CC BY
120
УДК 575.174.015.3:599.9
Характеристика транскриптома плацентарной ткани у женщин с физиологической беременностью и преэклампсией
Е. А. Трифонова1, Т. В. Габидулина2, Н. И. Ершов3, В. Н. Сереброва1, А. Ю. Ворожищева4,
В. А. Степанов1*
Научно-исследовательский институт медицинской генетики СО РАМН, 634050, Томск, ул. Набережная реки Ушайки, 10
2Сибирский государственный медицинский университет Минздрава РФ, кафедра акушерства и гинекологии ФПК и ППС, 634050, Томск, ул. Московский тракт, 2
3Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 10 4МЛПУ «Городская клиническая больница № 1», 654057, Новокузнецк, просп. Бардина, 28 *E-mail: vadim.stepanov@medgenetics.ru Поступила в редакцию 28.08.2013 После доработки 23.12.2013
РЕФЕРАТ Преэклампсия (ПЭ) - одно из наиболее тяжелых гестационных осложнений, занимает ведущее место среди причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности, причем в последние годы отмечается рост тяжелых и сочетанных форм данной патологии. Согласно современным представлениям в развитии ПЭ, которая характеризуется синдромом полиорганной недостаточности, ведущую роль играют нарушение инвазии цитотрофобласта в спиральные артерии матки и формирование в плацентарной ткани синдрома ишемии-реперфузии. В связи с этим цель нашей работы состояла в изучении паттернов транс-криптома плацентарной ткани, специфичных для женщин с ПЭ и с физиологическим течением беременности, а также в выявлении потенциальных перспективных биомаркеров и молекулярных механизмов развития данной патологии. Выявлены 63 гена, экспрессия которых статистически значимо различается в плацентарной ткани женщин с ПЭ и с физиологическим течением беременности. Кластер дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ), уровень экспрессии которых повышен при ПЭ, содержит не только известные гены-кандидаты, выявленные ранее во многих зарубежных полногеномных исследованиях (к примеру, LEP, BHLHB2, SIGLEC6, RDH13, BCL6), но и новые гены (ANKRD37, SYDE1, CYBA, ITGB2 и др.), которые могут рассматриваться в качестве новых биологических маркеров ПЭ и представляют интерес для дальнейшего изучения. Результаты функциональной аннотации ДЭГ показывают, что с развитием ПЭ могут быть связаны реакция на стресс, иммунные процессы, регуляция межклеточных взаимодействий, внутриклеточные сигнальные каскады и др. Кроме того, выявлены особенности дифференциальной экспрессии генов, зависящие от степени тяжести ПЭ, получены доказательства важной роли молекулярных механизмов, обуславливающих нарушения иммунологической толерантности и запуск провоспалительного каскада в развитии тяжелой формы ПЭ. Полученные результаты расширяют представление о патофизиологии ПЭ и содержат информацию, необходимую для разработки мероприятий таргетной терапии этого заболевания.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА микрочипы, плацента, полногеномный анализ, преэклампсия, транскриптом, экспрессия генов.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДЭГ - дифференциально экспрессирующиеся гены; МФЗ - многофакторные заболевания; ПЭ - преэклампсия; GWAS - полногеномное исследование ассоциаций; SNP - однонуклеотидный полиморфизм.
ВВЕДЕНИЕ
Проведенные к настоящему времени многочисленные полногеномные исследования ассоциаций (GWAS) предоставили ценную информацию о гене-
тической архитектуре многофакторных заболеваний (МФЗ) человека и выявили сотни рисковых аллелей однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), связанных с большим количеством фенотипов. Однако они
объясняют лишь относительно малую часть наследования сложных признаков и оказывают весьма умеренный эффект на фенотип ассоциированных вариантов [1]. Эти результаты поставили интенсивно обсуждаемый в настоящее время вопрос об «упущенной наследственности» (missing heritability). Другое ограничение эффективности GWAS в отношении изучения структуры наследственной компоненты предрасположенности к МФЗ связано с использованием tagSNP: рисковые аллели, идентифицированные в ходе GWAS, как правило, не относятся к «причинным», а находятся в неравновесии по сцеплению (LD) с аллелями функционально значимых вариантов [2], поэтому серьезную проблему представляет биологическая интерпретация результатов GWAS.
Большинство используемых на сегодняшний день подходов к идентификации «причинных» аллельных вариантов, сцепленных с полиморфизмами, детектированными в GWAS, основано на анализе кодирующих или транскрибируемых участков генома [2-4]. Однако подавляющее большинство SNP, выявленных при GWAS, находятся в нетранскрибируемых областях, не сцеплены с вариантами, расположенными в экзонах, и основной механизм их действия связан, по-видимому, с регуляцией экспрессии генов [5, 6]. Поэтому при исследовании генетической архитектуры и молекулярных механизмов МФЗ особую актуальность приобретают постгеномные методы, позволяющие в короткий срок получить информацию практически обо всех компонентах, координирующих основные функции генов, РНК и белков на различных иерархических уровнях. Один из таких подходов, а именно высокопроизводительное измерение экспрессии генов с помощью технологии микрочипов, использован в представленной работе для характеристики паттернов транскриптома при физиологической беременности и при преэклампсии (ПЭ), одном из наиболее тяжелых гестационных осложнений.
Преэклампсия, при которой развивается синдром полиорганной недостаточности, - специфичный синдром, который возникает после 20-й недели беременности и определяется по наличию артериальной гипертензии и протеинурии. ПЭ диагностируется в 70% случаев гипертензивных расстройств у беременных, причем в последние годы отмечается рост частоты тяжелых и сочетанных форм данной патологии [7]. Несмотря на большое количество теорий этиопато-генеза (неврогенная, гормональная, плацентарная, иммунологическая, генетическая и др.), многочисленные исследования механизмов развития этого заболевания и появление новых методов лечения, ПЭ продолжает занимать ведущее место среди причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности. На долю этой патологии приходится
до 70% мертворождений и выкидышей, а величина перинатальных потерь при ПЭ возрастает почти в 5 раз [7, 8].
Согласно современным представлениям, этиопато-генез преэклампсии тесно связан с нарушением инвазии цитотрофобласта в спиральные артерии матки и с формированием синдрома ишемии-реперфузии, обусловливающего развитие окислительного стресса и системного воспаления [9, 10]. Этиологические факторы и механизмы этого нарушения на сегодняшний день остаются не вполне ясными и требуют пристального внимания. С целью выявления возможных перспективных биомаркеров ПЭ и изучения молекулярных механизмов гестационных осложнений мы анализировали паттерны плацентарного транс-криптома, специфичные для ПЭ и физиологического течения беременности, поскольку очевидно, что ведущая роль в развитии ПЭ принадлежит плацентарной ткани. Стратегия использования микрочипов в данном контексте представляется достаточно обоснованной и мощной, так как позволяет детально исследовать на уровне транскриптома возможные изменения в экспрессии генов, связанных с патофизиологией преэклампсии.
