CC BY
38
А.Н. Худя ков, О.О. Зайцева, Т.В. Полежаева, Д.С. Лаптев, А.А. Костя ев*
Оценка интенсивности перекисного окисления липидов ядросодержащих клеток крови под влиянием компонентов криоконсервантов хемилюминесцентным методом
ФГБУН «Институт физиологии Коми научного центра» Уральского отделения Российской академии наук, г. Сыктывкар * ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России», г. Киров
A.N. Khudyakov, O.O. Zaitseva, T.V. Polejaeva, D.S. Laptev, A.A. Kostyaev*
Intensity of lipid peroxidationin in nucleated blood cells treated with cryoprotectants and assessed by chemiluminescence method
Physiology institute at the scientific center affiliated to the Ural branch of the Russian Academy of Sciences (Syktyvkar) * Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion (Kirov)
Ключевые слова: лейкоциты, криопротекторы, Keywords: leukocytes, cryoprotectants, cryopre-
криоконсерванты, перекисное окисление липи- servatives, lipid peroxidation, antioxidant activity.
дов, антиоксидантная активность.
Изучено влияние криопротекторов экзо-, эндо-целлюлярного и смешанного действия, а также стабилизирующих веществ на перекисное окисление липидов (ПОЛ) и антиоксидантную активность (АОА) лейкоцитов методом хемилю-минесценции. Показано, что при воздействии вещества на клетку наблюдается совместное изменение показателей ПОЛ и АОА. Используемые криозащитные растворы не вызывают активации ПОЛ у нативных лейкоцитов.
Chemiluminescence method was used to investigate the effects of different cryoprotectives and adjuvants on lipid peroxidation (LPO) and antioxidant activity (AOA) in leukocytes. It was shown that in a cell, both indexes LPO and AOA are changed being influenced by the substance. Cryoprotectant solutions do not activate LPO and AOA in native leukocytes.
Криоконсервирование в настоящее время является общепризнанной возможностью длительного хранения различных биологических объектов в жизнеспособном состоянии. Современные технологии крио-консервирования органов и тканей невозможны без использования криоконсервантов, нивелирующих повреждающее действие отрицательных температур. В качестве компонентов криозащитных растворов активно используются протекторы экзо- и эндоцеллюлярного действия, мембранопро-текторы, антиоксиданты и антигипоксан-ты. В последние годы широкое распростра-
нение получила практика использования комбинированных хладоограждающих растворов [5], которые содержат в своем составе два или более протекторов, а также вспомогательные вещества.
Согласно данным литературы [6], в присутствии ряда протекторов отмечается увеличение интенсивности ПОЛ, которое зависит от вида вещества, его концентрации и времени экспозиции в нем замораживаемых клеток. Охлаждение-отогрев оказывают дополнительное влияние на повышение интенсивности процессов липопе-роксидации. Это в свою очередь приводит
к изменению состояния липидного бислоя клеточных мембран и нарушению структурных и функциональных систем клетки: ионных насосов, мембранных ферментов и т.д. Следовательно, при подборе ингредиентов сложных консервантов необходимо учитывать их воздействие на уровень ПОЛ клеток.
В связи с этим целью данной работы стало определение динамики интенсивности процессов ПОЛ у лейкоцитов под влиянием ингредиентов новых криоконсервантов.
Материалы и методы
В работе использованы лейкоцит-ные концентраты (п=21) из цельной крови доноров-добровольцев. Клетки смешивали (1:1) с одним из исследуемых веществ или их комбинаций в пластиковой пробирке и выдерживали при комнатной температуре в зависимости от вида вещества 1 мин (с кри-опротекторами эндоцеллюлярного действия: глицерином (7 %), диметилсульфоксидом (ДМСО, 8%), пропандиолом (ПД, 21%); с дополнительными компонентами — антиги-поксантом и антиоксидантом сукцинатом ги-дроксиметилэтилпиридина (ОМЭПС; 0,15%, 0,3%) и антигипоксантом фумаратом натрия (2,8%)) или 20 мин (с криопротекто-ром смешанного действия гексаметиленби-стетрагидроксиэтилмочевиной (ГМБТОЭМ; 30%), с протекторами экзоцеллюлярного действия: желатином с молекулярным весом 20 000 (7,5%), гидроксиэтилкрахмалом (ГЭК; 5,7%), с комбинированными растворами: глицерин (7%) + желатин (7,5%) + ОМЭПС (0,3%); ГМБТОЭМ (28%) + ОМЭПС (0,15%); ГМБТОЭМ (30%) + фу-марат натрия (2,8%)).
