CC BY
36
УДК 547.597
ХЕМОТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ ARMILLARIA
Т.П. ^кина1, И.А. Горбунова2, И.И. Баяндина3, О.И. Сальникова1
'Новосибирский институт органической химии СО РАН 630090 Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 9; е-mail: [email protected]
2Центральный сибирский ботанический сад СО РАН 630090 Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101; е-mail: [email protected]
3Новосибирский Государственный Агроуниверситет, Новосибирск, Россия.
Фитохимическое исследование экстрактов плодовых тел дереворазрушающего гриба опенка осеннего Armillaria mellea (Vahl ex. Fr.) P. Kumm. привело к выделению и идентификации ряда биологически активных в е-ществ, таких как жирные кислоты, терпеноиды, стерины, полипренолы, долихолы, пигменты и другие соедин е-ния. В Китае опенок осенний используется в пищу, а также для лечения головокружения, головной боли, невр астении, бессонницы и судорог. Тем не менее, сведения о химическом состав е экстрактов опенка серого Armillaria cepistipes Velen. в литературе отсутствуют.
Мы приготовили экстракт опенка серого и разделили его для исследования на кислые и нейтральные фра к-ции. Наши условия анализа позволили идентифицировать ряд веществ, таких как алифатические кислоты, спирты и углеводороды, а также ди- и тритерпеновые соединения. Селективно выделен эритритол. Большинство БАВ обнаружено в исследованном сырье впервые. Полученные данные отличаются от компонентов экстрактов Armil-laria mellea.
Ключевые слова: хромато-масс-спектрометрия, липофильные компоненты, опенок осе нний, Armillaria
Phytochemical investigation of extracts of fruiting bodies of the wood -rotting fungi honey mushroom Armillaria mellea (Vahl ex. Fr.) P. Kumm. led to the isolation and identification of several biologically active substantions, such as fatty acids, terpenoides, sterols, polyprenols, dolichols, pigments and other compounds. In China honey mushroom is eaten as food by people and used to treat of dizzness, headache, neuras thenia, insomnia, numbness in limbs, and convu l-sion. But information on the dominant co mponents of extracts of Armillaria cepistipes Velen. is absent.
We obtainted MTBE-extract of fruiting bodies of Armillaria cepistipes and separated it towards neutral and acid constituents.
The neutral constituents were analyzed without the treatment (acetylation and silylation) using a Hewlett -Packard G 1800 A system with mass-selective detector HP 5971 and HP-5 MS column (30 mx 0,25 mm x 0,25 ^m). The investigation of the acid fractions was carried out after full methylation by diazomethane on the same conditions.
Our conditions of analysis permit to identify a row of substances such as aliphatic acids, hydrocarbons and alcohols, and to investigate some di- and triterpenic compounds. Erythritol was obtained selective. The most of these biologically active substances were found for the first time in this raw material. The obtained data were different from constituents of Armillaria mellea extracts.
Key words: chromatomass-spectrometry, lipophylic components, Armillaria, Honey Mushroom
ВВЕДЕНИЕ
Грибы вида Armillaria mellea (Vahl ex. Fr.) P. Kumm. являются ценным пищевым продуктом и лекарственным сырьем. В Китае плодовые тела эт ого гриба используют для профилактики и лечения депрессии, головной боли, судорог, обм орочных состояний, неврастении, бессонницы (Guo, 2008). В лечебных целях выращивают культуру ткани, с о-держащую, по данным исследователей, ряд ценных метаболитов. Исследованы также составы плод о-вых тел и микоризы. При этом обнаружены алиф а-тические кислоты в свободном и этерифицирова н-ном виде (Yilmaz, 2006), дитерпеновые соединения, преимущественно кислого характера (Ayer, 1987), стерины и тритерпеноиды (Guo, 2007; Guo, 2008), пигменты и флюоресцентные ароматические соединения (Ayer, 1987; Ebrahimzadeh, 1995), поли-пренолы и долихолы (Кукина, 2007), полиолы и углеводы (Birkinshaw, 1948) и другие биологически активные вещества.
