CC BY
28
УДК 575.174.015.3:618.39-021.3
Е.Ю. ЮПАТОВ1, Л.И. МАЛЬЦЕВА1, О.А. КРАВЦОВА2, Д.Р. ВАЛИЕВА2, Е.Е. СОЛДАТОВА3
1 Казанская государственная медицинская академия — филиал РМАНПО МЗ РФ, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 36
2Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18 3Казанский государственный медицинский университет МЗ РФ, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49
Особенности экспрессии генов ICAM1, VCAM1 и HIF1 у женщин с физиологическим течением беременности и при синдроме потери плода
Юпатов Евгений Юрьевич — кандидат медицинских наук, доцент кафедры акушерства и гинекологии № 1, тел. +7-917-873-87-21, e-mail: evguenii@yahoo.com
Мальцева Лариса Ивановна — доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой акушерства и гинекологии № 1, тел. +7-905-314-40-51, e-mail: laramalc@mail.ru,
Ольга Александровна Кравцова — кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии, тел. +79-17-293-75-43, e-mail: okravz@yandex.ru
Валиева Динара Рафилевна — студентка Института фундаментальной медицины и биологии, тел. +7-937-625-77-73, e-mail: valieva1895@gmail.com,
Солдатова Екатерина Евгеньевна — студентка, тел. +7-906-110-51-13, e-mail: www.katrinka.95@bk.ru
В статье представлены результаты когортного проспективного исследования 71 женщины с физиологически протекающей беременностью и синдромом потери плода. Концентрацию маркеров клеточной адгезии определяли на 22-24-й, 32-34-й неделях беременности, отдельно у первобеременных и повторнобеременных женщин. В результате исследования определено, что экспрессия гена гипоксии у повторнобеременных HIF1A растет с прогресси-рованием беременности, похожая динамика наблюдается и в отношении молекулы адгезии ICAM1. Однако у первобеременных в первой половине гестации экспрессия HIF1A выше, чем к концу беременности, а концентрация ICAM1, напротив, возрастает к третьему триместру беременности. Изучение маркеров гипоксии HIF1A, ICAM1, VCAM-1 необходимо для понимания механизмов возникновения акушерской патологии у беременных женщин, прежде всего с варикозным расширением вен малого таза, которое может быть физиологическим явлением. Ключевые слова: молекулы клеточной адгезии, потери беременности, ICAM1, VCAM-1, HIF1.
E.Yu. YUPATOV1, L.I. MALTSEVA1, O.A. KRAVTSOVA2, A.M. MAZITOVA2, D.R. VALIEVA2, E.E. SOLDATOVA3
1Kazan State Medical Academy — Branch Campus of the RMACPE MOH Russia, 36 Butlerov Str., Kazan, Russian Federation, 420012
2Kazan (Volga region) Federal University, 18 Kremlevskaya Str., Kazan, Russian Federation, 420008 3Kazan State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, 49 Butlerov Str., Kazan, Russian Federation, 420012
Features of the expression of ICAM1, VCAM1 and HIF1 genes in women with a physiological course of pregnancy and fetal loss syndrome
'7 (108) сентябрь 2017 г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ^ 73
Yupatov E.Yu. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of Obstetrics and Gynecology №1, tel. +7-917-873-87-21, e-mail: evguenii@yahoo.com
Maltseva L.I. — D. Med. Sc., Professor, Head of the Department of Obstetrics and Gynecology №1, tel. +7-905-314-40-51, e-mail: laramalc@mail.ru Kravtsova OA — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of Biochemistry and Biotechnology of Institute of Fundamental Medicine and Biology, tel. +7-917-293-75-43, e-mail: okravz@yandex.ru
Valieva D.R. — student of Institute of Fundamental Medicine and Biology, tel. +7-937-625-77-73, e-mail: valieva1895@gmail.com Soldatova E.E. — student, tel. +7-906-110-51-13, e-mail: www.katrinka.95@bk.ru
Results of a cohort prospective study of 71 women with uncomplicated pregnancy and fetal loss syndrome are presented in article. Concentration of markers was defined in the 22-24th, 32-34th weeks of pregnancy, in primigravidas and multigravidas separately. As a result of a research it is defined that the hypoxia gene expression at the multigravidas of HIF1A grows with pregnancy progressing, similar dynamics is observed also concerning a molecule of adhesion ICAM1. However, at the prima-gravidas in the first half of a gestation the expression of HIF1A is higher than by the end of pregnancy, and on the contrary, concentration of ICAM1 increases to the third trimester of pregnancy. The study of hypoxia markers HIF1A, ICAM1, VCAM-1 is necessary for understanding the mechanisms of obstetrical pathology in pregnant women, primarily with varicose veins of the pelvis, which can be a physiological phenomenon.