экспериментальная часть
Характеристика обследованных групп
В рамках данной работы были обследованы 10 пациенток с ПЭ и 11 с физиологическим течением беременности, составивших контрольную группу (табл. 1). В анкету были включены сведения о демографических (этническая принадлежность) и антропометрических (рост, вес) параметрах, образе жизни (курение, злоупотребление психоактивными веществами), а также информация о соматическом и акушерско-гинекологическом анамнезе. Диагноз ПЭ был установлен на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности, таких, как протеинурия, отеки, гипертензия (систолическое давление более 140 мм рт. ст., диастолическое - от 90 мм рт. ст.), в соответствии с Международной классификацией болезней 10-го пересмотра. Степень тяжести ПЭ оценивали по критериям клинического протокола 2012 года «Гипертензия во время беременности. Преэклампсия. Эклампсия» [11].
Группа больных ПЭ была неоднородной как по степени тяжести (в исследование вошли шесть пациенток с умеренно выраженной и четыре пациентки с тяжелой формой ПЭ), так и по наличию предшествовавших и сопутствующих фоновых заболеваний: у четырех пациенток диагностирована ПЭ при отсутствии фоновых заболеваний, у остальных геста-ционное осложнение развилось на фоне таких экс-
Таблица 1. Характеристика обследованных групп
Показатель ПЭ, N = 10 Контрольная группа, N = 11 Уровень значимости, р*
Средний возраст, лет 2б ± 2 28 ± 3 0.241
Средний вес, кг б0 ± 7 б2 ± б 0.324
Индекс массы тела, ИМТ 23 ± 4 23 ± 3 0.832
Среднее максимальное систолическое артериальное давление, мм рт. ст. 1б2 ± 19 121 ± 3 0.0001
Среднее максимальное диастолическое артериальное давление, мм рт. ст. 104 ± 13 80 ± 4 0.0001
Срок родов, недели 38 ± 1 40 ± 2 0.009
Вес новорожденных, г 2783 ± 5б0 3549 ± 345 0.004
Рост новорожденных, см 50 ± 4 53 ± 2 0.021
Преждевременные роды, % 50 0 0.012
Наличие хронических заболеваний, % б0 50 0.575
*Уровень значимости определен при сравнении групп с помощью критерия Манна-Уитни или точного критерия Фишера.
трагенитальных заболеваний, как вегетососудистая дистония по гипо-/гипертоническому типу, хронический пиелонефрит, хронический холецистит, хроническая артериальная гипертензия. У шести женщин контрольной группы также зафиксирован хронический пиелонефрит и хронический холецистит. Возраст беременных в обеих группах варьировал от 18 до 33 лет, по показателю среднего возраста группы были сопоставимы. Выявлены статистически значимые отличия по весу и росту новорожденных из контрольной группы и группы больных. Группы различались также по показателям артериального давления и срока родов.
Сбор плацентарных образцов
В работе исследовали дистальную (материнскую) часть плаценты. Ткань забирали сразу после родов (время ишемии образца не превышало 10 мин). Плацентарные биоптаты забирали из центральных зон близко к пуповине на 0.5 см плацентарной глубины. Образцы были собраны из макроскопически нормальных участков плаценты (без кровоизлияний, кальцификации, некроза и осаждений фибрина), не затрагивая крупные сосуды, промыты физиологическим раствором для удаления остатков материнской крови и амниотической жидкости, сразу погружены в БПАМег (АтЫоп, Великобритания) и перенесены на хранение при -80°С до процедуры выделения РНК. При гистологическом исследовании
Рис. 1. Микрофотография одного из биоптатов плаценты. Окраска гематоксилином-эозином
во всех биоптатах определялись ворсинки хориона и децидуальная ткань с очагами фибриноидного некроза и мелкими кальцинатами (рис. 1).
Выделение РНК
Образцы ткани (100-200 мг) гомогенизировали с помощью TissueLyseг (Qiagen) в Т^о1 и далее выделяли РНК по стандартному протоколу. Концентра-
цию суммарной РНК определяли с использованием на Nanodrop ND-1000 по поглощению при длине волны 260 нм в воде. Качество образцов контролировали с помощью системы капиллярного электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA) и спектрофотометрического сканирования.
Анализ микроматриц
Полногеномный профиль экспрессии генов в ткани плаценты определяли с помощью гибридизации на микроматрицах НТ-12 BeadChip (Illumina, США), содержащих информацию более чем о 48000 транс-криптов. После гибридизации микроматрицы сканирование на приборе Illumina BeadArray Reader. Преобразование первичных данных в средние значения интенсивности сигнала по каждой пробе (Sample Probe Profile) проводили с помощью программного пакета BeadStudio v3 (Illumina).
Биоинформатический анализ
Анализ данных проводили в программной среде R с помощью пакета limma [12]. Для всего набора данных проводили непараметрическую коррекцию фона с последующей квантильной нормализацией (функция neqc). В дальнейшее рассмотрение вошли пробы, выявленные во всех образцах хотя бы одной из экспериментальных групп (detection p-value < 0.01). Анализ дифференциальной экспрессии проводили с использованием множественной линейной регрессии и модерированной t-статистики [12], включая оценку весов качества чтения микроматриц [13] и поправку на множественные сравнения Бенжамини-Хохберга (FDR). Значимым считали изменение уровня экспрессии гена (FC - fold change) в 1.5 раза и более при скорректированном уровне значимости p < 0.1. Функциональную аннотацию и функциональный кластерный анализ групп дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) осуществляли с помощью Web-инструмента DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) с использованием стандартных значений параметров кластеризации и уровнем обогащения EASE < 0.01 [14]. Конструирование генных сетей проводили с использованием программы STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes) 9.0 [15].
Проведение настоящего исследования одобрено комитетом по этике при ФГБУ «Научноисследовательский институт медицинской генетики» СО РАМН.
результаты
В результате проведенного нами анализа выявлены 63 гена, экспрессия которых статистически значимо различается (FDR < 0.1; FC > 1.5) в плацентарной тка-
ни женщин с ПЭ и физиологическим течением беременности (50 ДЭГ с повышенным и 13 со сниженным уровнем экспрессии). Кластер ДЭГ, экспрессия которых повышена при ПЭ, включает не только известные гены-кандидаты, выявленные ранее во многих полногеномных исследованиях профилей экспрессии генов плаценты при преэклампсии (к примеру, LEP, BHLHB2, SIGLEC6, RDH13, BCL6), но также новые потенциальные гены-кандидаты (CORO2A, SYDE1, PLIN2, CEBPA, HK2, NDRG1, ERRFI1, EFNB1, GFOD2, NCOR2, HMHA1, HERPUD1, KIF2A), связь которых с развитием ПЭ установлена либо в единичных исследованиях [16-21], либо впервые в нашей работе. Продукты некоторых из этих генов, согласно известным на сегодняшний день данным об их функциональных особенностях, вполне могут быть вовлечены в этиопатогенез ПЭ.