Алифатические кислоты в основном в виде ж и-ров представлены пальмитиновой, олеиновой, сте а-риновой и арахидиновой кислотами, доминир ует линолевая кислота, содержание линоленовой н е-значительно. Непредельные кислоты преоблад ают над насыщенными (Yilmaz, 2006). Кроме того, среди липидов обнаружены азелаиновая и орселлин о-вая кислоты и глицерин-моноолеат (Yang, 1991). В составе дитерпеновых соединений идентифицир о-ваны дегидроабиетиновая кислота, пимаровая, из о-пимаровая, сандаракопимаровая, левопимар овая, 7-оксо-дегидроабиетиновая, 7 -оксо-15-гидрокси-
дегидроабиетиновая кислоты, а также эндо -пероксид (Ayer, 1987). Среди тритерпеновых соединений идентифицированы 3 а-
гидроксифриделан-2-он, 5 а,6а-эпокси-24(Я.)-
метилхолеста-7,24-диен-3Р-ол, 6,9-эпокси-эргоста-7,24-диен-3Р-ол, эргостерин, 5,8-эргостерин-пероксид, небольшие количества Р-ситостерина и стигмастерина (Guo, 2007; Guo, 2008). Обнаружено три оранжевых пигмента: аустоцистин F, аверуфин
и аверуфанин, а также флюоре сцентные соединения ароматической природы (Ebrahimzadeh, 1995) и сесквитерпеновые эфиры 4'-метилмелледональ, армилларитин и армилларивин ( Yang, 1991). Нами также впервые обнаружены заметные количества полипренолов и долихолов (Кукина, 2007). Поли о-лы идентифицированы как D-эритритол и D-маннитол Birkinshaw, 1948; Yang, 1991). В составе экстрактов Armillaria mellea обнаружена также уникальная армилляриевая кислота, обладающая антибиотическими свойствами против грам-положительных бактерий и дрожжевых грибов (Obuchi, 1990).
Однако детальное изучение морфологических особенностей плодовых тел Armillaria mellea позволило выделить несколько отдельных видов, отличающихся, в частности, строением спор, фо рмой и расположением чешуек на шляпке, формой но ж-ки. Теперь перед химиками стоит задача изучения химического состава каждого вида, так как эта и н-формация отсутствует в литературе.
Целью нашей работы было изучение состава липофильных компонентов эфирного экстракта плодовых тел опенка серого (Armillaria cepistipes Velen.) и сравнение его с литературными данными по Armillaria mellea. В литературе сведения о химическом составе Armillaria cepistipes практически отсутствуют. Armillaria cepistipes относится к классу Базидиомицеты - Basidiomycetes - высшие грибы с многоклеточным мицелием. Половое спор о-ношение - базидиоспоры - экзогенные споры, сидящие на особых выростах мицелия - базидиях. Подкласс Холобазидиомицеты - Holobasidiomyceti-dae - грибы с неразделенной одноклеточной бул а-вовидной или цилиндрической базидией. Группа порядков Гименомицеты - Hymenomycetidae, где базидии соединены в тесный палисадный слой -гимений.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНА Я ЧА СТЬ
Сырье заготовлено на юге Красноярского края в сентябре 2006 года. Идентификация сырья пров едена по морфологическим критериям, наиб олее полно обобщенным в обзоре (Павлов, 2006), и не вызывает сомнения. Сравниваемые виды отличаю т-ся размерами и формой шляпки, цветом и распол о-жением чешуек, формой и размерами ножки, цветом и формой кольца. Так, у Armillaria mellea кольцо толстое, прочное, у Armillaria cepistipes при росте плодового тела редуцируется до полного исче з-новения. Различны и микроструктуры исследу емых видов: базидии Armillaria cepistipes отличаются от базидий Armillaria mellea наличием пряжек.
