CC BY
17
А.Н. Худя ков1, О.О. Зайцева1, Т.В. Полежаева1, Д.С. Лаптев1, А.А. Костя ев2
Хемилюминесцентный метод определения влияния криоконсервантов на лейкоциты крови
1 ФГБУН Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар
2 ФГБУН Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России, г. Киров
A.N. Khudyakov1, О.О. Zaitseva1, T.V. Polezhaeva1, D.S. Laptev1, A.A. Kostyaev2
Studying effects of cryoprotectants on peripheral blood leukocytes using chemiluminescence assay
1 Institute of Physiology, Komi Science Centre, the Urals Branch of the Russian Academy of Sciences (Syktyvkar)
2 Kirov Haematology and Blood Transfusion Research Institute, Kirov
Криоконсервирование в настоящее время является общепризнанной возможностью длительного хранения различных биологических объектов в жизнеспособном состоянии. Современные технологии криоконсервирова-ния органов и тканей невозможны без использования криоконсервантов, нивелирующих повреждающее действие отрицательных температур. В качестве компонентов крио-защитных растворов активно используются протекторы экзо- и эндоцеллюлярного действия, мембранопротекторы, антиоксиданты и антигипоксанты. В последние годы широкое распространение получила практика использования комбинированных хладоограж-дающих растворов [5], которые содержат в своем составе два протектора или более, а также вспомогательные вещества.
Согласно данным литературы [6], в присутствии ряда протекторов отмечает -ся увеличение интенсивности перекисного окисления липидов ПОЛ, которое зависит от вида вещества, его концентрации и времени экспозиции в нем замораживаемых клеток. Охлаждение-отогрев оказывают дополнительное влияние на повышение интенсивности ПОЛ. Это, в свою очередь, приводит к изменению состояния липидного бислоя клеточных мембран и нарушению структурных и функциональных систем клетки: ионных насосов, мембранных ферментов и т.д. Следовательно, при подборе ингредиентов сложных консервантов необходимо учитывать их воздействие на уровень ПОЛ клеток. В связи с этим целью данной работы стало определение динамики интенсивности про-
цессов ПОЛ у лейкоцитов под влиянием ингредиентов новых криоконсервантов.
Материалы и методы
В работе использованы лейкоцит -ные концентраты (*=21) из цельной крови доноров-добровольцев. Клетки смешивали (1:1) с одним из исследуемых веществ или их комбинаций в пластиковой пробирке и выдерживали при комнатной температуре в зависимости от вида вещества 1 мин (с крио-протекторами эндоцеллюлярного действия: глицерином (7%), диметилсульфоксидом (ДМСО, 8%), пропандиолом (ПД, 21%); с дополнительными компонентами — антиги-поксантом и антиоксидантом сукцинатом ги-дроксиметилэтилпиридина (ОМЭПС; 0,15%, 0,3%) и антигипоксантом фумаратом натрия (2.8%)) или 20 мин (с криопротекто-ром смешанного действия гексаметиленбис-тетрагидроксиэтилмочевиной (ГМБТОЭМ; 30%), с протекторами экзоцеллюлярного действия: желатином с молекулярным весом 20000 (7,5%), гидроксиэтилкрахмалом (ГЭК; 5,7%), с комбинированными растворами: глицерин (7%) + желатин (7,5%) + ОМЭПС (0,3%); ГМБТОЭМ (28%) + ОМЭПС (0,15%); ГМБТОЭМ (30%) + фу-марат натрия (2,8%)).
После этого на биохемилюминоме-тре БХЛ-07 (ЦНИЛ НГМА; «ИМБИО», Н. Новгород, Россия) регистрировали: (мВ) максимальную интенсивность быстрой вспышки, которая отражает потенциальную способность биологического объекта к свободнорадикальному окислению; • (мВхсек) — светосумму за 30 сек. — площадь под кривой свечения пробы отражает содержание радикалов RO2, соответствующих обрыву цепи СРО, показатель дает возможность оценить ПОЛ и антиоксидантную активность (АОА); антиоксидантный потенциал пробы коррелирует с показателем •• (—2а) — тангенс угла наклона кривой оси времени (характеризует максимальную крутизну спада кривой со знаком «—»); с коэффициентом а (•/*...х*) — безразмерный параметр, характеризует полную относительную интенсивность излучения за время измерения; с коэффициентом • (*/*...) — нормированная светосумма за время изме-
рения. Чем выше показатель **(—2а), тем выше АОА в исследуемой пробе, и наоборот: чем выше а и • , тем ниже АОА.
