CC BY
66
УДК 577.112.5
Hct-A — новое семейство актинопоринов актинии Heteractis crispa
Е. В. Лейченко*, М. М. Монастырная, Е. А. Зелепуга, Е. С. Ткачева, М. П. Исаева, Г. Н. Лихацкая, С. Д. Анастюк, Э. П. Козловская
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022, Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159 *E-mail: 969844@gmail.com Поступила в редакцию 25.09.2014
реферат Из тропической актинии Heteractis crispa комбинацией методов жидкостной хроматографии выделено несколько новых изоформ актинопоринов с молекулярными массами от 18995.5 до 19398.7 Да, обладающих высокой гемолитической активностью. Показано, что в водных растворах актинопорины существуют в виде моно-, ди- и тримеров. Установлены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих актинопорины, получены аминокислотные последовательности новых полипептидов, принадлежащих к семейству Hct-A актинопоринов. Новые актинопорины различаются величиной изоэлектрической точки, количеством и локализацией заряженных аминокислотных остатков в функционально значимом N-концевом фрагменте молекулы, а также зарядом тетрапептида (74-77 а.о.), который принимает участие в электростатическом взаимодействии с цитоплазматической мембраной. Получен рекомбинантный актинопорин rHct-A2 с молекулярной массой 19141 Да, pI 9.64 и величиной гемолитической активности 4.0 х 104 ГЕ/мг. Показано, что проводимость ионных каналов, формируемых rHct-A2 в БЛМ, аналогична проводимости нативного актинопорина из H. crispa. Полученные данные расширяют знания о структурно-функциональных взаимосвязях актинопоринов и вносят вклад в понимание механизма функционирования этих молекул, что является основой для создания соединений с высоким биомедицинским потенциалом. В настоящее время их рассматривают как модели для получения противоопухолевых, антибактериальных и кардиостимулирующих агентов.
ключевые слова актиния; актинопорины; гемолитическая активность; проводимость липидных мембран; структурно-функциональный анализ.
список сокращений ПФТ - пороформирующие токсины; БЛМ - бислойные липидные мембраны; а.о. - аминокислотный остаток (при числе); GST - глутатион^-трансфераза; ИПТГ - изопропил-Р-О-1-тиогалактопиранозид.
введение
Причина пристального внимания исследователей к актиниям, морским кишечнополостным, - продуцируемые ими яды, которые представляют собой сложные смеси биологически активных соединений белковой природы. Для дальнейшего использования в качестве фармакологических агентов наибольший интерес представляют нейро-токсины (модуляторы ионных каналов Nav, ASICs и Kv), различные по структуре и механизму действия ингибиторы протеиназ и актинопорины, принадлежащие к семейству а-пороформирующих токсинов (а-ПФТ) [1-3]. Актинопорины обладают уникальной пространственной структурой, что позволяет им существовать как в водорастворимом, так и в мембраносвязанном состоянии и обуслов-
ливает их способность связываться с мембранами, содержащими сфингомиелин, и формировать в них ионные каналы или поры [4]. С пороформирующей активностью связывают широкий спектр проявляемого этими полипептидами фармакологического действия: противоопухолевого, антипаразитарного, дерматонекротического и кардиостимулиру-ющего [5-7]. Установлено, что актинопорин EqtlI из Actinia equina в концентрации 0.1-1 нМ оказывает кардиотоксический эффект, а при более высоких концентрациях стимулирует агрегацию тромбоцитов [8]. Показано, что в небольших концентрациях (~10-9 М) тенеброзины (актинопорины из Actinia tenebrosa) также действуют как кардиостимуляторы [9]. Обнаружено, что актинопорины EqtlI и Bc2 из Bunodosoma caissarum [10] являют-
ся эффективными противоопухолевыми агентами, действующими на фибросаркому и глиобластому
[11]. Недавно на клетках HeLa, THP-1, MDA-MB-231 и SNU-C4 нами было показано, что актинопорин RTX-A из Heteractis crispa в нетоксичных концентрациях проявляет противоопухолевое действие, а также подавляет опухолевую трансформацию эпителиальных клеток мыши JB6P+C141, стимулированную эпидермальным фактором роста [7]. Установлено, что это действие обусловлено индукцией р53-независимого апоптоза и ингибировани-ем активности онкогенных ядерных факторов AP-1 и NF-kB.
В последние годы а-пороформирующие токсины актиний используют для создания фармакологических препаратов, представляющих собой иммуно-конъюгаты актинопоринов с лигандами: монокло-нальными антителами, гормонами или факторами роста, действие которых направлено на цитоплаз-матические мембраны опухолевых и/или паразитарных клеток [6]. В связи с этим актуальным представляется исследование молекулярных основ фармакологических эффектов актинопоринов.
Данная работа является продолжением структурно-функциональных исследований актинопоринов, она посвящена выделению актинопоринов из актинии H. crispa, установлению нуклеотидных последовательностей кодирующих их генов, получению рекомбинантных аналогов и изучению некоторых аспектов механизма взаимодействия актинопоринов с биологическими мишенями.
экспериментальная часть
В работе использовали реактивы следующих фирм: Reanal, Венгрия; Whatman, Англия; ICN Biochemicals, Sigma, Invitrogen, Thermo Scientific, США; Fermentas, Литва; Merk, Германия; «Криохром», «Сибэнзим», «Хеликон», «Евроген», Россия.
Биологический материал
Актинии H. crispa были собраны на литорали ЮжноКитайского моря во время научной экспедиции на НИС «Академик Опарин» в 2007 г. Видовая принадлежность актиний была определена Е.Е. Костиной (ИБМ ДВО РАН, г. Владивосток). Образцы актиний были заморожены и хранились при -20°C.