В ходе работы плодовые тела грибов фракци о-нированы вручную на шляпки и ножки, каждая фракция измельчена при помощи шнековой др о-билки и проэкстрагирована метил-трет-бутиловым эфиром (МТБЭ) в аппарате Сокслета. Выход эфироэкстрактивных веществ из ножек опенка серого
8,5 %, из шляпок - 6,8 %. Липофильные компоненты отделены от водорастворимых экстракцией в о-да:гексан или вода:МТБЭ. Экстракт ножек соде р-
жал не менее 60 % водорастворимой фракции. В составе экстракта шляпок преобладали ж иры.
Липофильные компоненты исследовали при помощи хроматомасс-спектрометрии (ХМС). Ли-пофильная часть экстракта ножек грибов разделена на кислые и нейтральные составляющие путем омыления водно-спиртовым раствором щелочи. Навеска исследуемого экстракта весом 1 г раств о-рялась в 10 мл омыляющей смеси, содержащей 15 % едкого кали, 10 % дистиллированной воды и 75 % этилового спирта по весу. Смесь кипятили на магнитной мешалке с подогревом при инте нсивном перемешивании в колбе, снабженной обратным холодильником с водяным охлаждением, в течение
1,5 часов. После окончания реакции (контроль вели по ТСХ до исчезновения фракции сложных эф иров) реакционную смесь разбавляли водой в 4 раза и экстрагировали в делительной ворон ке свежепере-гнанным метил-трет-бутиловым эфиром (4 х20 мл). Объединенные эфирные вытяжки отмывали на д е-лительной воронке дистиллированной водой (4 х20 мл), сушили над безводным сульф атом натрия и вакуумировали. Водный слой подкисляли расвором соляной кислоты до РН=2, затем экстрагировали МТБЭ. Эфирные вытяжки отмывали водой до не й-тральной реакции и вакуумировали досуха.
Кислоты переводили в метиловые эфиры при помощи диазометана, нейтральные компоненты исследовали без дериватизации. В экстракте шл я-покArmШaria cepistipes раздельно исследовали свободные и связанные кислоты. Для выделения св о-бодных кислот концентрат липофильных компонентов экстрагировали 2 %-ным водным раствором едкого натра. Отделенный в делительной воронке водный слой подкисляли расвором сол яной кислоты до РН=2, затем экстрагировали МТБЭ. Эфирные вытяжки отмывали водой до нейтральной реакции и вакуумировали досуха. Связанные кислоты и з-влекали из продуктов щелочного гидролиза анал о-гично суммарным кислотам экстракта ножек гриба. Соотношение свободные: связанные 1:14. Нейтральные составляющие извлекали аналогично Н е-омыляемому остатку экстракта ножек.
Исследование кислых фракций проводилось при помощи прибора Неш1ей-Раскап! О 1800 А с масс-селективным детектором НР 5971 и колонкой НР-5 МБ (30 т х 0,25 тт х 0,25 ^т). В качестве газа-носителя использовали гелий. Температура колонки повышалась со скоростью 4 °/мин от 50 ° до 300 °С и далее сохранялась в течение 30 мин. при 300 °С.
Нейтральные компоненты анализировали без обработки при тех же условиях анализа. Для анализа полипренолов в качестве аналитического приб ора использован жидкостный хроматограф Мил и-хром с УФ-детекцией при длине волны 210 нм; колонка 6,3*0,2 см, заполненная сорбентом ЫсЫ^огЪ ИР-18 (зерно 5 мкм); элюент - смесь метанола с ацетоном (1:3 по объему).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В составе кислой фракции из ножек грибов идентифицированы алифатические кислоты: пент а-
декановая, пальмитиновая, пальмитолеиновая, олеиновая, линолевая, линоленовая, стеариновая и тетракозановая. Более половины фракции составляет линолевая кислота.
Среди нейтральных компонентов основным я в-ляется эргостерин, обладающий активностью пр о-витамина Б. Кроме него, идентифицированы фун-гистерин, эргоста-7,22-диен-3Р-ол, (22Е)-эргоста-5,7,9(11),22-тетраен-3Р-ол и сквален. Около 10 % входящих компонентов не удалось однозна чно идентифицировать ввиду отсутствия в базе да нных соответствующих масс-спектров.
