CC BY
8УДК 661.725.031.74 : 612.015.161
ХИМИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК ОВСА ДЛЯ СИНТЕЗА БИОЭТАНОЛА
О.В. Байбакова
При использовании химической предварительной обработки плодовых оболочек овса получен субстрат (волокнистый продукт) с высокой реакционной способностью к ферментативному гидролизу. Исследован процесс осахаривания волокнистого продукта плодовых оболочек овса. С помощью штамма Saccharomyces св^Шае ВКПМ Y-1693 получен биоэтанол на среде волокнистого продукта плодовых оболочек овса. Показано, что при одновременном процессе проведения стадий ферментативного гидролиза и спиртового брожения выход этанола увеличивается в 1,1 раза по сравнению с последовательным процессом.
Ключевые слова: плодовые оболочки овса, волокнистый продукт, ферментативный гидролиз, биоэтанол.
ВВЕДЕНИЕ
Бесконечность объемов целлюлозосо-держащего сырья, его доступность во всех регионах мира, и универсальность использования для превращения в различные продукты микробиологической трансформации привлекает все большее внимание исследователей [1-3].
С целью исследований процессов получения биоэтанола из ферментативного гид-ролизата в качестве сырья для субстратов использовались плодовые оболочки овса (ПОО).
Плодовые оболочки овса, по сути, являются отходами сельскохозяйственного производства, поэтому их выращивание, сбор и транспортировка являются практически бесплатными. ПОО - весьма распространенный и легкодоступный сырьевой источник в сельскохозяйственных регионах РФ, они составляют 28 % от массы зерна, и для перерабатывающих заводов со средней производительностью 1400 т овса в месяц отсутствие схемы их утилизации является нерешенной проблемой. Следует отметить, что ранее ПОО рассматривались как гемицеллюлозное сырье и источник получения фурфурола и ксилита [4]. В связи с высоким содержанием целлюлозы (до 35 %) и размещением ПОО непосредственно в промышленных районах, их позиционируют в качестве концентрированного вида отходов - потенциального источника недревесной целлюлозы.
В ИПХЭТ СО РАН ПОО рассматриваются как перспективное сырье для получения растворов сахаров методом ферментативного гидролиза [5] с последующей микробиологической конверсией в ценные продукты (в том
числе в биоэтанол), а также в качестве сырья для выделения целлюлозы с последующей трансформацией её в эфиры [6, 7].
Химическая предобработка сырья необходима для разрушения взаимосвязей между полимерами. Цель предобработки - изменение физических особенностей и химического состава/структуры гидролизуемой части сырья, что делает целлюлозу более доступной для ферментативного гидролиза и превращения её в раствор сахаров. Таким образом, предобработка служит важным этапом устранения прочности сырья и повышения выхода сбраживаемых сахаров на этапе энзиматиче-ского разрушения [8].
Целью данной работы являлось исследование химической обработки плодовых оболочек овса для синтеза биоэтанола, а так же изучение влияния последовательности технологических стадий осахаривания и сбраживания на процесс биосинтеза этанола.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Субстрат для процесса осахаривания был получен на опытном производстве обработкой плодовых оболочек овса в одну стадию разбавленным раствором щелочи при температуре 90-96 °С. В результате химической обработки сырья был получен субстрат, названный волокнистый продукт (ВП). Плодовые оболочки овса до химической обработки и после нее представлены на рисунке 1. До химической обработки ПОО представляют собой морфологически однородное, сходное по размеру и усредненное по химическому составу сырье, после обработки - волокнистый продукт светлого цвета и рыхлой структуры.
б)
Рисунок 1 - Плодовые оболочки овса до химической обработки (а) и после нее (б)
Характеристики ВП ПОО представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Характеристики ВП ПОО
Характеристики субстрата М.д., % в пересчете на а.с.с.
а-целлюлоза 89,0
Кислотонерастворимый лигнин 5,81
Пентозаны 4,5
Зольность 0,63
Для процесса осахаривания в работе использовали промышленно доступные биокатализаторы «Целлолюкс-А» (производитель ПО «Сиббиофарм», Бердск) и «Брюзайм BGX» (производитель «Polfa Tarchomin Pharmaceutical Works S.A.», Польша, для компании «Diadic International Inc.», США). Препарат «Целлолюкс-А».
Технологические стадии осахаривания и сбраживания проводили последовательно и
одновременно. Для проведения процессов в колбу Эрленмейера емкостью 1000 мл помещали навеску субстрата и дистиллированную воду. Концентрация субстрата составила 60 г/л.