Key words: cell adhesion molecules, pregnancy loss, ICAM1, VCAM1, HIF1.
Беременность с первых дней ее наступления связана с изменениями в гемодинамике женского организма, которые необходимы для поддержания метаболических потребностей не только матери, но и плода. Изменения в гемодинамике, ассоциированные с беременностью, включают: повышение объема плазмы, частоты сердечных сокращений (ЧСС), минутного объема сердца; вазодилатацию маточных артерий, понижение сосудистого сопротивления и артериального давления на всем протяжении гестационного периода. Весь комплекс этих изменений необходим для правильного развития плаценты, дальнейшая функция которой будет связана с экспрессией различных ангиоген-ных факторов. При нормальном физиологическом развитии плаценты на ранних сроках происходит инвазия вневорсинчатого цитотрофобласта в спиральные артерии децидуальной оболочки матки и миометрия. Эти клетки замещают эндотелиальный слой маточных сосудов, трансформируя их из сосудов с небольшим сопротивлением в сосуды с высоким емкостным сопротивлением. К концу второго триместра беременности маточные спиральные артерии покрыты исключительно клетками цитотро-фобласта и эндотелиальные клетки больше не присутствуют в области эндометрия и прилегающего к нему миометрия. Такая трансформация сосудов обеспечивает увеличение маточного кровотока, необходимого для поддержания жизнеобеспечения плода на протяжении всей беременности [1].
Что же происходит, если трансформация спиральных артерий остается незаконченной? Инвазия артерий цитотрофобластом ограничивается внешней децидуальной оболочкой, замещение эндоте-лиальных клеток миометрия фетальными клетками не происходит. В сосудах плаценты остается ключевой источник сосудистой патологии — эндотелий, который становится мишенью для различных повреждающих факторов. Как известно, нарушение функции эндотелия является одним из маркеров поражения сердечно-сосудистой системы [2].
В современной литературе уделяется достаточно большое внимание сосудисто-эндотелиальным факторам роста [2]. Однако не проведена четкая дифференцировка источника проблемы — артериальной и венозной систем. Известно, что изменения в венозной системе матери в виде расширения вен
происходят у всех женщин в результате адаптации организма к состоянию беременности. В то же время у части беременных как будто физиологическое расширение вен сопровождается увеличением частоты тяжелых осложнений. Что является основой для этих осложнений — дисфункция эндотелия артерий или венозная гипоксия остается неясным. В связи с этим для исследования были выбраны молекулы адгезии, которые экспрессируются преимущественно в эндотелии вен и не определяются в нормальных условиях — ICAM1 и VCAM1. Молекула клеточной адгезии ICAM-1 присутствует в низкой концентрации на мембранах лейкоцитов и эндоте-лиальных клеток. При стимуляции цитокинами экспрессия ICAM-1 на цитоплазматической мембране резко увеличивается. ICAM-1 является лигандом интегринового рецептора LFA-1, обнаруживаемого на лейкоцитах, которые при активации связываются с эндотелием посредством комплекса ICAM-1/ LFA-1 и проникают в ткань [3].