В измерительную кювету прибора вносили 0,1 мл лейкоцитного концентрата и 0,4 мл фосфатного буфера (рН = 7,5), добавляли 0,4 мл 0,01 мМ раствора сульфата железа (ОАО «Спектр-Хим», г. Москва) и помещали в измерительное гнездо. Затем в кювету быстро вносили 0,2 мл 2% раствора перекиси водорода (ЗАО «СП Химпром», г. Самара) и регистрировали сигнал ХЛ в течение 30 сек.
При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение ± среднее квадратичное отклонение (• ±5). Для выявления статистической значимости различий между группами применяли непараметрический критерий Уилкоксона [3] с использованием компьютерной программы для медико-биологической статистики «ВЮБТАТ».
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что при смешивании лейкоцитов с любым исследуемым веществом (исключение — фумарат натрия) отмечает -ся совместное изменение показателей ПОЛ и АОА, причем последнего, как правило, в большей степени (табл. 1).
При использовании ДМСО, согласно значениям • , — (—2а), у лейкоцитов снижаются уровни ПОЛ и АОА примерно в 1,2 и 1,3 раза соответственно. Это свидетельствует о наличии у ДМСО псевдотоксического эффекта [2], который приводит к подавлению метаболической активности клеток. Данный эффект полностью устраняется при удалении протектора из клетки.
Глицерин и ГМБТОЭМ не только ускоряют ПОЛ, но и оказывают выраженное стимулирующее влияние на антиоксидантные системы клетки. В меньшей степени данный эффект характерен для ГЭК и желатина.
Антиоксидант и противогипоксант ОМЭПС в концентрациях 0,15% и 0,3% снижает и повышает интенсивность ПОЛ соответственно. Однако при всех используемых концентрациях наблюдается снижение АОА клеток, тогда как, согласно дан-
Влияние ингредиентов криоконсервирующих растворов на уровень ПОЛ и антиоксидантный потенциал ядросодержащих клеток крови (п=7, М±а)
Исследуемый субстрат Показатели хемилюминограммы
.. • ••(-2а) а Z
Лейкоцитный концентрат (ЛК) 115,0 ± 26,6 843,8 ± 142,9 26,2 ± 5,54 0,25 ± 0,02 7,5 ± 0,5
+ ПД 21% 90,0 ± 4,2* 675,2 ± 18,5* 18,2 ± 0,6* 0,27 ± 0,01* 8,0 ± 0,2*
+ ДМСО 8% 98,9 ± 14,1 672,2 ± 137,2* 18,1 ± 2,3* 0,23 ± 0,02 7,0 ± 0,5
+ глицерин 7% 188,8 ± 66,4* 1048,0 ± 162,1* 49,2 ± 16,6* 0,19 ± 0,03* 5,8 ± 0,9*
+ фумарат натрия 2,8% 110,5 ± 38,9 961,2 ± 284,7 21,6 ± 9,1 0,26 ± 0,02 7,8 ± 0,5
+ ОМЭПС 0,15% 80,5 ± 10,8* 675,2 ± 88,2* 20,9 ± 3,2* 0,26 ± 0,04 7,6 ± 0,6
+ ОМЭПС 0,3% 121,0 ± 7,8 1012,0 ± 140,7* 18,6 ± 3,5* 0,27 ± 0,03 8,1 ± 0,9
+ ГМБТОЭМ 30% 180,2 ± 13,6* 1165,0 ± 162,1* 44,2 ± 4,5* 0,22 ± 0,02* 6,5 ± 0,5*
+ желатин 7,5% 215,0 ± 14,5* 1680,0 ± 164,2* 38,5 ± 2,0* 0,26 ± 0,01 7,8 ± 0,4
+ ГЭК 5,7% 166,2 ± 17,4* 1127,0 ± 76,1* 39,4 ± 4,2* 0,23 ± 0,01* 6,8 ± 0,4*
Примечание: * — различие с величиной показателя ЛК статистически значимо (• < 0,05).
ным литературы [1; 4], в условиях целого организма это вещество проявляет анти-оксидантное действие. Оно заключается в способности ОМЭПС ингибировать стадию инициации ПОЛ, обусловленную образованием активированных кислородных метаболитов, появлением каталитически активных ионов железа и падением активности эндогенной системы ингибиторов свободно-радикального окисления. В наших исследованиях при непосредственном влиянии ОМЭПС на ядерную клетку описанное действие мы выявили только для концентрации 0,15%. Снижение же АОА лейкоцитов, вероятно, связано со способностью данного вещества блокировать собственные антиок-сидантные системы клетки.
