CC BY
21
равнивали с использованием программы ClustalW (Larkin et al., 2007). Поиск гомологии полученных нукле-отидных последовательностей с уже известными последовательностями фрагментов геномов ВКЭ проводили с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/). Для сравнения использовали последовательности генов E и NS1 штаммов ВКЭ, относящихся к различным генетическим типам, из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). Филогенетический анализ проводили с помощью программы MEGA 5 (Tamura et al., 2011). Оценку достоверности построенных филогенетических древ осуществляли с помощью бутстрэп-анализа.
Определение видов клещей молекулярно-гене-тическими методами. Для молекулярно-генетического определения клещей видов I.persulcatus Schulze, 1930 и I.pavlovskyi Pomerantsev, 1946 использовали разработанные системы видоспецифичных праймеров, соответствующих последовательностям фрагмента гена субъединицы 1 цитохром-оксидазы, полученных из базы данных GenBank. В качестве матрицы использовали смеси ОТ.
Результаты и обсуждение. Выявляли вирусные РНК и генотипирование положительных образцов из индивидуальных клещей, собранных на территории ННЦ в 2007-2010 гг. либо с людей, обратившихся по поводу укуса в пункт вакцинопрофилактики ЦКБ СО РАН в 2009-2010 гг.
Положительные по ВКЭ образцы выявляли методом двухраундовой ПЦР с праймерами, соответствующими фрагментам генов E-NS1, причем было показано, что вирус обнаруживается как в самках, так и в самцах иксодовых клещей. Затем для ряда образцов были определены нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов генов E-NS1 ВКЭ длиной 341 п.н. Анализ последовательностей, соответствующих вариантам вируса, выявленным в индивидуальных клещах, показал доминирование ВКЭ сибирского генетического типа с уровнем гомологии 89-98 % последовательностям прототипных штаммов Васильченко и Заусаев на территории ННЦ; также сибирский генотип выявлялся в иксодовых клещах, собранных с людей после укуса.
Далее проводили филогенетический анализ полученных последовательностей. Методом UPGMA было
показано, что исследуемые варианты ВКЭ, относящиеся к сибирскому генотипу, разделяются на 3 подтипа -подтипы Васильченко, Заусаев и подтип, не описанный ранее, что наблюдалось прежде и в коллекции штаммов ВКЭ, собранных на территории ННЦ в 1981-2011 гг. (Ткачев и др., 2010, 2011). Два образца ВКЭ, выявленные в индивидуальных иксодовых клещах с территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра, относились к дальневосточному генотипу и один - к западноевропейскому. Ранее нами было показано, что в крови пациентов, госпитализированных после укусов клещей, с различными формами клещевого энцефалита, несмотря на доминирование сибирского генотипа в клещах, выявлялся дальневосточный генотип ВКЭ (Tka-chev et al., 2008), что, вероятно, может быть связано с особенностями патогенеза различных вирусных генотипов.
Интересен факт единичного обнаружения за последние несколько лет исследований западноевропейского генотипа ВКЭ на территории ННЦ. Ранее данный генотип в Западной Сибири был найден на территории Алтая (Demina et al., 2010) и, по всей видимости, может встречаться и на соседних территориях либо заноситься на них в силу активного перемещения населения в результате туристической деятельности.
С использованием систем праймеров, соответствующих фрагменту гена субъединицы 1 цитохром-окси-дазы иксодовых клещей, было показано, что ВКЭ выявлялся как в клещах I.persulcatus, так и в клещах I.pav-lovskyi, причем как в клещах, собранных флагированием, так и в снятых после укусов людей, что, вероятно, может указывать на вовлеченность обоих видов клещей в перенос вируса.
Таким образом, на территории Новосибирского научного центра и прилегающих к нему областей были выявлены преимущественно сибирский (подтипы Заусаев, Васильченко и подтип, не описанный ранее) генотип и, в единичных случаях, дальневосточный и западноевропейский генетические типы ВКЭ. Показано, что вирус выявляется как в самках и самцах клещей I.persulcatus, так и I.pavlovskyi.
Работа поддержана междисциплинарным интеграционным проектом СО РАН № 63 и заказным интеграционным проектом СО РАН № 6.
ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ДНК КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ
О.С. Шкода, Н.В. Фоменко, Е.Д. Чикова, Е.С. Морозкин, В.А. Милейко, В.В. Власов, П.П. Лактионов, Е.Ю. Рыкова
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск
Цель работы. Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) характеризуется различными формами развития и опасен тем, что его хроническое течение может приводить к серьезным осложнениям. Поэтому актуальным является выявление маркеров, пригодных как для ранней диагностики заболевания с целью приня-
тия решения о назначении своевременного лечения, так и в качестве маркеров хронизации процесса. Одним из критериев постановки диагноза ИКБ является возникновение мигрирующей эритемы (МЭ) в месте укуса клеща. Однако встречаются безэритемные формы ИКБ, что затрудняет правильную постановку диагноза. В таких
НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК
случаях важная роль отводится лабораторным методам исследования, направленным на выявление в крови специфических антител к антигенам (АГ) боррелий. Ранее было показано, что внеклеточные ДНК, циркулирующие в крови (цирДНК), присутствуют в норме в невысоких концентрациях, тогда как при онкологических и аутоиммунных патологиях их количество и состав изменяются. В настоящей работе проведен анализ изменения концентрации цирДНК в норме и при различных формах ИКБ, оценена их взаимосвязь с наличием специфических антител к Borrelia burgdorferi s.l., а также значимость выявленных изменений как дополнительных факторов для диагностики.
Материалы и методы. В исследование включены образцы крови 60 здоровых лиц, отрицавших факт присасывания клеща за последние 3 года, и 61 пациентов, поступивших в городскую инфекционную клиническую больницу № 1 (ГИКБ № 1) г. Новосибирска с признаками инфекционного заболевания и последующим диагнозом ИКБ. Диагноз ИКБ был поставлен на основании эпидемиологического анамнеза (присасывание клеща), клинических симптомов, наличия МЭ и по результатам лабораторных тестов (выявление антител классов IgG и IgM к АГ боррелий). Венозную кровь собирали в пробирки <^асиейе-К3Е» с 0,5 М ЭДТА (Австрия) и разделяли на плазму и клетки крови. Фракцию цирДНК, связанных с клеточной поверхностью (скп-цирДНК), получали последовательной обработкой клеток 5 мМ-фосфатным буфером, содержащим ЭДТА (ФБ-ЭДТА), и 0,125 %-ным раствором трипсина, как описано ранее. ДНК выделяли из 1 мл плазмы, 3 мл ФБ-ЭДТА фракции и 1 мл трипсиновой фракции с помощью наборов «Blood DNA Isolation Kit» фирмы «BioSilica Ltd.» (г. Новосибирск, Россия). Концентрацию цирДНК крови определяли с использованием количественной ПЦР в режиме реального времени, специфичной к участкам повторяющихся последовательностей LINE-1 человека. Выявление в крови ранних (IgM) и поздних (IgG) антител к возбудителям ИКБ проводилось методом ИФА с использованием коммерческих наборов «Боррелиоз-ИФА-Комби» ООО «Omnix» (г. Санкт-Петербург, Россия).
Результаты. Группу больных с эритемной формой ИКБ составили 48 человек, из которых 34 человека характеризовались отсутствием как поздних (IgG), так и ранних (IgM) антител к АГ боррелий на момент забора крови. 14 человек с эритемной формой ИКБ и 13 человек с отсутствующей эритемой (группа с безэритемной формой ИКБ) имели ранние или одновременно ранние и поздние антитела к Borrelia burgdorferi s.l. по данным ИФА.
Показано, что группа больных с диагнозом ИКБ достоверно отличалась по концентрации циркулирующих в крови внеклеточных ДНК от здоровых лиц (табл. 1). У заболевших ИКБ выявлено достоверное увеличение концентрации цирДНК, связанных с клеточной поверхностью (скп-цирДНК), как в случае развития мигрирующей эритемы, так и при безэритемной форме болезни (P<0,0001 и P<0,0001 соответственно, критерий Манна-Уитни).
В настоящей работе выявлено достоверное увеличение концентрации скп-цирДНК у пациентов с без-эритемной формой ИКБ по сравнению с контрольной группой, а также по сравнению с больными с МЭ (P=0,018 и P<0,0001 соответственно). Уровень цирДНК плазмы также значительно увеличен в группе пациентов с безэритемным течением заболевания относительно пациентов с эритемной формой ИКБ и здоровых лиц (P=0,004 и P<0,0001 соответственно).
Больные с ИКБ (как с эритемной, так и безэритемной формой) были разделены на две группы по наличию в плазме крови противоборрелиозных антител. Обнаружено, что среднее значение концентрации скп-цирДНК в группе больных с ИКБ, имеющих специфические антитела к АГ боррелий, достоверно превышало аналогичный показатель у больных без выявленных противоборрелиозных антител (см. табл. 1). В то же время в плазме крови не выявлено достоверных различий между этими группами. Таким образом, развитие специфического гуморального иммунного ответа на боррели-озную инфекцию достоверно ассоциировано с увеличением концентрации скп-цирДНК крови.