На рис. 2 представлена теплокарта, показывающая результаты иерархической кластеризации женщин по уровню экспрессии 63 ДЭГ. Видно, что все пациентки с ПЭ, за исключением одной, попадают в один кластер, в то время как женщины с физиологическим течением беременности - в другой. Отнесение одного образца с ПЭ в контрольную группу обусловлено, вероятно, существенной межиндивидуальной вариабельностью уровней транскрипции генов плацентарной ткани. Подобное явление наблюдали в ряде клеточных линий человека, в частности транскриптома гепатоцитов [22, 23].
В табл. 2 представлены данные о наиболее значимых ДЭГ (FC > 2, FDR < 0.01). Интерес вызывает присутствие в этом списке некоторых генов, продукты которых участвуют в регуляции транскрипции (BHLHB2, ZNF175, ANKRD37, BCL6), а также значительное повышение уровня экспрессии гена LEP и гена его рецептора SIGLEC6 при развитии ПЭ.
С целью изучения биологических процессов, связанных с развитием ПЭ, мы проанализировали ДЭГ с помощью он-лайн ресурса DAVID (рис. 3). Основные категории молекулярных функций белковых продуктов данных генов включают реакцию на различные стимулы, иммунные процессы, регуляцию клеточных коммуникаций, внутриклеточные сигнальные каскады и др. Анализ метаболических путей, в которые включены ДЭГ, указывает на возможное участие в молекулярных механизмах ПЭ путей цитотоксичности, обусловленной NK-клетками, трансэндотелиальной миграции лейкоцитов и сигнальных путей, опосредованных активаторами GTP-аз.
Для выявления возможных взаимоотношений ДЭГ был проведен анализ белок-белковых взаимодействий продуктов ДЭГ (рис. 4). Ассоциации в построенной сети основаны в основном на «text mining» (упомянутые в резюме одной статьи). Обращает
Цветовой ключ
Образцы
-2 0 2 Row Z-Score
SH3PXD2A
SYDE1
PLIN2
NDRG1
BHLHB2
LYN
ERRFI1
INSIG1
LIMCH1
SIGLEC6
RDH13
DLX5
HERPUD1
KIF2A
ITGB2
LCP1
LEP
LEP
CEBPA
SLC20A1
PLIN2
KRT19
LOC100129781
GFOD2
WDR91
PVRL4
ZNF703
IRF2BP2
NCOR2
C1ORF96
EFNB1
GPT2
C7ORF68
PLEKHA6
BCL6
NRIP1
SASH1
MGAT3
LOC642934
ARMS2
GSTA3
LOC344595
LOC647197
LOC440957
LOC730415
TMEM136
RAC2
CKLF
ZNF841
ANKRD37
HS.190748
HS.189987
HMHA1
SIGLEC6
HK2
ZNF175
CORO2A
C8ORF58
PPP1R12C
LOC650128
CYBA
TYROBP
HS.201441
Рис. 2. Теплокарта ДЭГ (FDR < 0.1; FC < 1.5). Каждый столбец представляет образец, каждая строка - ДЭГ. Розовым цветом маркированы образцы от пациенток с ПЭ, синим - от женщин контрольной группы. Цветовая шкала теплокарты обозначает отклонение нормализованного уровня экспрессии в данной ячейке от среднего по строке
на себя внимание кластер коэкспрессии, включающий гены RAC2, CYBA, ТУЯСЬР, НМНЛ1, ITGB2, ЬУЫ и LCP1. Кроме того, определенный интерес вызывают пары LEP/его рецептор SIGLEC6, эфрин и его киназа LYN.
В нашей работе выявлены также особенности дифференциальной экспрессии генов в зависимости
от степени тяжести ПЭ (табл. 3). Всего найдено восемь ДЭГ (FDR < 0.1; FC < 1.5), уровень экспрессии которых статистически значимо отличается при умеренной и тяжелой формах заболевания. Наибольший интерес, на наш взгляд, представляет BAG3, кодирующий Bcl-2-связывающий белок Bis, основная функция которого - ингибирование шаперонной ак-
82 | ACTA NATURAE | TOM 6 № 2 (21) 2014
Таблица 2. Наиболее значимые дифференциально экспрессирующиеся гены
№ Изменение уровня экспрессии FC p-уровень FDR Ген Хромо- сома Продукт гена Основные функции*
1 t 1.054 0.0007 LEP 7 Лептин Ген кодирует белок, секретируемый адипоцитами и играющий важную роль в регуляции потребления пищи и/ или расхода энергии для поддержания постоянства жировой массы. Лептин также участвует в регуляции иммунных, воспалительных реакций и процессов кроветворения, стимулировании ангиогенеза и ингибировании апоптоза.
2 1 3.84 0.0001 HS.201441 13 Длинная некодирующая РНК 284 По данным анализа ЕБТ-библиотек тканеспецифичная экспрессия гена НБ.201441 наблюдается преимущественно в плаценте и яичниках.
3 t 2.95 0.0000 BHLHE40 3 Транскрипционный фактор с доменом спираль-петля-спираль Транскрипционный фактор, модулирующий хондрогенез в рамках сАМР-сигнального пути. Вовлечен в контроль клеточной дифференцировки.
4 t 2.93 0.0031 ANKRD37 4 Повторяющийся домен анкирина 37 Кодируемый белок содержит четыре анкириновых повтора, которые являются медиаторами белок-белковых взаимодействий и вовлечены в регуляцию функционирования таких ключевых факторов транскрипции, как ЫГхВ и ТР53. Кроме того, получены данные, свидетельствующие о важной роли АТ\ГКЕБ37 в клеточном ответе на гипоксию [24].
5 t 2.91 0.0067 SIGLEC6 19 Иммуноглобулинподобный лектин 6, связывающий сиаловую кислоту Иммуноглобулинподобные лектины, связывающие сиаловые кислоты, представляют собой семейство мембранных белков типа I, которые распознают сиалированные гликаны и связываются с ними. БЮЬЕСб взаимодействует с а-2,6-связанной сиаловой кислотой клеточных мембран иммунных клеток и регулирует клеточную адгезию, таким образом, принимая участие в иммунном ответе. Кроме того, БЮ-ЬЕСб является лигандом лептина [25].
6 t 2.64 0.0006 ZNF175 19 Белок цинковых пальцев 175 Негативная регуляция экспрессии различных хемокиновых рецепторов.