При последовательном процессе осаха-ривания-сбраживания (ППОС) ферментолиз проводили в водной среде при рН 4,7 (корректировку осуществляли ортофосфорной кислотой и гидроксидом аммония) и при непрерывном перемешивании с частотой 150 мин-1. Температура гидролиза составила 45 °С, продолжительность - 72 ч. Мультиэнзимную композицию вносили следующим образом: «Цел-лолюкс - А» в расчете 0,04 г фермента на 1 г субстрата и «Брюзайм BGX» в расчете 0,1 г фермента на 1 г субстрата. В результате процесса осахаривания был получен ферментативный гидролизат, который стерилизовали методом автоклавирования при 0,5 атм в течение 40 мин.
При одновременном процессе осахарива-ния-сбраживания (ОПОС) процесс осахарива-ния проводился в приведенных выше условиях, но его продолжительность составила 24 ч, после чего ферментативный гидролизат охлаждали до 28 °С, вносили засевные дрожжи и в течение трех последующих суток проводили сбраживание, совмещенное с осахариванием.
В обоих случаях сбраживание проводили с использованием штамма дрожжей БаооЬа-готуовв сегву'мав Y-1693 Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика г. Москва). Штамм был выделен из ферментера Котласского целлюлозно-бумажного комбината и использовался для производства этанола на сульфитных щелоках. Особенностью штамма является его устойчивость к вредным примесям гидролиза-тов [9]. В качестве среды для приготовления инокулята использовался стерильный солодовый экстракт. В колбу Эрленмейера (250 мл), со 100 мл среды вносили посевную петлю из клеток, выращенных на скошенном агаре с солодовым экстрактом дрожжей, далее штамм культивировали в течение 2 суток в термостате при температуре 28 °С.
Доза инокулята составила 10 %. Иноку-лят имел следующие характеристики для последовательного процесса: общее количество - 72,8 млн. КОЕ/мл, из них почкующихся -29,2 %; для одновременного процесса: общее количество - 85,3 млн. КОЕ/мл, из них почкующихся - 24,2 %. Сбраживание проводили в анаэробных условиях при 28 °С в течение трех суток.
Концентрацию сахаров в пересчете на глюкозу определяли спектрофотометриче-ским методом с помощью реактива на основе
ХИМИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК ОВСА ДЛЯ СИНТЕЗА БИОЭТАНОЛА
3,5-динитросалициловой кислоты (спектрофотометр «UNICO» UV-2804, США) в пересчёте на глюкозу. Выход редуцирующих веществ (РВ) рассчитан как отношение массы РВ к массе субстрата, с учетом коэффициента, связанного с присоединением молекулы воды к ангидроглюкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате ферментативного гидролиза.
Активную кислотность измеряли потен-циометрически (рН-метр Checer-1). Крепость бражек (объемная доля спирта) определяли ареометром для спирта в дистилляте, полученном после предварительной перегонки спирта из бражки, в соответствии с методикой ГОСТ Р 51135-2003 [10].
По крепости полученных бражек и концентрации РВ в исходной среде рассчитывали выход биоэтанола. Теоретическая концентрация этанола рассчитана по стехиометри-ческому уравнению брожения, выход биоэтанола - как отношение экспериментальной концентрации этанола к теоретической. Полученные образцы биоэтанола концентрировали методом простой перегонки, дополнительной очистки не проводили. Анализ этанола выполнен методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) по ГОСТ Р 51786-2001 [11] на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором «Кристалл 2000М» фирмы «СКБ Хроматэк».
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Зависимости концентрации РВ от продолжительности процессов осахаривания-спиртового брожения, проводимых последовательно и одновременно, представлены на рисунке 2.
Полученные результаты показали, что при ППОС максимальное накопление РВ происходит через 72 ч ферментации и составляет 56,7 г/л, а при ОПОС - через 32 ч и составляет 34,5 г/л. Это можно объяснить тем, что при добавлении дрожжей в ОПОС через 24 ч от начала процесса РВ начинают расходоваться на синтез этанола, то есть они отводятся из системы и таким образом равновесие суммарной ферментативной реакции гидролиза целлюлозы постоянно смещается в сторону образования продуктов реакции.
Результаты спиртового брожения ферментативного водного гидролизата волокнистого продукта плодовых оболочек овса представлены в таблице 2.
Продолжительность процесса, ч
—ППОС —•— ОПОС
Рисунок 2 - Зависимости концентрации РВ
от продолжительности процесса при одновременном и последовательном осахаривании-сбраживании
При ППОС этанол синтезируется с выходом 41,7 % от РВ, выход этанола из 1 т ПОО составляет 10,6 дал. При ОПОС этанол синтезируется с выходом 46,3 % от РВ, выход этанола из 1 т ПОО составляет 11,8 дал. Сравнение синтеза этанола, полученного при проведении процесса осахаривания-спиртового брожения последовательно и одновременно, показывает, что при одновременном про-цессе выход этанола увеличивается в 1,1 раза по сравнению с последовательным процессом.
