмотренные методы имеют многочисленные недостатки, ограничивающие их использование для производства ДНК-чипов в промышленных масштабах. Так, главным недостатком варианта in situ является неизбежное образование на чипе неверных последовательностей. Применение фотолитографических масок в методах фотоактивируемого синтеза олигонуклеотидов значительно усложняет процесс. Количество масок достигает 4n (n - длина олигонуклеотида), их создание - длительный и капиталоемкий процесс.
Существенным ограничением применимости метода non in situ является необходимость синтеза большого количества различных олигонуклеотидных последовательностей и недостаточная емкость получаемых чипов (до 1000 ячеек), обусловленная механическим способом нанесения проб.
На сегодняшний день создание ДНК-чипа, отвечающего всем необходимым требованиям и готового к широкому внедрению в практику, представляется проблематичным. Основные препятствия, связанные с химическими аспектами данной проблемы, могут быть устранены в результате разработки новых методов синтеза и модификации олигонуклеотидов, а также за счет выбора наиболее подходящего материала подложки. В целом, задача по поиску новых и совершенствованию уже разработанных способов создания ДНК-чипов остается открытой.
ЛИТЕРАТУРА
1. Чемерис A.B., Ахунов Э.Д., Вахитов B.A. Секвенирование ДНК. М.: Наука, 1999. 429 с.
2. Cheung V.G., Morley M., Aguilar F. и др. //Nature Genetics (Suppl.). 1999. V.21.P. 15-19.
3. Wang J. //Nucleic Acids Res. 2000. V.28. №16. P. 3011-3016.
4. Case-Green S.C., Mir K.U., Pritchard C.E. и др. // Current Opinion in Chemical Biology. 1998. 2. P. 404-410.
5. Roget A., Livache T. //Mikrochim. Acta. 1999. 131. P. 3-8.
6. Beier M., Hoheisel J.D. // Nucleic Acids Res. 2000. V.28. №4. e11.
7. DNA arrays: methods and protocols / Под ред. Rampal B. Jang. (Methods in molecular biology). Totowa: Humana Press. 2001. V.170. 264 p.
8. Gao X., LeProust E., Zhang H. и др. //Nucleic Acids Res. 2001. V.29. №22. P. 4744-4750.
9. Lobert P.E., Bourgeoir D., Pampin R. и др. // Sensors and Actuators B. 2003. 92. P. 90-97.
10. Joos B., Kuster H., Cone R.//Anal. Biochem. 1997. 247. P. 96-101.
11. Zammateo N., Jeanmart L., Hamels S. и др. // Anal. Biochem. 2000. 280. P. 143-150.
12. Walsh M., Wang X., Weimer B. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. 47. P. 221-231.
13. Roger Y., Jiang-Baucom P., Huang Z.-J. и др. // Anal. Biochem. 1999. 266. P. 23-30.
14. Raddats S., Mueller-Ibeler J., Kluge J. // Nucleic Acids Res. 2002. V.30. №21. P. 4793-4802.
15. Podyminogin M.A., Lukhtanov E. A., Reed M. W. // Nucleic Acids Res. 2001. V.29. №24. P. 5090-5098.
16. ProudnikovD., Timofeev E., Mirzabekov A. // Anal. Biochem. 1998. 259. P. 34-41.
17. Rehman F.N., Audeh M., Abrams E.S. и др. // Nucleic Acids Res. 1999. V.27. №2. P. 649-655.
18. Livache T., Fouque B., Roget A. и др. // Anal. Biochem. 1998. 255. P. 188-194.
19. Kumar A., Larsson O., Parodi D. и др. //Nucleic Acids Res. 2000. V.28. №14. e71.
20. Benters R., Niemeyer C.M., Drutschmann D. и др. // Nucleic Acids Res. 2002. V.30. №2. e10.
21. Le Berre V., Trevisiol E., Dagkessamanskaia A. и др. //Nucleic Acids Res. 2003. V.31. №16. e88.
22. ShchepinovM.S., Case-Green S.C., SouthernE.M.//Nucleic Acids Res. 1997. V.25. №6. P. 1155-1161.
Поступила в редакцию 02.12.04 г.