Васкулярная молекула клеточной адгезии VCAM-1, белок, входящий в суперсемейство иммуноглобулинов, играет значительную роль в иммунной системе человека [4]. VCAM-1 участвует в адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам [5]. Одновременно для получения более полного представления о функции эндотелия сосудов матери была изучена экспрессия транскрипционного фактора HIF1, обеспечивающего адаптацию клеток к условиям гипоксии, повышение экспрессии некоторых ростовых факторов, влияющих на развитие плаценты в ответ на гипоксию [6]. Кроме этого, HIF-1 изменяет экспрессию генов, контролирующих транспорт глюкозы и гликолиз, что позволяет адаптироваться клеткам к условиям гипоксии [6].
Цель исследования — определение концентрации транскрипционного фактора HIF1 и маркеров активации эндотелия — ICAM1, VCAM1 в сыворотке крови беременных женщин на различных сроках гестации при физиологически протекающей беременности и осложненной синдромом потери плода.
Материал и методы
Исследование проведено на базах кафедры акушерства и гинекологии № 1 Казанской государственной медицинской академии — филиала РМАНПО
Минздрава России в сотрудничестве с кафедрой биохимии и биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального университета.
Так как экспрессия HIF1A, ICAM1 и VCAM1 может меняться в зависимости от срока гестации у здоровых беременных, экспрессия молекул клеточной адгезии определялась в I, II и III триместрах беременности. Были обследованы 71 здоровая женщина и 19 с синдромом потери плода (СПП), имевшие в анамнезе привычное невынашивание и недонашивание беременности. Женщины с физиологическим течением беременности были разделены на 2 группы: 40 пациенток на сроках 16-26 недель составили первую группу, 31 — на 32-38-й неделе — вторую. Первобеременных женщин было 28, повторнородящих — 43. По частоте и характеру экстрагенитальных заболеваний, данным общеклинического обследования первобеременные и повторнобеременные достоверно не различались; 86 % повторнобеременных имели в анамнезе один и более медицинский аборт, 53,4 % — отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (преэкламп-сия, аномалии сократительной деятельности матки, самопроизвольные аборты), у трех беременных имелся рубец на матке.
Из 19 женщин с СПП 11 имели 19-22 недели гестации, 8 — 29-34 недели. Предыдущая беременность у 21 % этих женщин прервалась в первой половине беременности, у 79 % — преждевременные роды произошли в третьем триместре, 26,3 % имели рубец на матке после кесарева сечения в предыдущую беременность. Текущая беременность у 42 % женщин осложнилась преэклампсией умеренной степени тяжести.
Выделение тотального препарата РНК проводили из 100 мкл цельной крови, взятой с антикоагулянтом ЭДТА в конечной концентрации 5 мМ с использованием TRiZol (Invitrogen, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Для количественной оценки выделенных образцов РНК использовали спектро-фотометрический метод на NanoPhotometer P360 (IMPLEN, Германия). Для синтеза кДНК проводили реакцию обратной транскрипции с коммерческим набором MMLV RT kit (Евроген, Россия). Для анализа экспрессии генов ICaM и HIF1A применяли метод ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (BioRad, США) с коммерческими наборами зондов и праймеров согласно протоколу фирмы-производителя (Applied Biosystems, США). В качестве ре-ференсного гена использовали ген бета-актина (АСТВ) [7].
Расчет относительного уровня экспрессии целевых генов проводили на основе результатов количественного ПЦР-анализа в реальном времени. Количественное содержание кДНК, соответствующей транскриптам целевых и референсных генов, оце-
нивали по разности значений порогового цикла реакции (Ct) для каждого образца. Каждую реакцию повторяли в двух аналитических анализах. Определение уровня экспрессии целевых генов проводили относительно референсного гена бета актина. При обработке результатов полимеразной цепной реакции использовали метод 2-ДДСТ, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия целевых генов у исследуемых групп по сравнению с группой контроля. ДДО рассчитывалось как ДДО: = ДО: (исследуемой группы) — ДО: (группы контроля) и каждое значение ДО: = ДО: (целевого гена) — ДО: (ACTB), согласно Livak К. и Schmittgen Г.
Достоверность различий определялась с использованием непараметрического статистического критерия Стьюдента (:-теста), различия считались достоверными при р <0,05. Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов средствами программ Microsoft Excel 2010.
Результаты исследования
Показатели экспрессии молекул клеточной адгезии в первом и втором триместрах беременности представлены в табл. 1.