7 t 2.43 0.0031 CCSAP (Clorf96) 1 Белок, локализующийся в центриоле, ресничках и веретене деления (открытая рамка считывания 96, хромосома 1) Предположительно играет роль в эмбриональном развитии.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ТОМ 6 № 2 (21) 2014 | ACTA NATURAE | 83
8 t 2.43 0.0050 GPT2 16 Аланин-аминотрансфераза 2; глутамат-пируваттрансаминаза Катализирует обратимое трансаминиро-вание между аланином и 2-оксоглутара-том с образованием пирувата и глутама-та, участвуя в метаболизме аминокислот и глюконеогенезе.
9 t 2.39 0.0050 RDH13 19 Ретинолдегидрогеназа 13 Катализирует окисление и восстановление ретиноидов, участвует в защите митохондрий от окислительного стресса.
10 t 2.36 0.0006 BCL6 3 Транскрипционный фактор - белок цинковых пальцев 51 Содержит 1\Г-концевой РОЕ/ВТВ-домен и является специфичным к последовательности репрессором транскрипции. Принимает участие в модуляции БТ АТ-зависимого 1Ь-4-индуцируемого иммунного ответа с привлечением В-клеток, формировании антител и лим-фоангиогенезе.
11 t 2.33 0.0056 PLIN2 9 Перилипин 2, белок липидных капель Функция перилипина в базовых клетках заключается в стабилизации хранилищ нейтральных липидов. В активированных клетках его функции связаны с обеспечением РКА-активированного липолиза.
12 t 2.31 0.0174 NRIP1 21 Ядерный фактор RIP 140 Модулирует транскрипционную активность стероидных рецепторов, таких, как Ы113С1, ЫЕЗС2 и ЕБШ в ядре. Может действовать как репрессор или активатор транскрипции в зависимости от транскрипционных факторов, с которыми взаимодействует [26].
13 t 2.18 0.0407 HILPDA (C7orf68) 7 Индуцируемый гипоксией белок 2 (открытая рамка считывания 68, хромосома 7) Ген кодирует индуцируемый гипоксией фактор 2, который способствует внутриклеточному накоплению липидов, стимулирует экспрессию цитокинов, включая 1Ь-6, М№ и УЕСРА, усиливает рост и пролиферацию клеток.
14 t 2.18 0.0006 SYDE1 19 Белок, активирующий GTP-азу, гомолог 1 Белок семейства ИЬо СТР-аз, играющих важную роль в клеточной пролиферации, апоптозе, экспрессии генов и регуляции внутриклеточной динамики актина.
15 t 2.06 0.0050 CORQ2A 9 Коронин 2А Относится к семейству актинсвязы-вающих белков, выполняющих важные функции, связанные с клеточной подвижностью, мембранным транспортом, трансдукцией межклеточных сигналов. Показано, что коронин 2А служит медиатором То11-подобных рецепторов и принимает участие в воспалительном ответе [27].
"Информация из базы данных GeneCards (http://www.genecards.org/) с дополнениями.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
G0:0007610 Реакции активации 9%
G0:0007010 Организация цитоскелета 9%
G0:0002520
Формирование
иммунной
системы
9%
G0:0048534 Формирование кроветворных и лимфоидных органов 9%
G0:0009605 Ответы на внешние стимулы 11%
G0:0048568 Формирование эмбриональных органов
G0:0030036
Организация
актинового
цитоскелета
G0:0045321
Активация
лейкоцитов
7%
G0:0048513 Развитие органов 7%
G0:0051716 Клеточные ответы на стимулы 11%
G0:0010646 Регуляция клеточных взаимодействий 13%
G0:0042221 Ответы на химические стимулы 14%
Рис. 3. Основные биологические процессы, в которые вовлечены ДЭГ, ассоциированные с преэклампси-ей (р < 0.05). Процентное соотношение указывает долю идентифицированных ДЭГ, связанных с данным процессом
Рис. 4. Белок-белковые взаимодействия продуктов ДЭГ. Белки представлены на рисунке в виде кругов, цвет линии между которыми указывает на категорию доказательства белок-белковых взаимодействий: желтый - литературные данные («text mining»), черный - согласно анализу коэк-спрессии генов, фиолетовый - результаты экспериментальных работ, голубой - свидетельства, полученные из баз данных, розовый - совокупные доказательства
тивности комплекса HSP70/HSC70 и HSPA1A, кодирующего высококонсервативный белок теплового шока 70 (HSP70).
Сравнительный анализ профилей экспрессии генов в ткани плаценты у женщин с умеренно выраженной формой ПЭ и в контрольной группе выявил 56 транскриптов 52 генов, уровни транскрипции ко-
торых статистически значимо различаются в этих выборках. Более выраженными были изменения профиля экспрессии при тяжелой форме ПЭ: обнаружено значительное повышение экспрессии 55 и снижение экспрессии 35 генов по сравнению с физиологической беременностью (рис. 5). Необходимо отметить, что наряду с небольшим количеством
Таблица 3. Список генов, дифференциально экспрессирующихся (FDR < 0.1; FC < 1.5) при умеренной и тяжелой формах преэклампсии
Ген Изменение уровня экспрессии FC р-уровень FDR Продукт гена
HSPAlA т 6.44 0.079549 Белок теплового шока 70, HSP70-1A
BAG3 т 2.14 0.073131 Вс1-2-ассоциированный атаноген 3
SNHG8 т 1.78 0.04105 Малая ядрышковая РНК 8
LOC729660 і 2.63 0.010437 Нет данных
LOC728457 і 2.43 0.010437 Нет данных
APOCl і 2.28 0.04433 Аполипопротеин С1
LOC40l357 і 2.27 0.010399 Нет данных
LOCl00l28326 і 1.92 0.079549 Нет данных
Таблица 4. Основные биологические процессы, в которые вовлечены дифференциально экспрессирующиеся гены, характерные для тяжелой формы преэклампсии
Категории биологических процессов Ген р*
Процессинг и представление пептидов или полисахаридных антигенов молекулами МНС класса II (G0:0002504) HLA-DPA1, CD74, HLA-DMA, HLA-DRA 0.0421
Процессинг и презентация экзогенных пептидных антигенов (G0:0002478) HLA-DMA, CD74, HLA-DRA 0.0453
Шаперон-опосредованный фолдинг белков (G0:0051085) ERO1L, HLA-DMA, CD74 0.0467
Посттрансляционный фолдинг белков de novo (G0:0051084) ERO1L, HLA-DMA, CD74 0.0478
Реакции с участием несвернутых белковых молекул (G0:0006986) ERO1L, HSPH1, HSPAlA, HERPUD1 0.0489
*Уровень значимости с поправкой на множественные сравнения Бенжамини-Хохберга, характеризующий правильность отнесения данного набора генов к определенному биологическому процессу.
общих генов (21 ген), дифференциально экспрессирующихся как при тяжелой, так и при умеренной ПЭ, более 60 ДЭГ были специфичны только для тяжелой формы этой патологии. Результаты функциональной аннотации данных генов в WEB-ресурсе DAVID указывают на ряд биологических процессов, статистически значимо ассоциированных с развитием тяжелой формы ПЭ, таких, как процессинг и представление пептидных или полисахаридных антигенов и фолдинг белков (табл. 4). Анализ метаболических путей, в которые вовлечены эти гены, также свидетельствует о важной роли механизмов процессинга и презентации антигенов в молекулярном патогенезе тяжелой формы ПЭ (согласно базам данных KEGG и BIOCARTA).