При проведении процессов осахарива-ния-сбраживания одновременно исключается стадия фильтрования ферментативного гид-ролизата и сокращается продолжительность технологических стадий в 1,5 раза Остаточная концентрация редуцирующих веществ в бражке ниже при ОПОС в 6,3 раза, чем при ППОС, что также указывает на повышение эффективности процесса.
Полученные образцы биоэтанола сконцентрированы простой перегонкой, без дополнительной очистки. Анализ качества полученных образцов биоэтанола выполнен методом газожидкостной хроматографии по ГОСТ [12] на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором «Кристалл -2000М» фирмы «СКБ Хроматэк». Установлено, что спирты, полученные из волокнистого продукта плодовых оболочек овса, характеризуются низким содержанием эфирной фракции и метанола.
Таблица 2 - Показатели сбраживания при проведении технологических стадий одновременно и последовательно
С помощью химической предварительной обработки плодовых оболочек овса получен субстрат (волокнистый продукт) с высокой реакционной способностью к ферментативному гидролизу. Исследован процесс осахаривания волокнистого продукта плодовых оболочек овса, установлено, что выход РВ составил 85,1 % от массы субстрата.
Получен биоэтанол из ВП ПОО. Показано, что при одновременном процессе проведения стадий ферментативного гидролиза и спиртового брожения выход этанола увеличивается в 1,1 раза по сравнению с последовательным процессом. Кроме того, при одновременном процессе исключается стадия фильтрования ферментативного гидролизата и в 1,5 раза сокращается общая продолжительность технологических стадий.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Jordan, D. B. Plant cell walls to ethanol / D. B. Jordan, M. J. Bowman, J. D. Braker, B. S. Dien, R. E. Hector, C. C. Lee, J. A. Mertens, K. Wagschal // Biochem. J. - 2012. - 442. - P. 241-252.
2. Chaud LCS, da Silva DDV, de Mattos RT, Felipe MGA. Evaluation of oat hull hemicellulosic hydro-lysate fermentability employing Pichia stipites. Braz Arch Biol Technol. - 2012. - 55. Р 771-777.
3. Sun, Y. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review / Y. Sun, J. Chehg // Bioresourse Technology. - 2002. - № 83. - Р. 1-11.
4. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ. Ч. II. - Спб. : АНО НПО «Профессионaл», 2006. - 1142 с
5. Будаева, В. В. Исследование ферментативного гидролиза отходов переработки злаков / В. В. Будаева, Р. Ю. Митрофанов, В. Н. Золотухин // Ползуновский вестник. - 2008. - № 3. - С. 322-327.
6. Будаева, В. В. Карбоксиметилирование плодовых оболочек овса / В. В. Будаева, М. В. Об-резкова, Н. А. Томильцева, Г. В. Сакович // Строительство нефтяных и газовых скважин на суше и на море. - 2011. - № 9. - С. 41-45.
7. Якушева, А. А. Свойства нитроцеллюлоз из хлопка и плодовых оболочек овса / А. А. Якушева // Ползуновский вестник. - 2013. - № 3. - С. 202-206.
8. F. Hu, A. Ragauskas Pretreatment and Lignocellulosic Chemistry. // Bioenerg. Res. - 2012. - № 5. - P. 1043-1066.
9. Скиба, Е. А. Изучение устойчивости штамма Saccharomyces œrevisiae ВКПМ Y-169 к ферментативным гидролизным средам / Е. А. Скиба, О. В. Байбакова // Ползуновский вестник. - 2013 -№ 3. - С. 214-219.
10. ГОСТ Р 51135-2003. Изделия ликерово-дочные. Правила приемки и методы анализа. Технические требования. - Введ. 1998-03-02. - М. : ИУС, 2003. - 116 с.
11. ГОСТ Р 51786-2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод определения подлинности. - М. : Изд-во стандартов, 2001. - 8 с.
12. ГОСТ Р 51786-2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод определения подлинности. - М. : Изд-во стандартов, 2001. - 8 с.
Байбакова О.В., аспирант, младший научный сотрудник лаборатории биоконверсии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук (ИПХЭТ СО РАН), [email protected], тел. (3854) 30-59-85.
Показатель ППОС ОПОС
Концентрация субстрата (ЛЦМ ПОО), г/л 60,0 60,0
Максимальная концентрация РВ на стадии ферментативного гидролиза, г/л 56,7 34,5
Крепость бражки, об. % 1,8 2,0
Остаточная концентрация РВ в бражке, г/л 8,8 3,4
Выход этанола, % от теоретического 41,7 46,3
Выход этанола из 1 т сырья (ПОО), дал 10,6 11,8
ВЫВОДЫ
