CC BY
23
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТИПИРОВАНИИ ПАТОГЕНОВ
развитии ИКБ, уровень которых выше у пациентов без мигрирующей эритемы и коррелирует с развитием специфического антибактериального гуморального иммунного ответа. Полученные данные говорят о перспективности дальнейшего изучения цирДНК крови в качестве дополнительного диагностического крите-
рия развития боррелиоза при безэритемных формах его течения.
Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-01066-а, проектом № 5.25 Программы 21 фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки -медицине».
ХАРАКТЕРИСТИКА РИККЕТСИЙ ПРИБАЙКАЛЬЯ И МОНГОЛИИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ФРАГМЕНТОВ ГЕНОМА
М.А. Хаснатинов, Г.А. Данчинова, А.С. Каверзина, А.А. Шишпаренок, А.В. Ляпунов, С.С. Шулунов, Д. Абмэд*, Ж. Бата*, Д. Цэрэнноров**, Д. Отгонбаатар** Институт эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН, Иркутск, *Национальный центр по изучению природно-очаговых инфекций, Улан-Батор, Монголия, **Центр по изучению природно-очаговьх инфекций, Ховд, Монголия
Иксодовые клещи являются переносчиками нескольких тяжелых заболеваний человека. Из них наиболее значимыми для здравоохранения и опасными для людей являются клещевой энцефалит - КЭ (ежегодно порядка 10 000 случаев заболеваний в мире), клещевой боррелиоз (КБ) - болезнь Лайма, клещевой риккетсиоз (КР) и сравнительно недавно открытые заболевания - гранулоцитарный анаплазмоз (ГАЧ) и мо-ноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ).
Регионы Прибайкалья (прежде всего Иркутской области и Республики Бурятия) и Монголия в последние годы характерны тем, что здесь формируются многочисленные районы активного рекреационного освоения. Интенсивный туристический обмен и транзит обуславливает важность эпидемиологического мониторинга данных территорий, в том числе и в отношении клещевых инфекций.
И в Прибайкалье, и в Монголии самыми распространенными и массовыми видами являются таежный клещ Ixodes persulcatus и степные клещи Dermacentor silvarum и D. nuttalli. В конце ХХ - начале XXI века нами было доказано наличие природных очагов КЭ и КБ на территории Северной Монголии, дана их эколого-эпи-демиологическая характеристика, а также проведены работы по идентификации вируса КЭ и Borrelia burgdorferi sensu lato в клещах I. persulcatus.
Целью настоящей работы является анализ распространенности и разнообразия микроорганизмов порядка Rickettsiales в Прибайкалье и Монголии.
Методы. Для выявления и идентификации микроорганизмов использовали ПЦР-анализ с последующим секвенированием полученных фрагментов генома и филогенетическим анализом нуклеотидных последовательностей. Выделение ДНК производили с использованием соответствующих наборов производства «Амплисенс» (Москва). ДНК риккетсий выявляли в ПЦР с помощью праймеров к гену rOmpA, специфичных для представителей рода Rickettsia, а также с прай-мерами к гену 16S rRNA, специфичных для представителей пор. Rickettsiales.
Результаты. В Иркутской области и Республике Бурятия было отловлено и проанализировано 62 осо-
би клещей Dermacentor nuttalli, 92 особи D.silvarum и 261 особь I.persulcatus. Зараженность риккетсиями составила 75 % среди клещей D.nuttalli, 64 % среди D.silvarum и 26 % среди клещей I.persulcatus. На наличие эрлихий и анаплазм исследовано 263 клеща I.persulcatus и 87 суспензий печени мелких млекопитающих. В 35 (13,3 %) клещах и 11 (12,6 %) образцах от грызунов обнаружена ДНК эрлихий и/или анаплазм. Кроме того, проанализировано 309 клещей родов Ixodes и Dermacentor, отловленных в лесных и лесостепных ландшафтах на территории Селенгинского, Центрального и Булганского аймаков Монголии. Более чем три четверти степных клещей были инфицированы риккетсиями (78 %). Зараженность клещей I.persulcatus составила риккетсиями - 46 % и микроорганизмами семейства Anaplasmataceae - 43 %. При этом инфицированность клещей рода Dermacentor микроорганизмами семейства Anaplasmataceae была значительно ниже, чем таежных клещей, и составила соответственно 2 %.
Для идентификации микроорганизмов порядка Rickettsiales были определены и проанализированы следующие нуклеотидные последовательности:
- 29 фрагментов гена rOmpA от клещей рода Dermacentor;
- 20 фрагментов гена rOmpA от клещей I.persu-lcatus;
- 10 фрагментов гена 16S rRNA от клещей I.per-sulcatus.
Филогенетический анализ полученных последовательностей показал, что клещи Dermacentor в Прибайкалье инфицированы двумя видами риккетсий - R. rao-ultii и R. sibirica, причем доля R. sibirica составила лишь 3,5 процента. Отмечено, что R. raoultii представлена двумя вариантами - DnS14 (прототип Khabarovsk) и DnS28 (прототип Elanda) с преобладанием варианта DnS14 (70 %). В клещах из Монголии к настоящему времени обнаружна только R. raoultii, вариант DnS14.