ОБСУЖДЕНИЕ
Плацента - ключевой компонент в понимании физиологических процессов, связанных с беременностью. Характеристика генов, важных для функционирования плаценты, необходима для понимания механизмов, лежащих в основе нормальной и патологической гестации. Результаты настоящей работы свидетельствуют о принадлежности идентифицированных ДЭГ к ряду биологических процессов, связанных с иммунными реакциями, межклеточным взаимодействием и ответами на различные стимулы. Необходимо отметить, что анализ, проведенный с помощью модуля для кластеризации функциональных аннотаций («functional annotation clustering») биоинформатиче-ского ресурса DAVID, позволил выделить 16 класте-
Тяжелая преэклампсия
Рис. 5. Диаграмма Венна, показывающая результаты определения профиля экспрессии генов при умеренно выраженной и тяжелой формах преэклампсии и при физиологической беременности. ДЭГ - гены, которые по-разному экспрессируются у женщин с преэклампсией и при физиологическом течении беременности (контрольная группа). Стрелка показывает повышение (Т) или снижение (4-) экспрессии генов
ров, однако только один из них имеет коэффициент обогащения («enrichment score») более 2. Этот кластер включает пять генов (KRT19, RAC2, LIMCH1, BCL6, LCP1), вовлеченных в биологические процессы, связанные с организацией актинового цитоскелета (G0:0030036; G0:0030029; G0:0007010). Изучение функциональной роли актинового цитоскелета представляет собой одно из актуальных направлений в изучении механизмов передачи сигнала в клетке. За последние несколько лет опубликованы многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о включении актина в регуляцию экспрессии генов, опосредованную его участием в процессе элонгации транскрипции, сборке преинициаторного комплекса, созревании и экспорте мРНК, реорганизации хроматина и др. [28, 29]. Интересным в данном контексте представляется повышение уровня экспрессии гена CORO2A, продукт которого, коронин 2А, входит в семейство актинсвязывающих белков и опосредует Coro2A/актинзависимый механизм дерепрессии генов воспалительного ответа [27].
Нами не найдено ассоциации развития ПЭ с такими каноническими путями, как нарушение процессов апоптоза и ангиогенеза, описанной в ряде работ [16, 19, 30, 31]. Возможно, это связано с межэтнической вариабельностью профилей экспрессии генов в ткани плаценты, обусловленной популяционной дифференциацией регуляторных участков генома, либо с различными критериями (объем выборок, срок родов, степень тяжести заболевания и т.п.), использованны-
ми при формировании групп обследуемых. Другой фактор, влияющий, по-видимому, на возникновение этих противоречий, - различная плацентарная локализация биоптата, использованного в отдельных исследованиях транскриптома при ПЭ. Так, методом высокопроизводительного секвенирования (ИПА-Seq) выявлены значительные различия в профилях экспрессии генов в амнионе, хорионе и децидуальной оболочке плаценты человека [32]. Ранее подобные результаты были получены при анализе на микроматрицах паттернов транскриптома в различных участках плаценты [33].
Несмотря на вышеописанные различия в результатах функциональной аннотации ДЭГ, интересным представляется тот факт, что изменение уровня экспрессии некоторых ДЭГ, идентифицированных в нашей работе, описано также в других исследованиях (табл. 5).
Так, значительное повышение экспрессии гена LEP при преэклампсии наблюдали практически во всех полногеномных исследованиях профилей экспрессии генов в плацентарной ткани. Лептин, продукт данного гена, является одним из новых сывороточных маркеров ПЭ. Известно, что лептин относится к ади-поцитспецифическим цитокинам, регулирующим энергетический обмен и участвующим в различных метаболических и нейроэндокринных процессах [39]. По показателям веса и индексу массы тела обследованная нами группа пациенток с ПЭ не отличалась статистически значимо от контрольной группы, у них отсутствовала патологическая прибавка веса на протяжении беременности, в связи с чем можно предположить, что вклад лептина в развитие ПЭ определяется другими функциями этого белка. Известно, что плацентарный лептин принимает участие в обеспечении притока питательных веществ к фетоплацентарному комплексу и индуцирует пролиферацию трофобласта путем ингибирования апоптоза [40, 41]. Таким образом, увеличение уровня лептина в плаценте может быть компенсаторным механизмом, направленным против эндотелиальной дисфункции, наблюдаемой при ПЭ. В то же время показано, что лептин участвует в активации симпатоадрена-ловой системы, которая способствует возникновению артериальной гипертензии, основного симптома ПЭ
[42]. Кроме того, обнаружена важная иммуномодулирующая функция лептина, которая также может вносить вклад в развитие патологии беременности
[43]. Несмотря на активное изучение экспрессии гена LEP, только отдельные работы посвящены анализу наследственной вариабельности этого гена и ее роли в изменении уровня транскрипции и структуре подверженности к патологии беременности. Показано, что у носителей генотипа АА локуса ^2167270
Таблица 5. Выявленные в настоящей работе дифференциально экспрессирующиеся гены, ассоциация которых с преэклампсией была показана ранее при изучении транскриптома плацентарной ткани
№ Ген Продукт гена FC Уровень значимости Этническая выборка Ссылка
1 LEP Лептин 10.94 < 0.0001* Японцы [30]
8.58 0.036* Китайцы [34]
40.11 1.35 х 10-9 Европеоиды [16]
5.52 0.0020 Европеоиды Афроамериканцы Монголоиды Испанцы [18]
108.9 < 0.0001 Европеоиды [35]
4.4 < 0.0001 Корейцы [36]
> 1.5 < 0.05 Китайцы [37]
11.79 < 0.01* Жители США [38]
2 BCL6 Транскрипционный фактор - белок цинковых пальцев 51 1.78 0.0154 Европеоиды Афроамериканцы Монголоиды Испанцы [18]
2.02 0.0024 Японцы [30]
2.24 3.58 х 10-5 Европеоиды [16]
2.60 < 0.01* Жители США [38]
> 1.5 < 0.05 Китайцы [37]
3 SIGLEC6 Иммуноглобулинподобный лектин 6, связывающий сиаловую кислоту 0.02* Жители США [31]
2.13 0.001 Европеоиды [16]
2.73 < 0.01* Жители США [38]
> 1.5 < 0.05 Китайцы [37]
4.5 0.019 Европеоиды [35]
4 RDH13 Ретинолдегидрогеназа 13 - 3.86 х 10-8* Жители США [31]
1.91 < 0.01* Жители США [38]
> 1.5 < 0.05 Китайцы [37]
5 NDRG1 Цитоплазматический белок суперсемейства гидролаз 2.02 0.0001 Японцы [30]
2.67 1.12 х 10-5 Европеоиды [16]
6 BHLHE40 Транскрипционный фактор с доменом спираль-петля-спираль 1.95 0.0004 Японцы [30]
3.08 2.18 х 10-5 Европеоиды [16]
7 KRT19 Кератин 19 1.75 0.0071 Японцы [30]
2.28 1.59 х 10-5 Европеоиды [16]
8 GPT2 Аланинаминотрансфераза 2 2.45 3.70 х 10-5 Европеоиды [16]
9 PPP1R12C Регуляторная субъединица 12A фосфатазы 1 - 2.16 х 10-8* Жители США [31]
10 CEBPA CCAAT/энхансерсвязывающий белок а - 2.52 х 10-8* Жители США [31]
11 HK2 Гексокиназа типа 2 3.90 3.87 х 10-6 Европеоиды [16]
12 HMHA1 Минорный антиген гистосовместимости HA1 - 1.23 х 10-8* Жители США [31]
13 PVRL4 Нектин 4 2.54 3.62 х 10-5 Европеоиды [16]
14 SASH1 SAM- и SH3-доменсодержащий белок 1 2.54 1.22 х 10-7 Европеоиды [16]
15 SH3PXD2A SH3- и PX-доменсодержащий белок 2А >1.5 < 0.05 Китайцы [37]
16 SYDE1 Белок, активирующий GTP-азу, гомолог 1 1.55 < 0.01* Жители США [38]
*Уровень значимости, рассчитанный с поправкой на множественные сравнения.