После этого на биохемилюминоме-тре БХЛ-07 (ЦНИЛ НГМА; «ИМБИО», Н. Новгород, Россия) регистрировали: 1тах (мВ) — максимальную интенсивность быстрой вспышки, отражает потенциальную способность биологического объекта к свободнорадикальному окислению; 5 (мВхсек) — светосумму за 30 сек — площадь под кривой свечения пробы отражает содержание радикалов И02, соответствующих обрыву цепи СРО, показатель дает возможность оценить систему ПОЛ — АОА;
антиоксидантный потенциал пробы коррелирует с показателем (—2а) — тангенс угла наклона кривой оси времени (характеризует максимальную крутизну спада кривой, со знаком «—»); с коэффициентом а (5Дтахх/) — безразмерный параметр, характеризует полную относительную интенсивность излучения за время измерения; с коэффициентом Z (5/1 ) — нормированная светосумма за время измерения. Чем выше показатель (—2а), тем выше АОА в исследуемой пробе, и наоборот: чем выше а и Z, тем ниже АОА.
В измерительную кювету прибора вносили 0,1 мл лейкоцитного концентрата и 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), добавляли 0,4 мл 0,01 мМ раствора сульфата железа (ОАО «Спектр-Хим», г. Москва) и помещали в измерительное гнездо. Затем в кювету быстро вносили 0,2 мл 2% раствора перекиси водорода (ЗАО «СП Химпром», г. Самара) и регистрировали сигнал хемилюминесцен-ция (ХЛ) в течение 30 сек.
При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение ± среднее квадратичное отклонение (М±5). Для выявления статистической значимости различий между группами применяли непараметрический критерий Уилкоксона [3] с использованием компьютерной программы для медико-биологической статистики «ВЮБТАТ».
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что при смешивании лейкоцитов с любым исследуемым веществом (исключение — фумарат натрия) отмечается совместное изменение показателей ПОЛ и АОА, причем последнего, как правило, в большей степени (табл. 1).
При использовании ДМСО, согласно значениям 5, /§"(—2а), у лейкоцитов снижаются уровни ПОЛ и АОА соответственно примерно в 1,2 и 1,3 раза. Это говорит о наличии у ДМСО псевдотоксического эффекта [1], который приводит к подавлению метаболической активности клеток. Данный эффект полностью устраняется при удалении протектора из клетки.
Оценка интенсивности перекисного окисления липидов ядросодержащих клеток крови под влиянием компонентов криоконсервантов хемилюминесцентным методом
Таблица 1 Влияние ингредиентов криоконсервирующих растворов на уровень ПОЛ и антиоксидантный потенциал ядросодержащих клеток крови (п=7, М±а)
Исследуемый субстрат Показатели хемилюминограммы
I max S tg(-2 а) а Z
Лейкоцитный концентрат (ЛК) 115,0±26,6 843,8±142,9 26,2±5,54 0,25±0,02 7,5±0,5
+ ПД 21% 90,0±4,2* 675,2±18,5* 18,2±0,6* 0,27±0,01* 8,0±0,2*
+ ДМСО8% 98,9±14,1 672,2±137,2* 18,1±2,3* 0,23±0,02 7,0±0,5
+ глицерин 7% 188,8±66,4* 1048,0±162,1* 49,2±16,6* 0,19±0,03* 5,8±0,9*
+ фумарат натрия 2,8% 110,5±38,9 961,2±284,7 21,6±9,1 0,26±0,02 7,8±0,5
+ ОМЭПС 0,15% 80,5±10,8 * 675,2±88,2 * 20,9±3,2* 0,26±0,04 7,6±0,6
+ ОМЭПС 0,3% 121,0±7,8 1012,0±140,7* 18,6±3,5* 0,27±0,03 8,1±0,9
+ ГМБТОЭМ 30% 180,2±13,6* 1165,0±162,1* 44,2±4,5* 0,22±0,02* 6,5±0,5*
+ желатин 7,5% 215,0±14,5* 1680,0±164,2* 38,5±2,0* 0,26±0,01 7,8±0,4
+ ГЭК 5,7% 166,2±17,4* 1127,0±76,1* 39,4±4,2* 0,23±0,01* 6,8±0,4*
Примечание: * — различие с величиной показателя лейкоцитного концентрата статистически значимо (р<0,05).
Глицерин и ГМБТОЭМ не только ускоряют процессы липопероксидации, но и оказывают выраженное стимулирующее влияние на антиоксидантные системы клетки. В меньшей степени данный эффект характерен для ГЭК и желатина.
Антиоксидант и противогипоксант ОМЭПС в концентрации 0,15% снижает интенсивность ПОЛ, а в концентрации 0,3% повышает ее. Однако при всех используемых концентрациях наблюдается снижение АОА клеток, тогда как, согласно данным литературы [2; 4], в условиях целого организма данное вещество проявляет антиок-сидантное действие. Оно заключается в способности ОМЭПС ингибировать стадию инициации ПОЛ, обусловленную образованием активированных кислородных метаболитов, появлением каталитически активных ионов железа и падением активности эндогенной системы ингибиторов свободнорадикального окисления. В наших исследованиях при непосредственном влиянии ОМЭПС на ядерную клетку описанное выше действие мы
выявили только для концентрации 0,15%. Снижение же АОА лейкоцитов, вероятно, связано со способностью данного вещества блокировать собственные антиоксидантные системы клетки.