В экстракте шляпок связанные кислоты нах о-дятся в сырье в виде жиров и эфиров с эргостер ином и другими тритерпеновыми спиртами.
Среди свободных кислот преобладают пальм и-тиновая, пальмитолеиновая, стеариновая, олеин о-вая, линолевая, тетракозановая и 15-тетракозеновая кислоты. Кроме того, идентифицированы минорные компоненты: лауриновая, миристиновая, пентад е-кановая, дегидроабиетиновая, трикозановая, гекса-козановая, гексакозеновая, октакозановая, триако н-тановая кислоты. Около 5 % фракции составляют тритерпеновые кислоты, состав которых уточняе т-ся. Связанные кислоты представлены олеиновой, линолевой (50 % фракции), пальмитиновой, паль-митолеиноваой, стеариновой кислотами, в сумме составляющими более 90 %. Среди минорных ко м-понентов идентифицированы лауриновая, мирист и-новая, пентадекановая, арахиновая, дегидроабиет и-новая, тетракозановая, 15 -тетракозеновая, гексако-зеновая, гадолеиновая кислоты. Большинство минорных кислых компоне нтов, как свободных, так и связанных ранее в грибах не обнаруживались. Пр и-сутствует следовое количество фенолокислот.
В неомыляемом остатке экстракта шляпок идентифицированы эргостерин, фунгистерин, эрг о-ста-7,22-диен-3Р-ол, (22Е)-эргоста-5,7,9(11),22-тетраен-3Р-ол, ланостерин, неоэргостерин, эргоста-5,8-диен-3Р-ол, антраэргостатетраенол и сквален. Фракция содержит заметное количество эргона (э р-госта-4,6,8(14),22-тетраен-3-она), для которого, согласно литературным данным (Ьее, 2005), установлена цитотоксическая активность, а также до 5 % неустановленных ланостаноидов, масс -спектры которых отсутствуют в базе данных. Как в ножках, так и в шляпках плодовых тел гриба обнаружены при помощи ВЭЖХ полипренолы, состав и количественное содержание которых уточняется. Содержание полипренолов и долихолов в экстракте Ar-mШaria cepistipes существенно ниже, чем в Armil-laria mellea.
Гидрофильная фракция экстракта ножек гриба состоит преимущественно из эритритола, прим е-няемого в промышленности и фармакопее в качес т-ве низкокалорийного сахарозаменителя. В экстра к-те шляпок эритритол практически отсутс твует. При этом эритритол - спирт с общей формулой С4Н1004 является наиболее удобным сахароз аменителем ввиду чрезвычайно низкой калорийности. Если маннитол, сорбитол, ксилитол при слад ости от 45 до 90 % по сравнению с сахарозой имеют калори й-ность 300-400 ккал/100г, то эритритол, сладость
которого составляет 70 % от сладости сахарозы, имеет калорийность 20 ккал/100г. Это происходит из-за того, что всасывание эритритола происх одит по другому механизму, чем у сахаров и поли олов. В результате эритритол можно употреблять без риска ожирения и гипергликемии. Эритритол не вызывает угрозы кариеса, не обладает побочными действи ями, присущими другим полиолам: горьким привкусом, слабительным и мочегонным эффектом.