Выделение и очистка полипептидов
Приготовление водного экстракта, осаждение суммарных фракций водорастворимых белков ацетоном (63%) осуществляли по методике, описанной ранее
[12]. Все операции проводили при +4°C. Ионообменную хроматографию полипептидов проводили на колонке (2.6 х 50 см) с целлюлозой КМ-32,
уравновешенной 0.01 М аммоний-ацетатным буферным раствором, pH 6.0, в линейном градиенте концентрации NaCl (0-0.5 М, общий объем 2 л) в рабочем буферном растворе. Скорость элюции составляла 20 мл/ч, объем фракций - 5 мл.
Гель-фильтрацию полипептидов проводили на колонке Superdex Peptide 10/30, уравновешенной 0.1 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6.0, на высокоэффективном хроматографе среднего давления FPLC (AKTAsistem Pharmacia, Швеция). Элюцию проводили со скоростью 3 мл/мин. Объем фракций составил 1.5 мл.
ВЭЖХ полипептидов осуществляли на колонке с обращенной фазой сорбента Nucleosil C18 (4.6 х 250 мм), уравновешенной 10% ацетонитри-лом в 0.1% трифторуксусной кислоте, на хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, США). Элюирование проводили в градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 90% в 0.1% трифторуксусной кислоте при pH 2.2 в течение 60 мин. Скорость элю-ции - 0.5 мл/мин. Для упаривания ацетонитрила использовали вакуумный концентратор concentrator 5301 (Eppendorf, Германия).
Концентрацию белка определяли по методу Лоури [13], в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.
Клонирование генов актинопоринов
кДНК синтезировали на основе суммарной мРНК, выделенной из щупалец актинии H. crispa [14]. Нуклеотидные последовательности, кодирующие зрелые актинопорины, были амплифи-цированы с помощью ген-специфичных прай-меров 5'-TCGTTACc/aATGATA-3' (hct_sign) и 5'-GATTCTCTATTTGTCTTC-3' (hct_notransl), сконструированных в программе Vector NTI 8 (Invitrogen, США) на основе последовательностей известных генов актинопоринов. Праймеры были синтезированы в НПО «Евроген» (г. Москва). ПЦР проводили на амплификаторе GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems, США) при следующих условиях: 94°C - 5 мин; затем 28 циклов: 94°C - 30 с, 59°C - 45 с, 72°C - 45 с; затем 72°C - 15 мин. ПЦР-фрагменты (650 п.н.) выделяли из агарозного геля с помощью набора DNA Extraction Kit (Thermo Scientific, США) и клонировали в pTZ57R/T, используя систему T/A cloning (Thermo Scientific, США). Рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки штамма DH5a Escherichia coli. Клоны отбирали при помощи сине-голубой селекции на среде LB, содержащей X-Gal и ИПТГ. Присутствие в отобранных клонах нужной вставки определяли с помощью метода ПЦР «на колониях» со стандартными прай-мерами.
Установление и анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса [15]. Определение нуклеотидных последовательностей вставок проводили на ДНК-анализаторе ABI3130xl (Applied Biosystems, США). [16]. Нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности анализировали с помощью пакета программ Vector NTI 8 (Invitrogen, США).
Экспрессия генов актинопоринов
Для создания экспрессионной конструкции фрагмент ДНК, кодирующий актинопорин, амплифицирова-ли с помощью Vent-ДНК-полимеразы («Сибэнзим», Россия) и ген-специфичных праймеров: hct-a(f) (5'-GGCTTTAGCTGGTACAATTATCGCGGGTGCA-3') и hct-a(r) (5'-CCCCAAGCTTAGCGTGAGATCT-TAATTTGcAGTAT-3'). Для сохранения эндопеп-тидазного сайта и корректной вставки гена в вектор pET-41a( + ) (Novagen, США) на 5'-конец прямого праймера был добавлен dGMP, а в состав обратного праймера введен сайт рестрикции для HindlII, совмещенный со стоп-кодоном, а также четыре дополнительных нуклеотида для эффективной работы рестриктазы. ПЦР проводили при следующих условиях: 94°С - 5 мин; затем 30 циклов: 94°С - 30 с, 65°С - 45 с, 72°С - 45 с; затем 72°С - 15 мин. В качестве матрицы использовали pTZ57R/T со вставкой гена hct-a2. ПЦР-фрагмент обрабатывали рестрикта-зой HindIII, клонировали в вектор pET-41a(+) по сайтам рестрикции PshAI и HindIII. Рекомбинантные плазмиды выделяли и секвенировали. Плазмиды с правильной вставкой использовали для трансформации клеток штамма Rosetta (DE3) E. coli путем электропорации на приборе Multiporator (Eppendorf, Германия). Трансформированные клетки культивировали в среде 2хYT, содержавшей антибиотики канамицин (50 мкг/мл) и хлорамфени-кол (34 мкг/мл), в течение ночи, после чего культуру наращивали в объеме 100 мл до светопоглощения А600 = 0.5 - 0.6. Для индукции экспрессии добавляли ИПТГ (Fermentas, Литва) в конечной концентрации 0.1 мМ и продолжали наращивать клетки в течение 3 ч при температуре 30°С для получения гибридного белка в растворимой форме. Затем клетки центрифугировали (8000 об/мин) и промывали буферным раствором 1 xPBS.