При совместном воздействии компонентов комбинированного криоконсерванта характер влияния на ПОЛ и АОА изменяется. Например, при воздействии смеси глицерин (7%) + желатин (7,5%) + ОМЭПС (0,3%) уровни ПОЛ и АОА лейкоцитов до их замораживания, согласно значениям • , ••(—2а), снижаются в 1,2 и 1,8 раза, что свидетельствует о замедлении метаболической активности клеток перед замораживанием (табл. 2).
При совместном использовании ГМБТОЭМ (28%) и ОМЭПС (0,15%) уровень ПОЛ лейкоцитов не изменяется, а АОА повышается в 1,4 раза (табл. 3).
Следовательно, если используемые в составе сложных криоконсервирующих рас-
Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (п=8, М±а), подвергнутых воздействию комбинированного криоконсерванта, содержащего глицерин (7%), желатин (7,5%) и ОМЭПС (0,3%)
Исследуемый субстрат Показатели
• ••(—2а) а •
Лейкоцитный концентрат (ЛК) 118,2 ± 10,8 773,2 ± 14,0 28,9 ± 3,9 0,22 ± 0,02 6,6 ± 0,5
+ криоконсервант 95,4 ± 2,2* 639,8 ± 7,1* 16,2 ± 0,1* 0,29 ± 0,004* 8,8 ± 0,1*
Примечание: * — различие с величиной показателя ЛК статистически значимо (• < 0,05).
Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (п=8, М±а), подвергнутых воздействию комбинированного криоконсерванта, содержащего ГМБТОЭМ (28%) и ОМЭПС (0,15
%)
Исследуемый субстрат Показатели
*. .. • ••(—2а) а •
Лейкоцитный концентрат (ЛК) 117,7 ± 20,3 899,3 ± 181,5 23,4 ± 2,2 0,25 ± 0,01 7,6 ± 0,2
+ криоконсервант 139,0 ± 30,6 939,7 ± 150,3 32,9 ± 7,0* 0,22 ± 0,01* 6,6 ± 0,4*
Примечание: * — различие с величиной показателя ЛК статистически значимо (• < 0,05).
творов ингредиенты и снижают устойчивость мембран лейкоцитов к ПОЛ, то при их совместном воздействии данный эффект нивелируется, что объясняется наличием механизмов выравнивания ПОЛ и АОА.
Выводы
1. ДМСО в исходной концентрации 8% снижает интенсивность ПОЛ на мембранах лейкоцитов и их АОА, проявляя тем самым псевдотоксический эффект.
2. Присутствие в клеточной среде глицерина (7%), ГМБТОЭМ (30%), ГЭК (5,7%), желатина (7,5%), ОМЭПС (0,3%) приводит к снижению устойчивости мембран лейкоцитов к перекисному окислению.
3. Обозначена группа протекторов, не только ускоряющих процессы липопероксида-ции, но и оказывающих стимулирующее действие на антиоксидантные системы клетки: глицерин, ГМБТОЭМ, в меньшей степени — ГЭК и желатин.
4. ОМЭПС в концентрации 0,15% проявляет свойство антиоксиданта.
5. Комбинации протекторов и стабилизирующих веществ в используемых концентрациях: глицерин + желатин + ОМЭПС, а также ГМБТОЭМ с ОМЭПС или фу-маратом натрия не вызывают активации ПОЛ у лейкоцитов.
Литература
1. Барабой В. А. Механизмы стресса и пе-рекисное окисление липидов / / Успехи
современной биологии. 1991. Т. 111. Вып. 6. С. 21-28.
2. Белоус А. М., Грищенко В. И. Криобиология. Киев: Наукова думка, 1994.
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998.
4. Клебанов Г.И., Любицкий О.Б., Васильева О.В. и др. Антиоксидантные свойства производных 3-оксипиридина: мексидо-ла, эмоксипина и проксипина // Вопросы медицинской химии. 2001. Т. 47. № 3. С. 288-300.
5. Корниенко Е.М., Бондаренко В. А. Перспективность использования комбинированных криопротекторов при замораживании компонентов крови одноступенчатым способом при температуре -196С // Проблемы криобиологии. 2008. Т. 18. № 2. С. 248.
6. Онищенко Е.В., Зинченко А.В. Исследование влияния некоторых проникающих криопротекторов на микросомы методом хемилюминесценции // Проблемы криобиологии. 2005. Т. 15. № 1. С. 50-55.
Контакты:
Худяков Андрей Николаевич,
Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН,
научный сотрудник,
кандидат биологических наук.
Тел.: 8-961-563-55-52.
E-mail: ddic@yandex.ru