Риккетсии, инфицирующие клещей I.persulcatus в Прибайкалье и Монголии, принадлежат к одному виду и имеют идентичную структуру гена rOmpA. Нуклео-тидная последовательность фрагментов этого гена
НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК
наиболее близка, но не идентична R.canadiensis (85 % сходства).
Анализ фрагментов гена 16S rRNA, полученных с праймерами к микроорганизмам пор. Rickettsiales, выявил значительное их разнообразие в клещах I.per-sulcatus. Структура гена 16S rRNA трех образцов из Прибайкалья была идентична Candidatus R. tarasevichae. Еще 4 образца были идентифицированы как бактерии рода Pseudomonas. Анализ 3 фрагментов гена 16S rRNA от клещей, отловленных в Монголии, позволил идентифицировать два из них как Ehrlichia muris и один -как риккетсиеподобный микроорганизм Montezuma (Медянников, 2004).
Обсуждение. В настоящей работе впервые выявлена циркуляция микроорганизмов порядка Ricket-tsiales на территории Монголии, охарактеризовано их видовое разнообразие. Также получена новая ин-
формация о распространенности и структуре населения риккетсий в Прибайкалье. В ходе исследований было установлено, что порядка 70 % клещей рода Dermacentor и 25 % клещей LpersukaШs в Прибайкалье и Монголии заражены риккетсиями и родственными им микроорганизмами. Ранее в ряде исследований было показано, что любой из обнаруженных нами микроорганизмов способен инфицировать человека и вызывать заболевания различной степени тяжести. Поэтому при проведении профилактических, диагностических и лечебных мероприятий в отношении клещевых инфекций в Прибайкалье и Монголии необходимо принимать в расчет возможность заражения человека этими микроорганизмами.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 08-04-90206-Монг_а.
ПРИМЕНЕНИЕ ПАНЕЛИ ЛОКУСОВ ТАНДЕМНЫХ ПОВТОРОВ ПЕРЕМЕННОЙ КОПИЙНОСТИ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ COXIELLA BURNETII
Ю.А. Панферова, Н.К. Токаревич
ФБУН «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера», Санкт-Петербург
Метод мультилокусного анализа тандемных повторов переменной копийности (MLVA) применяется в мировой практике для типирования штаммов С. burnetii с целью мониторинга за циркуляцией отдельных генотипов патогена на определенной территории и возможности установления источника инфекции. В настоящее время создание баз данных с учетом территориальной распространенности генотипов С. burnetii является достаточно острой проблемой в связи с существованием энзоотических очагов коксиеллезной инфекции на территории России и республик бывшего СССР, а также в связи с возможностью проникновения «новых» генотипов (в том числе обладающих высокой патогенно-стью) из удаленных регионов.
Целью данного исследования являлся анализ распределения аллелей локусов, содержащих тандемные повторы переменной копийности, и выбор панели ло-кусов, позволяющих дифференцировать штаммы различного географического происхождения как возможного инструмента для молекулярно-эпидемиологиче-ского мониторинга Ку-лихорадки в очагах.
Материалы и методы. Было исследовано 11 штаммов C.burnetii коллекции штаммов НИИ ЭМ им. Пастера. Штаммы были выделены на территории России (группа штаммов Луга, в том числе Ixodes-3, Cimex-2, Жел-тогорлая мышь; штаммы Ленинград-2, Вологда-2, Уфа-1), Казахстана (Казахстанский-4, Чередов), МНР (Монголия-1), Западной Европы (Henzerling) в период с 1945 по 1987 г., а также штамм М44 (аттенуиро-ванный вариант штамма Грита, применяющийся в России в качестве живой вакцины Ку-лихорадки). В качестве референса был выбран штамм Henzerling; в настоящее время полная последовательность данного штам-
ма опубликована, поэтому длины локусов VNTR для него были рассчитаны с помощью базы данных тандемных повторов прокариот (http://mimsatellites.u-psud.fr). Выделение ДНК проводили методом лизиса с использованием гуанидинизотиацианата с последующей ну-клеосорбцией. Для проведения амплификации использовали термоциклер MyCycler (BioRad) в режимах, обеспечивающих специфичность реакции для каждой пары праймеров.
Для проведения анализа было выбрано 7 локусов мини- и микросателлитных тандемных повторов различной длины мотива (единицы повтора), копийности и локализации в геноме (характеристика локусов представлена в табл. 1).
Для оценки потенциальной возможности применения данного метода генотипирования без выделения чистой культуры коксиелл было проведено исследование MLVA органов белых мышей на 7-й день после инфекции (внутрибрюшинное заражение суспензией штаммов Вологда-2 и Чередов, 2х107 кл). Проведен анализ тотальной ДНК, выделенной из суспензии почек и селезенки, после подтверждения наличия в пробах ДНК C.burnetii методом ПЦР с видоспецифичными праймерами.
Путем анализа парных аллельных отличий локу-сов VNTR с помощью метода «объединения ближайших соседей» была создана дендрограмма; родство между штаммами было установлено путем вычисления коэффициента сходства (UPGMA). Для оценки дискрими-нативной способности было также проведено сравнение кластеризации штаммов коксиелл при исследовании их методом MLVA и методом мультилокусного сиквенс-типирования, проведенного для тех же штаммов ранее (Glazunova O., Roux V., et al., 2005).