Одним из источников получения полиолов я в-ляются грибы, в которых обнаружены в значител ь-ных количествах маннитол и эритритол. При эк с-тракции этого вида сырья спиртами получают п о-лиолы в виде смеси. Использование в качестве эк с-трагента метил-трет-бутилового эфира позволяет выделить эритритол селективно. Из литературы известно о более высоком содержании сахароспи ртов и сахаров в ножках базидиомицетов. Экстракт ножек Armillaria метил-трет-бутиловым эфиром представляет собой светло-желтое масло, из которого при концентрировании выпадает кристаллич е-ский осадок. Перекристаллизация из метил-трет-бутилового эфира или фракционирование экстракта на липофильные и гидрофильные компоне нты при помощи гексана и воды приводит к выделению б е-лых кристаллов с температурой плавления 89-91° С, что совпадает с литературными данными для эри т-ритола. Чистота и строение выделенного соедин е-ния подтверждены спектрами ЯМР 1Н и 13С.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, среди кислых фракций экстрактов опенка серого Armillaria cepistipes идентифицированы 11 алифатических кислот, ранее не обнар уженных в Armillaria mellea.
Нейтральные компоненты неомыляемого о с-татка содержат, согласно данным ХМС, помимо известных ранее, 9 трите рпеновых соединений, в том числе эргон (эргоста-4,6,8(14),22-тетраен-3-он), проявляющий цитотоксическую активность.
Полученные данные свидетельствуют о разл и-чиях в химическом составе опенка осеннего ( Armil-laria mellea) и опенка серого (Armillaria cepistipes) и могут служить дополнительным критерием при систематике видов Armillaria.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Кукина, Т.П. Полипренолы некоторых гомобазидиальных грибов (HOMOBASIDIOMYCETIDAE) / Т.П. Кукина, И.А. Горбунова, И.И. Баяндина // Химия растительного сырья. - 2007. - № 3. - С. 33-38.
Павлов, И.Н. Морфологические признаки грибов комплекса Armillaria mellea sensu lato в Циркумбореаль-ной области / И.Н. Павлов, А.Г. Миронов, Н.П. Ку-тафьева // Хвойные бореальной зоны. - 2006. - № 3 . -С. 14-21.
Ayer, W.A. Metabolites of the honey mushroom, Armillaria mellea / W.A. Ayer, J.B. Macaulay // Can. J. Chem. -1987.- Vol. 65.- N 1.- P. 7-14.
Birkinshaw, J. H. Biochemistry of the wood-rotting fungi 5. The production of d-threitol (l-erythritol) by Armillaria mellea (Vahl) Quelet / J. H. Birkinshaw, C. E. Stickings, P. Tessier // Biochem J. - 1948. - Vol. 42. - N 3. - P.329-332.
Ebrahimzadeh, H. Isolation and Characterization of Six Highly Intrinsic Fluorescent Metabolites in Armillaria mellea (Vahl. Ex. Fr.) Karst / H. Ebrahimzadeh, G.R. Haddadchi // Journal of sciences. Islamic republic of Iran. - 1995. - Vol.6. - N 2. - P.67-79.
Guo, W.J. Steroids from Armillaria mellea / W.J.Guo, S.X. Guo // Химия природн. соедин. - 2008. - № 3. -С.322.
Guo, W.J. Triterpenes and steroids from Armillaria mellea Vahl. ex Fr./ W.J.Guo et al // Biochemical Systematic and Ecology - 2007. - Vol. 135. - №11. - P. 790-793.
Lee, W.Y. Cytotoxic Activity of Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one from the Sclerotia of Polyporus umbellatus
/ W.Y. Lee and other // Bull. Korean Chem. Soc. - 2005. - Vol. 26. - N 9. - P. 1464-1466.
Obuchi, T. Armillaric acid, a new antibiotic produced by Armillaria mellea / T. Obuchi et al // Planta Med. -1990. - Vol. 56. - №2. - P. 198-201.
Yang, J.S. Chemical constituents of Armillaria mellea mycelium. VII. Isolation and characterization of chemical constituents of the acetone extract / J.S.Yang et al // Yao Xue Xue Bao. - 1991. - Vol. 26. - №2. - P. 117-122.
Yilmaz, N. Fatty acid composition in some wild edible mus h-rooms growing in the middle Black Sea region of Turkey / N. Yilmaz et al // Food Chemistry. - 2006. - Vol. 99. -№1.- P. 168-174.
Поступила в редакцию 26 января 2009 г. Принята к печати 13 марта 2009 г.