(G19A), расположенного в области промотора гена LEP, повышен уровень экспрессии этого гена в крови, а также риск развития ПЭ и артериальной гипертензии [44]. В чешской популяции обнаружена ассоциация другого полиморфизма - G2548A, локализованного в промоторе гена LEP, с гестационным диабетом [45]. Наряду с этим, в ряде работ [37, 46, 47] выявлено значимое гипометилирование данного локуса, а также нарушение регуляции эпигенома плацентарной ткани при развитии ПЭ.
Особый интерес в контексте роли эпигенетической дисрегуляции в формировании данной патологии представляет наблюдаемое в нашей работе повышение экспрессии гена длинной некодирующей РНК 284 в плацентарной ткани пациенток с ПЭ. Недавно показано, что длинные нкРНК выполняют в клетках жизненно важные регуляторные функции. В частности, предполагается, что они могут функционировать в качестве модульного скаффолда при специфичной высокоупорядоченной организации рибонуклеопро-теидных комплексов и индукции эпигенетических изменений этих локусов. Некоторые из длинных нкРНК могут связывать хроматин при помощи ремоделирующих ферментов, а затем принимать участие в модификации локального хроматина, например при метилировании ДНК, инициируя или репрессируя транскрипцию. РНК данного класса могут включаться в связывание транскрипционных факторов и ингибирование экспрессии генов [48].
Интересной представляется ассоциация гиперэкспрессии генов BAG3 и HSPA1A с развитием тяжелой формы ПЭ. Известно, что белковый продукт гена BAG3 конкурирует с кошапероном Hip за связывание с АТР-азным доменом комплекса HSP70/HSC70 и таким образом ингибирует шаперонную активность белка теплового шока 70 (Hsp70) - продукта гена HSPA1A, экспрессия которого существенно повышена при тяжелой форме ПЭ (более чем в 6 раз по сравнению с умеренно выраженной ПЭ и в 8 раз по сравнению с контрольной выборкой). Известно, что Hsp70 выполняет различные функции, основные из которых - повышение устойчивости аппарата биосинтеза белка к повреждающим воздействиям и шаперонная активность. Кроме того, получены данные об участии Hsp70 в транспорте белков, проведении внутриклеточного сигнала и протеасомозависимой деградации [49]. Необходимо отметить, что по результатам функциональной аннотации ДЭГ основными процессами, характерными для развития тяжелой формы ПЭ являются процессинг и представление пептидных и полисахаридных антигенов и шаперон-опосредованный фолдинг белков. Поскольку белок теплового шока Hsp70 способен образовывать комплексы с нефолди-рованными белками и широким спектром пептидных
фрагментов, предшественников антигенных пептидов, представленных на клеточной мембране в составе молекул МНС классов I и II [50], логично предположить, что ключевую роль в патогенезе тяжелой ПЭ играют механизмы иммунологического контроля инвазии трофобласта в стенку матки и факторы иммунологической толерантности в системе мать-плод, патологическое действие которых, как известно, может приводить к осложненному течению беременности. Кроме того, многие белки теплового шока обладают иммунорегуляторной активностью, стимулируют созревание дендритных клеток и являются индукторами некоторых провоспалительных цитокинов [51]. Эти свойства белков также могут вносить свой вклад в механизмы тяжелой ПЭ.
Обнаруженное в настоящей работе статистически значимое снижение экспрессии гена АРОС1 при тяжелой форме ПЭ, вероятно, связано с развитием окислительного стресса в сосудах плаценты либо с недавно открытыми иммуносупрессорными свойствами аполипопротеина С1, кодируемого данным геном [52]. Ранее было показано, что в сыворотке крови пациенток с преэклампсией повышена концентрация триглицерид-богатых липопротеинов, которые могут способствовать развитию эндотелиальной дисфункции [53, 54]. В то же время содержание аполипопро-теинов Е и А1 в крови снижено при развитии данной патологии [55, 56]. Кроме того, показана протектив-ная роль аллеля е2 гена АРОЕ в популяции курдов, связанная, по мнению авторов работы [57], с высокими антиоксидантными свойствами этого аллеля. Нами не найдены сведения об ассоциации полиморфных вариантов гена АРОС1 с осложненным течением беременности, однако, показано, что инсерционно-делеционный полиморфизм в положении -317 про-моторной области данного гена (ге11568822) связан с болезнью Альцгеймера, а маркер ге4803770 - с ишемической болезнью сердца [58, 59]. Поскольку ген АРОС1 расположен в одном кластере с геном АРОЕ, предполагается, что эти ассоциации обусловлены сильным неравновесием по сцеплению между данными генами [60]. Тем не менее нами не найдено статистически значимых изменений уровня экспрессии гена АРОЕ, поэтому логично рассматривать ген АРОС1 в качестве «самостоятельного» нового гена-кандидата ПЭ. Однако это предположение нуждается в подтверждении.