Выделение рекомбинантного актинопорина
Клетки, содержащие гибридный белок, ресуспен-дировали в 1 xPBS (1 : 5 по объему) и обрабатывали ультразвуком на приборе Sonopuls HD 2070 (Bandelin Electronic, Германия) для разрушения клеточной оболочки. После центрифугирования
(10000 об/мин) клеточный лизат наносили на Ni2+-CAM-агарозу, инкубировали в течение 10 мин (+4°С) при постоянном перемешивании для связывания гибридного белка с носителем. Для удаления белков клеточного лизата Ni2+-CAM-агарозу с гибридным белком промывали буферным раствором (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, pH 8.0), а затем буферным раствором для реакции с энтеропептидазой (20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, pH 8.0). К гибридному белку добавляли энтеропептидазу (New England BioLabs, Великобритания) из расчета 1 ед. фермента на 20 мкг гибридного белка и инкубировали смесь при комнатной температуре в течение ночи при постоянном перемешивании. После осаждения Ni2+-CAM-агарозы центрифугированием при 3000 об/мин фракцию, содержавшую реком-бинантный актинопорин, отбирали и инкубировали с STI-агарозой для удаления энтеропептидазы.
Электрофоретический анализ
Электрофорез проводили по методу Лэммли [17] в вертикальных пластинах (9 х 12 х 1 мм) в 15% полиакриламидном геле в присутствии 0.1% доде-цилсульфата натрия (ДСН). Молекулярные массы оценивали с использованием стандартного набора белков-маркеров PageRuler™ Unstained protein ladder, 10-200 кДа (Fermentas, Литва).
Масс-спектрометрический анализ
Молекулярные массы полипептидов определяли на времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonic, Германия). Времяпролетные масс-спектры фиксировали в прямом пролете и режиме рефлектора.
Гемолитическая активность
Гемолитическую активность определяли на эритроцитах мыши в среде, содержащей 0.9% NaCl. Уровень гемоглобина в супернатанте измеряли спектрофотометрически при 540 нм после предварительного быстрого охлаждения реакционной смеси и ее центрифугирования для осаждения эритроцитов и их теней. За одну гемолитическую единицу (ГЕ) принимали количество белка, вызывающее гемолиз 50% эритроцитов в 1 мл 0.7% суспензии, за 30 мин при 37°С.
Результаты, обработанные по правилам вариационной статистики с использованием пакета программ MS Office Excel 2007, представлены как средние значения, полученные из шести независимых экспериментов ± стандартное отклонение. Статистическую значимость различий между показателями оценивали по однопараметрическому тесту ANOVA.
Определение N-концевой аминокислотной последовательности
Аминокислотную последовательность N-концевого фрагмента рекомбинантного актинопорина определяли на автоматическом твердофазном аминокислотном секвенаторе белков Procise 492 cLC (Applied Biosystems, США) по программе производителя, используя образец белка на pvdf-мембране. Рекомбинантный белок был перенесен из полиакри-ламидного геля на 0.45 мкм pvdf-мембрану (Millipore, США) в буферном растворе, содержащем 25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20% метанол, 0.1% ДСН, рН 8.3, при 26 В, 60 мА, в течение ночи с использованием Mini Trans-Blot® камеры (Bio-Rad, США). Мембрану окрашивали 0.04% Coomassie Brilliant Blue G-250 в 10% (по объему) ледяной уксусной кислоте, затем отмывали от красителя 50% (по объему) метанолом и высушивали в термостате при 37°С.
Получение бислойных липидных мембран
Бислойные липидные мембраны (БЛМ) формировали на отверстии тефлонового стаканчика диаметром 0.25 мм по методу Мюллера [18] из 1% раствора моноолеина в н-гептане, содержащего заданные концентрации сфингомиелина. Водная фаза: 0.1 М или 1 M NaCl, 10 мМ Hepes, pH 7.5. Актинопорины RTX-A (5 нг/мл) и Hct-A2 (50 нг/мл) добавляли в водную фазу до формирования БЛМ.
Измерение электрических характеристик БЛМ
Ток через БЛМ измеряли высокоомным вольтметр-электрометром ВК2-16 в режиме фиксации потенциала на мембране с помощью хлорсеребряных электродов (потенциал асимметрии 2-3 мВ). Регистрацию тока на выходе усилителя осуществляли потенциометром КПС-4.
Гомологичное моделирование актинопоринов
Модели пространственной структуры актинопори-нов были генерированы методом гомологичного моделирования с помощью веб-сервера SWISS-MODEL [19] и программы Swiss-PdbViewer [20]. В качестве прототипа при построении модели использовали пространственную структуру стихолизина StnII (PDB ID 1GWY) [21] актинии Stichodactyla helianthus, полученную из Protein Data Bank [22]. Оценку электростатических свойств молекулярной поверхности в силовом поле Amber ff12 и визуализацию структур выполняли с помощью программы МОЕ [23].
результаты и обсуждение
Согласно опубликованным данным, нативные акти-нопорины обычно выделяют из водных экстрактов цельных животных и дальнейшую их очистку про-
водят комбинацией различных методов жидкостной хроматографии [4, 12, 24, 25]. В данной работе для выделения индивидуальных актинопоринов использовали метод их осаждения из водного экстракта актинии H. crispa (=Radianthus macrodactylus) ацетоном и разделение компонентов полученного суммарного белкового препарата с помощью катионообмен-ной хроматографии, FPLC гель-фильтрации и ОФ ВЭЖХ.