Как следует из представленных данных, у обследованных женщин в третьем триместре беременности наблюдается повышенная экспрессия молекулы клеточной адгезии 1ОАМ1 — в 6,1 раза, что позволяет предположить развитие эндотелиальной дисфункция вен с течением беременности. Это создает предпосылки для гипоксии и сосудистого воспаления, на фоне которого возникают акушерские осложнения.
Подтверждением развития тканевой гипоксии и активации эндотелия вен служат достоверные (р>0,01) различия экспрессии HIF1A в I-II и III триместрах беременности — из данных таблицы видно, что экспрессия гена в III триместре гестации выше в 9,7 раз, чем в первой половине беременности.
По данным литературы, в плаценте человека при физиологическом течении беременности экспрессия гена HIF1A максимально выражена на ранних сроках гестации, что обеспечивает устойчивость клеток к физиологической гипоксии, имеющей место в этом периоде беременности. При формировании преэклампсии экспрессия гена HIF1A повышается в начале третьего триместра, причем это наблюдается раньше появления клинических признаков [8].
При увеличении экспрессии гена HIF1A отмечено повышение экспрессии адгезивных молекул, так как гипоксия ведет к развитию эндоте-лиальной дисфункции. Кроме того, при гипоксии продукты плацентарной дисфункции попадают в кровоток матери, вызывая иммунный ответ, что также приводит к увеличению экспрессии молекул адгезии.
Таблица 1.
Относительный уровень экспрессии генов HIF1A и ICAM в зависимости от срока гестации
Исследуемая группа HIFlA ICAM1
RQ 95 % ДИ* t-test** RQ 95 % ДИ t-test
I-II триместр (n=40) i 0,7412-2,8641 0,0007 1 0,695-7,6585 0,0062
III триместр (n=31) 9,7828 4,7118-9,0899 6,1169 3,4007-7,6585
* — 95 % доверительные интервалы для значения RQ
** — уровень значимости для 2-стороннего критерия Стьюдента
АКУШЕРСТВО. ГИНЕКОЛОГИ
'7 (108) сентябрь 2017 г. ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА jA 75
Таблица 2.
Относительный уровень экспрессии генов HIF1A и ICAM1 у первобеременных и повторнобеременных женщин
Исследуемая группа HIF1A ICAM1
RQ 95% ДИ* t-test** RQ 95% ДИ t-test
I-II триместр
Первая беременность n=28 1 0,3348-0,5033 0,0113 1 0,5245-1,1029 0,0406
Повторная беременность n=43 1,5923 0,5415-0,8206 0,2141 0,1051-0,2063
III триместр
Первая беременность n=28 1 0,5145-1,0598 0,0441 1 0,3603-0,5633 0,0296
Повторная беременность n=43 0,2581 0,1536-0,3792 3,8906 1,9158-3,7744
* — 95 % доверительные интервалы для значения RQ
** — уровень значимости для 2-стороннего критерия Стьюдента
Таблица 3.
Относительный количественный анализ экспрессии HIF1A и ICAM1 у беременных с синдромом потери плода в анамнезе и первобеременных женщин
Исследуемая группа HIF1A ICAM1
RQ 95 % ДИ* t-test** RQ 95 % ДИ t-test
Здоровые беременные n=71 1 0,7035-1,3191 0,5285 1 0,3228-0,4767 0,0452
СПП n = 19 0,4477 0,2434-0,5335 1,1444 0,0712-0,1882
* — 95 % доверительные интервалы для значения RQ
** — уровень значимости для 2-стороннего критерия Стьюдента
Исследователи отмечают, что риск развития осложнений беременности, таких как преэклампсия, задержка развития плода, привычная потеря беременности, выше у женщин с первой беременностью, чем у повторнобеременных [9]. Исходя из этого, целесообразно раздельно оценить результаты исследования генов у женщин с физиологическим течением беременности с первой и повторной беременностью (табл. 2).