Таким образом, в настоящей работе получены данные, косвенно подтверждающие иммунологическую гипотезу развития тяжелой формы ПЭ, которая постулирует ключевую роль иммунокомпетент-ных клеток (В-лимфоцитов, моноцитов, дендритных и ПК-клеток) в патофизиологии этого заболевания. В рамках этой теории предполагается, что пусковым
механизмом в этиопатогенезе ПЭ является недостаточная инвазия трофобласта в материнские спиральные артерии, связанная со сниженной экспрессией антигенов HLA и «агрессией» со стороны NK-клеток. В результате снижается плацентарная перфузия и возникает гипоксия на границе мать/плод, которая, в свою очередь, инициирует запуск провоспали-тельных цитокинов, что приводит к эндотелиальной дисфункции [61]. В-клетки также могут вносить свой вклад в развитие преэклампсии, продуцируя аутоантитела против адренорецепторов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представленная работа - первое в России полногеномное исследование дифференциальной экспрессии генов в тканях плаценты при физиологическом и осложненном течении беременности. Полученные результаты свидетельствуют о некоторых процессах, которые могут играть важную роль в молекулярном патогенезе ПЭ: реакции, связанные с иммунным ответом, организацией цитоскелета, межклеточным взаимодействием, ответами на различные стимулы и шаперон-опосредованным фолдингом белков. Интеграция результатов функциональной аннотации ДЭГ, анализа сетевых взаимодействий белков, кодируемых этими генами, и изучения транскриптома плацентарной ткани позволяют выделить ряд новых генов, потенциально связанных с ПЭ: LEP, SIGLEC6, BHLHE40, BCL6, RDH13, HSPH1, HSPA1A, BAG3, KRT19, RAC2, LIMCH1, BCL6 и LCP1.
Также в нашей работе получены данные, указывающие на значительную роль в развитии тяжелой
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Marigorta U.M., Navarro А. // PLoS Genet. 2013. V. 9. № 6. P e1003566.
2. Manolio T.A., Collins F.S., Cox N.J., Goldstein D.B., Hin-dorff L.A., Hunter D.J., McCarthy M.I., Ramos E.M., Cardon L.R., Chakravarti A., et al. // Nature. 2009. V. 461. № 7265.
P. 747-753.
3. Saccone S.F., Rice J.P., Saccone N.L. // Genet Epidemiol. 2006. V. 30. № 6. P. 459-470.
4. Adzhubei I.A., Schmidt S., Peshkin L., Ramensky V.E., Gerasimova A., Bork P., Kondrashov A.S., Sunyaev S.R. //
Nat. Methods. 2010. V. 7. № 4. P. 248-249.
5. Nicolae D.L., Gamazon E., Zhang W., Duan S., Dolan M.E., Cox N.J. // PLoS Genet. 2010. V. 6. № 4. P. e1000888.
6. Zhong H., Yang X., Kaplan L.M., Molony C., Schadt E.E. // Am. J. Hum. Genet. 2010. V. 86. № 4. P 581-591.
7. Макаров О.В., Волкова Е.В., Джохадзе Л.С. // Рос. вестн. акушера-гинеколога. 2012. № 1. С. 35-42.
8. Айламазян Э.К., Мозговая Е.В. Гестоз: теория и практика. М.: МЕДпресс-информ, 2008. 272 с.
9. George E.M., Granger J.P. // Expert Rev. Obstet. Gynecol.
2010. V. 5. № 5. P. 557-566.
формы ПЭ окислительного стресса, индуцирующего повышение экспрессии генов белков теплового шока Hsp70 и Hsp105, вовлеченных в молекулярные механизмы, связанные с нарушением иммунологической толерантности и запуском провос-палительного каскада. В то же время наблюдаемое повышение экспрессии гена BAG3, вероятно, связано с компенсаторными механизмами либо с ан-тиапоптотическими свойствами белка, кодируемого данным локусом. Это предположение подтверждается статистически значимым повышением экспрессии белков теплового шока Hsp70 и Hsp90, фактора теплового шока 1 (HSF1) и антиапоптоти-ческого фактора Bcl-2 в эндотелиальных клетках плаценты пациенток с преэклампсией по сравнению с женщинами с нормотензивной беременностью [62]. Кроме того, значимость индуцируемых стрессом белков, в том числе и Hsp70, в патогенезе ПЭ показана при анализе протеома плацентарной ткани женщин с физиологической и осложненной беременностью [63].
Результаты представленной работы могут быть полезны для понимания молекулярных механизмов ПЭ, поиска новых генов-кандидатов и биомаркеров данной патологии, а также дают информацию для разработки таргетной терапии этого заболевания. •
Работа поддержана ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» (соглашение № 8118) и РФФИ (грант № 14-04-01467).
10. Naljayan M.V., Karumanchi S.A. // Adv. Chronic. Kidney Dis. 2013. V. 20. № 3. P 265-270.
11. Проект «Мать и Дитя». Гипертензия во время беременности. Преэклампсия. Эклампсия. Клинический протокол. М.: ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перина-тологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России, Институт здоровья семьи, 2012. 51 с.
12. Smyth G.K. // Stat. Appl. Genet. Mol. Biol. 2004. V. 3. № 1.
P. 1544-6115.
13. Ritchie M.E., Diyagama D., Neilson J., van Laar R., Dobrovic A., Holloway A., Smyth G.K. // BMC Bioinformatics. 2006. V. 7. P. e261.
14. Huang da W., Sherman B.T., Tan Q., Kir J., Liu D., Bryant D., Guo Y., Stephens R., Baseler M.W., Lane H.C., Lempicki R.A. // Nucl. Acids Res. 2007. V. 35. P. 169-175.
15. Szklarczyk D., Franceschini A., Kuhn M., Simonovic M.,
Roth A., Minguez P., Doerks T., Stark M., Muller J., Bork P, et al. // Nucl. Acids Res. 2011. V. 39. P. 561-568.
16. Sitras V., Paulssen R.H., Gr0naas H., Leirvik J., Hanssen T.A., Vartun A., Acharya G. // Placenta. 2009. V. 30. № 5. P. 424-433.
17. Nishizawa H., Pryor-Koishi K., Kato T., Kowa H., Kurahashi H., Udagawa Y. // Placenta. 2007. V. 28. № 5. P. 487-497.
18. Enquobahrie D.A., Meller M., Rice K., Psaty B.M., Siscovick D.S., Williams M.A. // Am. J. Obstet. Gynecol. 2008. V. 199.
№ 5. P. e1-11.
19. Founds S.A., Dorman J.S., Conley Y.P. // J. Obstet. Gynecol. Neonatal. Nurs. 2008. V. 37. № 2. P. 146-157.
20. Winn V.D., Gormley M., Paquet A.C., Kjaer-Sorensen K., Kramer A., Rumer K.K., Haimov-Kochman R., Yeh R.F., Overgaard M.T., Varki A., et al. // Endocrinology. 2009. V. 150. № 1. P. 452-462.
21. Lapaire O., Grill S., Lalevee S., Kolla V., Hosli I., Hahn S. // Fetal Diagn. Ther. 2012. V. 31. № 3. P. 147-153.
22. Rogue A., Lambert C., Spire C., Claude N., Guillouzo A. // Drug Metab. Dispos. 2012. V. 40. № 1. P. 151-158.
23. Hulse A.M., Cai J.J. // Genetics. 2013. V. 193. № 1. P. 95-108.
24. Benita Y., Kikuchi H., Smith A.D., Zhang M.Q., Chung D.C., Xavier R.J. // Nucl. Acids Res. 2009. V. 37. № 14. P. 4587-4602.