На рис. 1А приведен профиль элюции суммарного белкового препарата, полученный в результате хроматографии на целлюлозе КМ-32. Полипептиды фракции 2 обладали высокой гемолитической активностью, а фракции 1 и 3 имели более низкую активность. Полипептиды фракции 2 были рехроматогра-фированы в тех же условиях. Последующую очистку актинопоринов проводили методом гель-фильтрации (рис. 1Б). В результате были получены гемолитиче-ски активные фракции, содержащие от 50 до 500 мкг белка. Согласно данным электрофоретического анализа эти фракции содержали полипептиды с молекулярной массой около 19-20 кДа. Полипептиды фракций 1-3 подвергали обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Nucleosil C18 (рис. 1В-Д соответственно). В результате были получены как фракции гомогенных полипептидов (рис. 1Г), так и фракции, содержащие несколько полипептидов (рис. 1В,Д) с молекулярной массой от 18995.5 до 19398.7 Да, согласно данным масс-спектрометрического анализа. Очевидно, что в суммарных фракциях актинопори-ны представлены множеством изоформ с очень близкими физико-химическими свойствами и, вероятно, с этим связано уширение пиков при хроматографи-ческом разделении этих полипептидов.
Из H. crispa нами ранее были выделены и охарактеризованы актинопорины RTX-A, RTX-S и RTX-SII, а также определены нуклеотидные последовательности генов и получены 18 аминокислотных последовательностей актинопоринов семейства Hct-S, содержащих N-концевой остаток серина [12, 14, 25, 26]. Экспериментальные значения молекулярных масс выделенных актинопоринов лежат в пределах от 18995.5 до 19398.7 Да и согласуются с расчетными значениями для семейства Hct-S (от 19338 до 19518 Да), что свидетельствует о существовании множества изоформ актинопоринов не только на геномном или транскриптомном, но и на трансляционном уровне. Наличие в масс-спектрах сигналов меньшей интенсивности в области 38543 и 57950 m/z показывает, что актинопорины существуют в водных растворах также в форме димеров и/или три-меров соответственно, что согласуется с экспериментальными данными, полученными ранее для StnII из S. helianthus [27].
л
А,750 нм
[NaCl], M
0.15
А,214 нм
0.05
100
Номер фракции
0.2
0.1
0
0 60
80 100 Объем элюента, мл
А, 214 нм 300
200
В
9350.2
А,214 нм
9398,7
m/z
2000
1500-
1000-
500
30
-г
40
m/z
А,214 нм
Время, мин
д
25 30 Время, мин
35
800
600
400
20
m/z
30 40
Время, мин
Рис. 1. Хроматографическое разделение гемолитически активных полипептидов актинии Н. crispa. А - ионообменная хроматография компонентов суммарного белкового препарата на колонке с целлюлозой КМ-32. Отмечены границы объединения фракций полипептидов, проявляющих гемолитическую активность. Б - FPLC гель-фильтрация полипептидов 2 фракции после ионообменной хроматографии на колонке Superdex Peptide 10/30, отмечены границы объединения фракций. В-Д- ОФ-ВЭЖХ полипептидов фракций 1-3 после гель-фильтрации на колонке Nucleosil C18 и масс-спектры полученных соединений
Б
0
Г
0
0
pi al ß2 ß3 ß4 ß5 ß6
SSS HHH HHHHH HHHHH SSSSSSSSS SSSSSS SS S SS SS SSSSSS SSSSS
10 20 30 40 50 60 70 80 90
RTX-A --ALAGAIIA GASLTFQILD KVLAELGQVS RKIAIGIDNE SGGSWTAMNA YFRSGTTDVI LPEFVPNQKA LLYSGRKNRG PDTTGAVGAL
Hct-A2 —. . . ■T... . G .G. . ■ K. . . .....V. . . . .T,, ......DT. ■ VA. . . .A.F
Hct-A3 —. . . ■T... . G .G. . ■ K. . . . . .V..... . л,, ......DT. ■ VA. . . .A.F
Hct-A4 —. . . ■T... . .K. . . E. .G. . ■ K. . . . . .V.V. . . . л,, • EA. . . .A.F
Hct-A6 —. . . ■T... . .K. . . E. .G. . ■ K. . . . . .V.A. . . . .L. • EA. . . .A.F
Hct-A5 —. . . ■T... . .K. . . E .G. . ■ K. . . . . .V.V. . . T. .EA. . . .A.F
Hct-S3 SA. . . ■T..E . G .G. . ■ K. . . .....V. . . . .L. ......DT. ■ VA. . . .A.F
Hct-S5 SA. . . ■T... . .K. . . E .G. . ■ K. . . . . .V.V. . . T. • EA. . . .A.F
Hct-S6 SA. . . ■T... . .K. . . T! .G. . ■ K. . . . . .V.V. . . T. • EA. . . .A.F
Hct-S7 SA. . . .T.TE . .G .G. . .K. . . .....V. . . T. ......DT. ■ VA. . . .A.F
HMglll SA. . . ■T..E . .G .G. . ■ K. . . . . .V.V. . . T. ......DT. ■ VA. . . .A.F
Stnl -SE. . . T. . D . .EV. . .G. . .K. . . . . .V..... . . .T. T. , . .V. . .T.. . ......SS. ■ VA. . . .A.F
Stnll —. . . ■T... . . .V. . F. .K. . . . . .V..... . . .T. T. . .T.. . ......DT. ■ VA. . . .A.F
Eqtll S ADV. . .V.D . .S, .D. .K T. • EA. • N.K . . . .V.V. . . . . KT. . .L. ,T . . , ____S. IV . .HK. .HG.. . ..N.Q.D.. .VA. . . . .V
EqtIV SV.V. ____К . . .А. .NV.Q T. • KA. • DI. . . . .V.V. . . . . KT. . .L. ,T . . , ____S. IV . . .HK. .HG.. . ..N.Q.D.. .VA. . . . .V.