Из табл. 2 следует, что различия экспрессии генов Н^1А и ICAM1 достоверны для групп женщин с первой и повторной беременностью на ранних и поздних сроках гестации (р>0,01). Оказалось, что в первом триместре у повторнобеременных женщин достоверно увеличение экспрессии молекулы клеточной адгезии ICAM1 на фоне снижения экспрессии гена Н^1А (р>0,01). По-видимому, адаптация организма матери к условиям гипоксии с каждой последующей беременностью ухудшается, а причин для развития гипоксии становится больше, что увеличивает риск развития осложнений беременности на фоне эндотелиальной дисфункции.
По некоторым данным, увеличение экспрессии гена HIF1A на ранних сроках гестации чаще наблюдается у женщин с повторной беременностью, чем у женщин, беременных в первый раз [9, 10]. Возможно, это связано с тем, что адаптация к гипоксии на ранних сроках у повторнобеременных женщин происходит медленнее, чем у первобеременных.
Сегодня внимание исследователей привлекает частое осложнение беременности — синдром потери плода (СПП). Однако его связь с эндотелиальной дисфункцией пока остается до конца не изученной [10]. Проведенное нами исследование позволило увидеть различия экспрессии гена Н^1А и ICAM1 у женщин, имевших в анамнезе потери беременности (табл. 3).
Из представленных данных видно, что экспрессия молекулы ICAM1 у женщин с синдромом потери плода достоверно выше, чем у здоровых беременных (р<0,05). Растворимая форма sICAM-1, так же как и поверхностная форма, сохраняет способность связываться с LFA-1. Отсюда, учитывая возможность конкурентного связывания секреторной формы sICAM-1 с интегрином LFA-1, экспрессированном на поверхности циркулирующих иммунокомпетент-ных клеток, можно предположить, что слущивание рецепторов с поверхности клеток плаценты является природным защитным механизмом, предотвращающим адгезию иммунокомпетентных клеток матери к клеткам плаценты.
В отличие от ICAM1, говорить о различиях в уровне экспрессии гена Н^1А в исследуемых группах представляется сложным. Наблюдается тенденция к снижению экспрессии Н^1А в группе женщин с потерей плода, что свидетельствует об отсутствии гипоксии при данной патологии. По литературным данным, гипоксия не играет существенной роли в развитии СПП [11].
Активность гена VCAM1 не была обнаружена ни в одной исследуемой группе. VCAM-1 считается маркером острого эндотелиоза, и отсутствие его экспрессии дает возможность предположить, что патологические процессы у обследованных женщин еще не достигли своей острой фазы [12].
Обсуждение
Физиологическое течение беременности помимо внешних факторов зависит во многом от функционального состояния сосудистой системы. Полноценная функция артериального и венозного компонента обеспечивает правильное функционирование плаценты, развитие плода. Основная система регуляции работы сосудов — это эндотелий. Транскрипционный фактор Н^1А, молекулы адгезии 1САМ1 и VCAM1 являются регуляторами состояния эндотелия.
Часть обследованных женщин не имели акушерской патологии, поэтому повышение экспрессии гена Н^1А в первом триместре можно считать физиологической реакцией. Так, например, в экспериментах на крысах было показано, что причиной экспрессии Н^1А является гипертрофия сердечной мышцы, развивающаяся при беременности, и связанные с этим фактом изменения в сердечном метаболизме.
У женщин с СПП данную реакцию можно расценивать как необходимую для экспрессии генов адаптации клеток к гипоксии. А если учесть, что беременность сопровождается варикозным расширением вен малого таз и молекулы клеточной адгезии не экспрессирутся эндотелием артерий, можно предположить, что именно венозная гипоксия является одним из пусковых факторов акушерской патологии.
Роль венозной гипоксии подтверждается повышением экспрессии гена 1САМ1, который преимущественно выявляется на эндотелии вен и свидетельствует об адгезии лейкоцитов на эндотелии и, как следствие, — повреждение структуры венозной стенки.
Очевидно, что на ранних сроках гестации будет наблюдаться небольшой уровень экспрессии молекулы 1САМ1, так как изменения венозной гемодинамики только еще развиваются, в то время как к третьему триместру экспрессия 1САМ1 возрастает, особенно у женщин с повторной беременностью. Вероятно, риск развития акушерской патологии, связанной с эндотелиальной дисфункцией и венозной гипоксией, возрастает с каждой последующей беременностью.