25. Lam K.K., Chiu P.C., Lee C.L., Pang R.T., Leung C.O., Koistinen H., Seppala M., Ho P.C., Yeung W.S. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. № 43. P. 37118-37127.
26. Nichol D., Christian M., Steel J.H., White R., Parker M.G. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 43. P. 32140-32147.
27. Huang W., Ghisletti S., Saijo K., Gandhi M., Aouadi M., Tesz
G.J., Zhang D.X., Yao J., Czech M.P., Goode B.L., et al. // Nature. 2011. V. 470. № 7334. P. 414-418.
28. Gettemans J., van Impe K., Delanote V., Hubert T., Vandekerckhove J., De Corte V. // Traffic. 2005. V. 6. № 10.
P. 847-857.
29. Percipalle P. // Nucleus. 2013. V. 4. № 1. P. 43-52.
30. Nishizawa H., Ota S., Suzuki M., Kato T., Sekiya T., Kura-hashi H., Udagawa Y. // Reprod. Biol. Endocrinol. 2011. V. 2.
№ 9. P. 107.
31. Tsai S., Hardison N.E., James A.H., Motsinger-Reif A.A., Bischoff S.R., Thames B.H., Piedrahita J.A. // Placenta. 2011.
V. 32. № 2. P. 175-182.
32. Kim J., Zhao K., Jiang P., Lu Z.X., Wang J., Murray J.C., Xing Y. // BMC Genomics. 2012. V. 27. № 13. P. 115.
33. Sood R., Zehnder J.L., Druzin M.L., Brown P.O. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 14. P. 5478-5483.
34. Meng T., Chen H., Sun M., Wang H., Zhao G., Wang X. // OMICS. 2012. V. 16. № 6. P. 301-311.
35. Varkonyi T., Nagy B., Fйle T., Tarca A.L., Karaszi K., Schon-leber J., Hupuczi P., Mihalik N., Kovalszky I., Rigo J. Jr., et al.
// Placenta. 2011. V. 32. Suppl. S21. P. 9.
36. Lee G.S., Joe Y.S., Kim S.J., Shin J.C. // Arch. Gynecol. Obstet. 2010. V. 282. № 4. P. 363-369.
37. Xiang Y., Cheng Y., Li X., Li Q., Xu J., Zhang J., Liu Y., Xing Q., Wang L., He L., Zhao X. // PLoS One. 2013. V. 8. № 3. P. e59753.
38. Winn V.D., Gormley M., Fisher S.J. // Pregnancy Hypertens.
2011. V. 1. № 1. P. 100-108.
39. Denver R.J., Bonett R.M., Boorse G.C. // Neuroendocrinology. 2011. V. 94. № 1. P. 21-38.
40. Domali E., Messinis I.E. // J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 2002. V. 12. № 4. P. 222-230.
41. Laivuori H. // Front. Biosci. 2007. V. 12. P. 2372-2382.
42. Aizawa-Abe M. // J. Clin. Invest. 2000. V. 105. P. 1243-1252.
43. Fairfax B.P., Vannberg F.O., Radhakrishnan J. // Hum. Mol. Genet. 2010. V. 19. № 4. P. 720-730.
44. Sugathadasa B.H., Tennekoon K.H., Karunanayake E.H. // Hypertens. Pregnancy. 2010. V. 29. P. 366-374.
45. Vasku J., Dostalova Z., Kankova K. // J. Obstet. Gynec. 2008. V. 34. № 5. P. 858-864.
46. Jia R.Z., Zhang X., Hu P., Liu X.M., Hua X.D., Wang X., Ding
H.J. // Int. J. Mol. Med. 2012. V. 30. № 1. P. 133-141.
47. Hogg K., Blair J.D., von Dadelszen P., Robinson W.P. // Mol. Cell. Endocrinol. 2013. V. 367. № 1. P. 64-73.
48. Rinn J.L., Chang H.Y. // Annu. Rev. Biochem. 2012. V. 81.
P. 145-166.
49. Евдонин А.Л., Медведева Н.Д. // Цитология. 2009. Т. 51.
№ 2. С. 130-137.
50. Черников В.А., Гороховец Н.В., Савватеева Л.В., Северин С.Е. // Биомед. химия. 2012. Т. 58. № 6. С. 651-661.
51. Abdulsid A., Hanretty K., Lyall F. // PLoS One. 2013. V. 8.
№ 1. P. e54540.
52. Cudaback E., Li X., Yang Y., Yoo T., Montine K.S., Craft S., Montine T.J., Keene C.D. // J. Neuroinflammation. 2012. V. 10. № 9. P. 192.
53. Cekmen M.B., Erbagci A.B., Balat A., Duman C., Maral H., Ergen K., Ozden M., Balat O., Kuskay S. // Clin. Biochem. 2003. V. 36. № 7. P. 575-578.
54. Bayhan G., KoQyigit Y., Atamer A., Atamer Y., Akkus Z. // Gynecol. Endocrinol. 2005. V. 21. № 1. P. 1-6.
55. KoQyigit Y., Atamer Y., Atamer A., Tuzcu A., Akkus Z. // Gynecol. Endocrinol. 2004. V. 19. № 5. P. 267-273.
56. Catarino C., Rebelo I., Belo L., Rocha-Pereira P., Rocha S., Castro E.B., Patricio B., Quintanilha A., Santos-Silva A. //
Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2008. V. 87. № 6. P. 628-634.
57. Ahmadi R., Rahimi Z., Vaisi-Raygani A., Kiani A., Jalil-ian N., Rahimi Z. // Hypertens. Pregnancy. 2012. V. 31. № 4.
P. 405-418.
58. Drigalenko E., Poduslo S., Elston R. // Neurology. 1998. V. 51. P. 131-135.
59. Ken-Dror G., Talmud P.J., Humphries S.E., Drenos F. // Mol. Med. 2010. V. 16. № 9. P. 389-399.
60. Lucatelli J.F., Barros A.C., Silva V.K., Machado Fda S., Constantin P.C., Dias A.A., Hutz M.H., de Andrade F.M. // Neurochem. Res. 2011. V. 36. № 8. P. 1533-1539.
61. Laresgoiti-Servitje E. // J. Leukoc. Biol. 2013. V. 94. № 2.
P. 247-257.
62. Padmini E., Venkatraman U., Srinivasan L. // Toxicol. Mech. Methods. 2012. V. 22. № 5. P. 367-374.
63. Gharesi-Fard B., Zolghadri J., Kamali-Sarvestani E. // Placenta. 2010. V. 31. № 2. P. 121-125.