EqtV SV.V. ____К . . .А. .NV.Q T. • KA. ■ DI. . . . .V.V. . . . . KT. . .L. ,T . . , ____S. TV , .HK. •HG.. . ..N.Q.D.. ■ VA. . . . .V.
RTX-A
Hct-A2
Hct-A3
Hct-A4
Hct-A6
Hct-A5
Hct-S3
Hct-S5
Hct-S6
Hct-S7
HMglll
Stnl
Stnll
Eqtll
EqtIV
EqtV
SSSS
ß7
SSS SSSSSS 100
110
ß8
SSSSS 120
SSS
a2
H HHHHHHH 130 140
ß9
SS
ßio
SS SSSSS 150
ßll SSS 160
SSSS
ßl2
SS SSSSSS 170
180
AYYMSNGNTL GVMFSVPFDY NLYSNWWDVK VYSGKRRADQ AMYEDLYY-S NPYRGDNGWH QKNLGYGLKM KGIMTSAGEA IMEIRISR-
.L..D.
■ A. .D.
■ A. .D.
A.L. A.L. A.L.
... I.P____
... I......
N.R I.K____
N.R IFK.R.. ■ Y. . .W.....N.R IFK.R. .
.W.
.W. .W. .W.
. . G____M
. . G____M
. . G____M
, . . G.....
.. R...E.
. .. R...Q.
. .. R...Q.
.-G .-G .-G .-G .-G .-G .-G .-G .-G .-G .-G .-G .NL S
• YL S
• YL S
TR
ERH
ERH
RV . R. R
R R R R .S R .S R .S R
.LQ.K.
■ LQ.K.
• LQ.K.
• LQ.K.
• LQ.K.
• LQ.K. .LQ.K. MLQ.K. .LQ.K.
■ LQ. . K.Q.K. K.Q.K. .
■ L. .HV. .L..HVTKA .L..HVTKA
KA
Рис. 2. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей актинопоринов. RTX-A, RTX-SII, Hct-As, Hct-Ss - актинопорины H. crispa; HMglII - магнификализин Heteractis magnifica (Swiss-prot, Q9U6X1); Stnl, Stnll - стихолизины S. helianthus (Swiss-Prot, P81662, P07845); EqtlI, EqtIV, EqtV - эквинатоксины A. equina (Swiss-Prot, P61914, Q9Y1U9, Q93109). Идентичные остатки отмечены точками; длина a-спиралей и Р-тяжей соответствует структуре Stnll и показана буквами H и S соответственно
Следует заметить, что отличительной особенностью первичной структуры актинопорина RTX-A, выделенного из H. crispa (19273 Да), является отсутствие первых двух N-концевых аминокислотных остатков [12]. Согласно расчетным значениям молекулярных масс актинопоринов семейства Hct-S (от 19338 до 19518 Да) и значениям, определенным для актинопоринов MALDI TOF масс-спектрометрией (от 18995.5 до 19398.7 Да), можно предположить существование еще одного семейства актинопоринов с меньшими значениями молекулярных масс и, вероятно, с остатком аланина на N-конце молекулы.
Клонирование генов актинопоринов
Для определения нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих зрелые актинопори-ны актинии H. crispa, были сконструированы пря-
мой (hct_sign) и обратный (hct_notransl) праймеры. Праймер hct_sign создан на основе анализа сигнальных последовательностей известных актинопоринов, а ген-специфичный обратный праймер hct_notransl -на основе ранее полученной информации о 3'-не-транслируемой области rtx-a и rtx-sii H. crispa [28].
В результате ПЦР, клонирования, секвенирования и анализа ПЦР-фрагментов были получены 17 последовательностей генов актинопоринов, пять из которых кодировали актинопорины нового семейства Hct-A (Hct-A2-Hct-A6), а 12 - актинопорины семейства Hct-S, установленного нами ранее (рис. 2) [26]. Идентичность нуклеотидных последовательностей составила от 93 до 99%, а аминокислотных последовательностей - от 88 до 99%. Наиболее представленными оказались Hct-A2-Hct-A4, Hct-S3, Hct-S5 и Hct-S6.
Расчетные молекулярные массы актинопори-нов семейств Hct-A и Hct-S составили от 19158
Рис. 3. Модели пространственной структуры актинопоринов Нс+-А2 и Н^-Аб. Модели пространственной структуры актинопоринов Нс+-А2 (А) и Н^-Аб (Б) представлены в виде ленточной диаграммы и окрашены согласно элементам вторичной структуры. Аминокислотные остатки, формирующие РОС-сайт связывания, «псевдожесткую» петлю 28SRK30, а также остатки с заряженной боковой цепью на петле, соединяющей Р5- и Р6-тяжи, представлены в виде стержневой модели; аминокислотные остатки Asn76 и Агд77 актинопорина Н^-Аб представлены в виде шаростержневой модели. Вариабельные участки молекулярной поверхности окрашены согласно электростатическим свойствам: положительно заряженные - синим, а отрицательно заряженные - красным. Визуализация выполнена с помощью программы МОЕ [23]
до 19518 Да, что соответствует нативным актинопо-ринам H. crispa, A. equina, S. helianthus, H. magnifica, Phyllodiscus semoni [12, 24-32]. Все представители семейств Hct-A и Hct-S являются высокоосновными полипептидами, расчетные значения их изоэлектри-ческих точек лежат в диапазоне 9.10-9.74, что характерно для актинопоринов H. crispa, а также для большинства известных представителей актинопоринов из других видов актиний.