В заключение можно сделать выводы, что изучение маркеров гипоксии Н^1А, 1САМ1, VCAM-1
необходимо для понимания механизмов возникновения акушерской патологии у беременных женщин, прежде всего, с варикозным расширением вен малого таза, которое может быть физиологическим явлением. У женщин с нормально протекающей беременностью за счет варикозного расширения вен малого таза возникает необходимость компенсировать гипоксию, для чего постепенно увеличивается экспрессия гена гипоксии HIF1A. Возможно, именно венозная гипоксия нарушает функцию почек, создавая условия для преэклампсии на поздних сроках беременности. Однако для точного представления роли данных маркеров в развитии акушерской патологии необходимы дальнейшие исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Maynard S. Preeclampsia and Angiogenic Imbalance / S. Maynard, F.H. Epstein, S.A. Karumanchi // Annu. Rev. Med. — 2008. — V. 59. — P. 61-78.
2. Шевченко Ю.Л. Дисфункция и повреждение эндотелия (патофизиология, диагностика, клинические проявления и лечение) / Ю.Л. Шевченко, Ю.М. Стойко, В.Г. Гудымович. — М.: Лика,
2015. — 166 с.
3. Yang L. / «ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow» // Yang L, Froio RM, Sciuto TE, Dvorak AM, Alon R, Luscinskas FW. (July 2005) // Blood 106 (2): 584-92.
4. Du W. VCAM-1+ placenta chorionic villi-derived mesenchymal stem cells display potent pro-angiogenic activity. / Du W, Li X, Chi Y, Ma F, Li Z, Yang S, Song B, Cui J, Ma T, Li J, et al. // Stem Cell Res Ther. — 2016. — 7:49.
5. Toma L. Glycated LDL increase VCAM-1 expression and secretion in endothelial cells and promote monocyte adhesion through mechanisms involving endoplasmic reticulum stress / L. Toma, G.M. Sanda, M. Deleanu, Stancu CS Sima AV. // Mol Cell Biochem. —
2016. — Jun; 417(1-2):169-79.
6. Wang G.L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. / G.L. Wang,
B.H. Jiang, E.A. Rue, G.L. Semenza // Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92:5510-5514.
7. Livak K.J. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real- Time Quantitative PCR and the 2-AACt Method / K.J. Livak, T.D. Schmittgen // Methods. — 2001. — Vol. 25(4) — P. 402-408.
8. Caniggia I. Hypoxia inducible factor-1: Oxygen regulation of trophoblast differentiation in normal and preeclamptic pregnancies / I. Caniggia, J.L. Winter // Placenta. — 2002. — V. 16. — P. 47-57.
9. Ali S.M. Genetic, immune and vasoactive factors in the vascular dysfunction associated with hypertension in pregnancy / S.M. Ali, R.A. Khalil // Expert Opin. Ther. Targets. — 2015. — V. 19(11). — P. 1495-1515.
10. Foidart J.M. Dysregulation of anti-angiogenic agents (sFlt-1, PLGF, and sEndoglin) in preeclampsia-a step forward but not the definitive answer / J.M Foidart, J.P. Schaaps, F. Chantraine, C. Munaut, S. Lorquet // J. Reprod. Immunol. — 2009. — V. 82. — P. 106-111.
11. Подзолкова Н.М. Эндотелиальная дисфункция — дополнительный фактор развития синдрома потери плода у пациенток с тромбофилией. Пути коррекции / Н.М. Подзолкова, Г.А. Суханова, С.С. Мондоева // Проблемы репродукции. — 2009. — № 6. —
C. 65-7.
12. Бицадзе В.О. Тромбофилия как важнейшее звено патогенеза осложнений беременности / В.О. Бицадзе, А.Д. Макацария, Д.Х. Хизроева, Н.А. Макацария, Е.В. Яшенина // Практическая медицина. — 2012. — №5. — С. 22-29.