При совместном воздействии компонентов комбинированного криоконсерванта характер влияния на ПОЛ и АОА изменяется (табл. 2). Например, при воздействии смеси глицерин (7%) + желатин (7,5%) + ОМЭПС (0,3%) уровни ПОЛ и АОА лейкоцитов до их замораживания согласно значениям £, /^(—2а) снижаются в 1,2 и 1,8 раза, что свидетельствует о замедлении метаболической активности клеток перед замораживанием.
При совместном использовании ГМБТОЭМ (28%) и ОМЭПС (0,15%) уровень ПОЛ лейкоцитов не изменяется, а АОА повышается в 1,4 раза (табл. 3).
Следовательно, если используемые в составе сложных криоконсервирующих растворов ингредиенты и снижают устойчивость мембран лейкоцитов к ПОЛ, то при
Таблица 2 Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (п=8, М±а), подвергнутых воздействию комбинированного криоконсерванта, содержащего глицерин (7%), желатин (7,5%) и ОМЭПС (0,3%)
Исследуемый субстрат Показатели
I max S tg(-2a) а Z
Лейкоцитный концентрат (ЛК) 118,2±10,8 773,2±14,0 28,9±3,9 0,22±0,02 6,6±0,5
+ криоконсервант 95,4±2,2* 639,8±7,1* 16,2±0,1* 0,29±0,004* 8,8±0,1*
Примечание: * — различие с величиной показателя ЛК статистически значимо (р<0,05).
Таблица 3 Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (п=6, М±а), подвергнутых воздействию комбинированного криоконсерванта, содержащего ГМБТОЭМ (28%) и ОМЭПС (0,15%)
Исследуемый субстрат Показатели
I max S tg(-2a) a Z
Лейкоцитный концентрат (ЛК) 117,7±20,3 899,3±181,5 23,4±2,2 0,25±0,01 7,6±0,2
+ криоконсервант 139,0±30,6 939,7±150,3 32,9±7,0* 0,22±0,01* 6,6±0,4*
Примечание: * — различие с величиной показателя ЛК статистически значимо (р<0,05).
их совместном воздействии данный эффект
нивелируется, что объясняется наличием
механизмов выравнивания ПОЛ и АОА.
Выводы
1. ДМСО в исходной концентрации 8% снижает интенсивность ПОЛ на мембранах лейкоцитов и их АОА, проявляя тем самым псевдотоксический эффект.
2. Присутствие в клеточной среде глицерина (7%), ГМБТОЭМ (30%), ГЭК (5,7%), желатина (7,5%), ОМЭПС (0,3%) приводит к снижению устойчивости мембран лейкоцитов к перекисно-му окислению.
3. Обозначена группа протекторов, не только ускоряющих процессы липопе-роксидации, но и оказывающих стимулирующее действие на антиоксидантные системы клетки: глицерин, ГМБТОЭМ, в меньшей степени — ГЭК и желатин.
4. ОМЭПС в концентрации 0,15% проявляет свойство антиоксиданта.
5. Комбинации протекторов и стабилизирующих веществ в используемых концентрациях (глицерин + желатин + ОМЭПС, а также ГМБТОЭМ с ОМЭПС или фумаратом натрия) не вызывают активации ПОЛ у лейкоцитов.
Литература
1. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология. Киев: Наукова думка, 1994.
2. Барабой В. А. Механизмы стресса и пе-рекисное окисление липидов / / Успехи современной биологии. 1991. Т. 111. Вып. 6. С. 21-28.
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998.
4. Клебанов Г. И., Любицкий О. Б., Васильева О.В. и др. Антиоксидантные свойства производных 3-оксипириди-на: мексидола, эмоксипина и проксипи-на // Вопросы медицинской химии. 2001. Т. 47. № 3. С. 288-300.
5. Корниенко Е.М., Бондаренко В. А. Перспективность использования комби -нированных криопротекторов при замораживании компонентов крови одноступенчатым способом при температуре —196С // Проблемы криобиологии. 2008. Т. 18. № 2. С. 248.
6. Онищенко Е.В., Зинченко А. В. Исследование влияния некоторых проникающих криопротекторов на микросомы методом хемилюминесценции // Проблемы криобиологии. 2005. Т. 15. № 1. С. 50—55.
Контакты:
Худяков Андрей Николаевич,
Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН,
научный сотрудник,
кандидат биологических наук.
Тел.: 8-961-563-55-52.
E-mail: ddic@yandex.ru
Оценка интенсивности перекисного окисления липидов ядросодержащих клеток крови под влиянием компонентов криоконсервантов хемилюминесцентным методом