Согласно полученным данным, в ткани щупалец H. сгispa, как и актиний A. equina [29, 33], H. magnifica [34], S. helianthus [24, 35], синтезируется целый ряд изоформ актинопоринов, кодируемых мультигенными семействами. Актинопорины различаются единичными аминокислотными заменами (рис. 2), большинство из которых находится в функционально значимом амфифильном N-концевом фрагменте молекулы (1-27 а.о.), участвующем в порообразовании и связанным с Р-кором высокозаряженной петлей S/KRK30 [21, 28, 36]. Все представители актинопоринов характеризуются высокой консервативностью аминокислотных остатков, входящих в ароматический POC-сайт связывания с мем-
браной (104-137 а.о.), а также остатка Lys77, локализованного на петле, соединяющей Р5- и Р6-тяжи (76-79 а.о.). Этот остаток, как показано для EqtП, участвует в процессе олигомеризации мономеров [37].
Ы silico-анализ заряженных аминокислотных остатков в области взаимодействия актинопоринов с мембраной
К настоящему времени установлено, что в основе молекулярного механизма порообразования лежит электростатическое притяжение положительно заряженной молекулы актинопорина к противоположно заряженной цитоплазматической мембране и специфическое взаимодействие РОС-сайта связывания с фосфорилхолиновой головкой сфингомиелина [5, 21, 28, 36]. Происходящая затем конформационная перестройка П-концевого фрагмента молекулы приводит сначала к его переходу в водно-липидный интерфейс и затем к включению в гидрофобный кор мембраны. Процесс сопровождается олигомеризацией трех-четырех или девяти молекул мономера [27, 38-40]
Для определения локализации функционально важных участков актинопоринов семейства Н^-А
л
ш
50
—
mm
RTX-A
50
20 5
1 2 3 4
6 7
12 пА|
I
20 мВ
Рис. 4. Электрофореграммы белков клеточного лиза-та после экспрессии рЕТ-41а(+)-Ьс/-а2 без добавления ИПТГ (1); после экспрессии рЕТ-41а(+)-Ьс/-а2 с добавлением ИПТГ в концентрации 0.1, 0.5 и 1.0 мМ (2—4 соответственно); и рекомбинантного актинопорина гНс1-А2 (6); 5, 7 - маркеры молекулярной массы, кДа
(Н^-А2-Н^-А6) были построены модели их пространственных структур. В качестве прототипа использовали кристаллическую структуру StnII (PDB, 1gwyA), выполненную с наивысшим разрешением 1.71 А (идентичность последовательностей составляет от 90.29 до 99.43%). Полученные модели 3D-структуры актинопоринов содержат по 12 Р-тяжей, образующих Р-кор, и по две а-спирали, расположенные на Ы- и С-концах молекулы. Антипараллельные Р-тяжи соединены между собой и с а-спиральными фрагментами молекулы петлями различной протяженности (рис. 3), включающимися при порообразовании в мембранный интерфейс [40]. Величина RMSD для 175 Са-атомов модели относительно прототипа составила 0.27 А.
В представленной работе проведен анализ вариаций заряженных остатков в области взаимодействия актинопоринов с мембраной. Картирование на молекулярной поверхности этих молекул изменений ее электростатических свойств показало, что несмотря на высокую консервативность расположения заряженных остатков в структуре акти-нопоринов, на петле 74-83, соединяющей Р5- и Р6-тяжи, расположен вариабельный участок (рис. 2 и 3). Согласно данным криоэлектронной микроскопии эта петля, локализованная, как и РОС-сайт связывания, на поверхности контактов актинопо-
20 мВ
с
о
60
40
20
0
rHct-A2
60
о с
го 40 J
20
с
о
U
RTX-A
0 60 120 180 240 300 420
Проводимость, пСм
0
0 60 120 180 240 300 420
Проводимость, пСм
Рис. 5. Результаты исследования каналообразующей активности актинопоринов на БЛМ. А - проводимость БЛМ, индуцированная актинопоринами H. crispa: rHct-A2 (50 нг/мл) и RTX-A (5 нг/мл). Мембранный потенциал - 20 мВ. Б - гистограммы проводимости мембран, модифицированных актинопоринами, rHct-A2 и RTX-A
ринов с липидным интерфейсом, играет важную роль как в распознавании, так и во взаимодействии с мембраной [21]. Показано, что замена нейтрального остатка Thr на положительно заряженный остаток Arg в положении 77 и отрицательно заряженного Asp на Asn в положении 76 у трех представителей семейства Hct-A4-Hct-A6 значительно увеличивает плотность положительного заряда в данной об-
5
Б
ласти (рис. 3). На наш взгляд, это должно привести к сильному электростатическому взаимодействию как данной петли, так и соседней, высокозаряженной «псевдожесткой» петли SRK (28-30 а.о.), с поверхностью мембраны. Очевидно, именно эти электростатические взаимодействия способствуют, в свою очередь, конформационной реорганизации N-концевого фрагмента и последующей его дислокации и включению в мембрану.
Получение рекомбинантного актинопорина и исследование его свойств
Большое количество изоформ актинопоринов в одном виде-продуценте создает определенные трудности для получения гомогенных полипептидов в достаточном для проведения структурно-функциональных исследований количестве. С целью получения индивидуальных актинопоринов были подобраны условия экспрессии их генов в бактериальной системе и разработана схема их выделения в рекомбинантной форме.
Для создания конструкции, экспрессирующей ген актинопорина, была выбрана рЕТ-система, в частности, плазмидный вектор pET-41a(+), предназначенный для экспрессии в E. coli целевых белков, слитых с белком-носителем - глутатион^-трансферазой (GST). На основе последовательностей генов, кодирующих зрелые актинопорины семейства Hct-A, были сконструированы ген-специфичные прай-меры hct-a(f) и hct-a(r), фланкирующие ген hct-a2 с 5'- и З'-концов соответственно. В качестве матрицы для ПЦР использовали рекомбинантную плаз-миду pTZ57R, содержащую ген hct-a2. В результате ПЦР был получен фрагмент (550 п.н.), который встроили в плазмиду по PshAI- и ffindni-сайтам. Рекомбинантные плазмиды с нужной вставкой использовали для трансформации штамма Rosetta (DE3) E. coli. Рекомбинантный актинопорин был получен в виде слитого с GST гибридного белка с по-лигистидиновым «хвостом» (GST-His6-rHct-A2). По данным электрофоретического анализа молекулярная масса гибридного белка была чуть более 50 кДа (рис. 4), что согласуется с расчетными данными (~52 кДа). GST-His6-rHct-A2 был обнаружен также в культуральной среде, но в меньшем количестве. ИПТГ в концентрации 0.1-1.0 мМ практически не влиял на выход рекомбинантного белка. Рекомбинантный актинопорин rHct-A2 с молекулярной массой около 20 кДа был выделен из клеточного лизата в нативных условиях с помощью аффинной хроматографии (рис. 4). Выход актинопорина составил в среднем 4 мг/л. В результате секвенирования была определена N-концевая аминокислотная последовательность (15 а.о.), которая полностью соответствовала выведенной на основании нуклеотидной
последовательности. Расчетная молекулярная масса rHct-A2 составила 19141 Да, а изоэлектрическая точка - 9.64. Гемолитическая активность rHct-A2 составила 4.0 х 104 ГЕ/мг, что сравнимо с активностью актинопоринов как H. crispa [12, 25, 26], так и других видов актиний [4, 5, 9, 24, 29].
В результате определения каналообразующей активности рекомбинантного актинопорина на БЛМ, сформированных из моноолеина и сфингомиелина (1 : 3), было установлено, что rHct-A2 в концентрации 50 нг/мл вызывает дискретные флуктуации тока в мембране, что свидетельствует о появлении в ней проводящих структур - ионных каналов (рис. 5А). Наиболее вероятная величина проводимости каналов, индуцированных rHct-A2 в 0.1 М NaCl при рН 7.5, составила 180 ± 30 пСм, что соответствует проводимости каналов, формируемых нативным RTX-A (рис. 5Б).
заключение
Согласно фармакологическим исследованиям актино-поринов, их биологическая активность определяется неспецифическим действием, приводящим к увеличению проницаемости мембран, что может стимулировать различные токсические эффекты в клетках. Фактически увеличение клеточной проницаемости, вызываемое актинопоринами, приводит к глубоким изменениям морфологии клетки и ее органелл, клеточной фрагментации [5], а также к увеличению размера клеток и их гибели [41, 42]. Структурно-функциональные исследования актинопоринов, как и многих других токсинов, направлены, в конечном итоге, на определение их фармакологической активности и терапевтического потенциала. В настоящее время а-ПФТ актиний рассматривают как модели для дизайна противоопухолевых, антибактериальных и кардиостимулирующих агентов [43, 44]. Созданные природой уникальные соединения, по-видимому, могут найти успешное применение в качестве лекарственных препаратов (или основы для создания препаратов) в сочетанной терапии онкозаболеваний и/ или различных кардио- и цитопатологий. •
Авторы выражают благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН О.В. Черникову за секвенирование N-концевой аминокислотной последовательности и К.В. Гузеву за секвенирование нуклеотидных последовательностей.
Работа поддержана комплексной программой фундаментальных исследований ДВО РАН «Дальний Восток» 42П. Получение и исследование свойств рекомбинантного актинопорина выполнено за счет средств гранта РНФ (проект № 14-25-00037).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Parker M.W., Feil S.C. // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005. V. 88. № 6202. P. 91-142.
2. Chi V., Pennington M.W., Norton R.S., Tarcha E.J., Londono L.M., Sims-Fahey B., Upadhyay S.K., Lakey J.T., Iadonato S., Wulff H., et al. // Toxicon. 2012. V. 59. № 4. P. 529-546.
3. Frazao B., Vasconcelos V., Antunes A. // Mar. Drugs. 2012. V. 10. № 8. P. 1812-1851.
4. Turk T.J. // Toxicol. Toxin. Rev. 1991. V. 10. P. 223-262.
5. Anderluh G., Macek P. // Toxicon. 2002. V. 40. № 2. P. 111-124.
6. Tejuca M., Anderluh G., Dalla Serra M. // Toxicon. 2009. V. 54. № 8. P. 1206-1214.
7. Fedorov S., Dyshlovoy S., Monastyrnaya M., Shubina L., Leychenko E., Kozlovskaya E., Jin J.-O., Kwak J.-Y., Bode A.M., Dong Z., et al. // Toxicon. 2010. V. 55. № 4. P. 811-817.
8. Batista U., Macek P., Sedmak B. // Cell Biol. Int. Rep. 1990. V. 14. № 11. P. 1013-1024.
9. Norton R.S., Bobek G., Ivanov J.O., Thomson M., Beer E.F., Mortiz R.L., Simpson R.J. // Toxicon. 1990. V. 28. № 1. P. 29-41.
10. Migues P.V., Leal R.B., Mantovanni M., Nicolau M., Gabilan N.H. // NeiroReport. 1999. V. 10. № 1. P. 67-70.
11. Soletti R.C., Alves T., Vernal J., Terenzi H., Anderluh G., Borges H.L., Gabilan N.H., Moura-Neto V. // Anticancer Res. 2010. V. 30. № 4. P. 1209-1215.
12. Monastyrnaya M.M., Zykova T.A., Apalikova O.V., Shwets T.V., Kozlovskaya E.P. // Toxicon. 2002. V. 40. № 8. P. 1197-1217.
13. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Fearr A.L., Randall R.J. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 1. P. 265-275.
14. Il'ina A., Lipkin A., Barsova E., Issaeva M., Leychenko E., Guzev K., Monastyrnaya M., Lukyanov S., Kozlovskaya E. // Toxicon. 2006. V. 47. № 5. P. 517-520.
15. Sambrook J., Russel D.W. Molecular cloning. Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. P. 1.31-1.58.
16. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. № 12. P. 5463-5467.
17. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.
18. Muller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. // J. Phys. Chem. 1963. V. 67. P. 534-535.
19. Guex N., Peitsch M.C. // Electrophoresis. 1997. V. 18. № 15. P. 2714-2723.
20. Guex N., Peitsch M.C., Schwede T. // Electrophoresis. 2009. V. 30. Suppl 1. P. S162-173.
21. Mancheno J.M., Martin-Benito J., Martinez-Ripoll M., Gavilanes J.G., Hermoso J.A. // Structure. 2003. V. 11. № 11. P. 1319-1328.
22. http://www.rcsb.org/
23. Molecular Operating Environment (MOE), 2013.08; Chemical Computing Group Inc., 1010 Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2014.
24. Lanio M.E., Morera V., Alvarez C., Tejuca M., Gomez T.,
Pazos F., Besada V., Martínez D., Huerta V., Padrón G., et al. // Toxicon. 2001. V. 39. № 2-3. P. 1В7-194.
25. Klyshko E.V., Issaeva M.P., Monastyrnaya M.M., Il'ina A.P., Guzev K.V., Vakorina T.I., Dmitrenok P.S., Zykova T.A., Kozlovskaya E.P. // Toxicon. 2004. V. 44. № 3. P. 315-324.
26. Ткачева Е.С., Лейченко Е.В., Mонастырная M.M., Исаева M.n, Зелепуга Е.А., Анастюк С.Д., Дмитренок П.С., Козловская Э.П. // Биохимия. 2011. Т. 7б. № 10. С. 13В7-1397.
27. Alegre-Cebollada J., Cunietti M., Herrero-Galán E., Gavilanes J.G., Martínez-del-Pozo A. // J. Mol. Biol. 200В. V. 3В2. № 4. P. 920-930.
2В. Monastyrnaya M., Leychenko E., Issaeva M., Likhatskaya G., Zelepuga E., Kostina E., Trifonov E., Nurminski E., Kozlovskaya E. // Toxicon. 2010. V. 5б. № В. P. 1299-1314.
29. Macek P., Lebez D. // Toxicon. 19В1. V. 19. № 2. P. 233-240.
30. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj B., Macek P., Gubensek F. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 199б. V. 220. № 2. P. 437-442.
31. Samejima Y., Yanagisaws M., Aoki-Tomomutsu Y., Iwasaki E., Ando J., Mebs D. // Toxicon. 2000. V. 3В. № 2. P. 259-2б4.
32. Nagai H., Oshiro N., Takuwa-Kuroda K., Iwanaga S., Nozaki M., Nakajima T.A. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. бб. № 12. P. 2б21-2б25.
33. Wang Y., Yap L.L., Chua K.L., Khoo H.E. // Toxicon. 200В. V. 51. № В. P. 1374-13В2.
34. Anderluh G., Krizaj I., Strukelj B., Gubensek F., Macek P., Pungercar J. // Toxicon. 1999. V. 37. № 10. P. 1391-1401.
35. Blumenthal K.M., Kem W.R. // J. Biol. Chem. 19В3. V. 25В. № 9. P. 5574-55В1.
36. Kristan K., Podlesek Z., Hojnik V., Gutierrez-Aguirre I., Guncar G., Turk D., Gonzalez-Manas J.M., Lakey J.H., Macek P., Anderluh G. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 45. P. 4б509-4б517.
37. Anderluh G., Barlic A., Potrich C., Macek P., Menestrina G. // J. Membrane Biol. 2000. V. 173. № 1. P. 47-55.
3В. Mechaly A.E., Bellomio A., Gil-Cartón D., Morante K., Valle M., González-Mañas J.M., Guérin D.M. // Structure. 2011. V. 19. № 2. P. 1В1-191.
39. Bakrac B., Gutiérrez-Aguirre I., Podlesek Z., Sonnen A.F.-P., Gilbert R.J.C., Macek P., Lakey J.H., Anderluh G. // J. Biol. Chem. 2009. V. 2В3. № 27. P. 1Вбб5-1Вб77.
40. Rojko N., Kristan K.C., Viero G., Zerovnik E., Macek P., Dalla Serra M., Anderluh G. // J. Biol. Chem. 2013. V. 2ВВ. № 33.
P. 23704-23715.
41. Zorec R., Tester M., Macek P., Mason W.T. // J. Membrane Biol. 1990. V. 11В. № 3. P. 243-249.
42. Meunier F.A., Frangez R., Benoit E., Ouanounou G., Rouzaire-Dubois B., Suput D., Molgo J. // Toxicon. 2000. V. 3В. № 11. P. 1547-15б0.
43. Lewis R.J., Garcia M.L. // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. V. 2. № 10. P. 790-В02.
44. Takagi J. // Biochem. Soc. Transactions. 2004. V. 32. № 3. P. 403-40б.