В настоящей работе впервые показано достоверное увеличение концентрации цирДНК крови при
Таблица 1
Концентрация цирДНК в крови больных с ИКБ и здоровых лиц
Группы Количество Скп-цирДНК крови (нг/мл) Критерий Манна-Уитни ЦирДНК плазмы крови (нг/мл)* Критерий Манна-Уитни
Здоровые 60 13,4±4,1 P<0,0001 2,7±2,5 P=0,08
Больные с ИКБ 61 98,5±14,5 9,9±2,6
Эритемная форма ИКБ 48 72,2±10,8 P=0,018 7,4±2,5 P=0,004
Безэритемная форма ИКБ 13 195,4±47,2 19,4±8,0
«+» АТ к АГ боррелий 27 130,2±21,7 P=0,015 9,6±3,18 P=0,49
«-» АТ к АГ боррелий 34 71,7±18,7 10,2±4,06
*Примечание: представлены средние значения и средняя квадратичная ошибка.
развитии ИКБ, уровень которых выше у пациентов без мигрирующей эритемы и коррелирует с развитием специфического антибактериального гуморального иммунного ответа. Полученные данные говорят о перспективности дальнейшего изучения цирДНК крови в качестве дополнительного диагностического крите-
рия развития боррелиоза при безэритемных формах его течения.
Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-01066-а, проектом № 5.25 Программы 21 фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки -медицине».
ХАРАКТЕРИСТИКА РИККЕТСИЙ ПРИБАЙКАЛЬЯ И МОНГОЛИИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ФРАГМЕНТОВ ГЕНОМА
М.А. Хаснатинов, Г.А. Данчинова, А.С. Каверзина, А.А. Шишпаренок, А.В. Ляпунов, С.С. Шулунов, Д. Абмэд*, Ж. Бата*, Д. Цэрэнноров**, Д. Отгонбаатар** Институт эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН, Иркутск, *Национальный центр по изучению природно-очаговых инфекций, Улан-Батор, Монголия, **Центр по изучению природно-очаговьх инфекций, Ховд, Монголия
Иксодовые клещи являются переносчиками нескольких тяжелых заболеваний человека. Из них наиболее значимыми для здравоохранения и опасными для людей являются клещевой энцефалит - КЭ (ежегодно порядка 10 000 случаев заболеваний в мире), клещевой боррелиоз (КБ) - болезнь Лайма, клещевой риккетсиоз (КР) и сравнительно недавно открытые заболевания - гранулоцитарный анаплазмоз (ГАЧ) и мо-ноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ).
Регионы Прибайкалья (прежде всего Иркутской области и Республики Бурятия) и Монголия в последние годы характерны тем, что здесь формируются многочисленные районы активного рекреационного освоения. Интенсивный туристический обмен и транзит обуславливает важность эпидемиологического мониторинга данных территорий, в том числе и в отношении клещевых инфекций.
И в Прибайкалье, и в Монголии самыми распространенными и массовыми видами являются таежный клещ Ixodes persulcatus и степные клещи Dermacentor silvarum и D. nuttalli. В конце ХХ - начале XXI века нами было доказано наличие природных очагов КЭ и КБ на территории Северной Монголии, дана их эколого-эпи-демиологическая характеристика, а также проведены работы по идентификации вируса КЭ и Borrelia burgdorferi sensu lato в клещах I. persulcatus.
Целью настоящей работы является анализ распространенности и разнообразия микроорганизмов порядка Rickettsiales в Прибайкалье и Монголии.
Методы. Для выявления и идентификации микроорганизмов использовали ПЦР-анализ с последующим секвенированием полученных фрагментов генома и филогенетическим анализом нуклеотидных последовательностей. Выделение ДНК производили с использованием соответствующих наборов производства «Амплисенс» (Москва). ДНК риккетсий выявляли в ПЦР с помощью праймеров к гену rOmpA, специфичных для представителей рода Rickettsia, а также с прай-мерами к гену 16S rRNA, специфичных для представителей пор. Rickettsiales.
Результаты. В Иркутской области и Республике Бурятия было отловлено и проанализировано 62 осо-
би клещей Dermacentor nuttalli, 92 особи D.silvarum и 261 особь I.persulcatus. Зараженность риккетсиями составила 75 % среди клещей D.nuttalli, 64 % среди D.silvarum и 26 % среди клещей I.persulcatus. На наличие эрлихий и анаплазм исследовано 263 клеща I.persulcatus и 87 суспензий печени мелких млекопитающих. В 35 (13,3 %) клещах и 11 (12,6 %) образцах от грызунов обнаружена ДНК эрлихий и/или анаплазм. Кроме того, проанализировано 309 клещей родов Ixodes и Dermacentor, отловленных в лесных и лесостепных ландшафтах на территории Селенгинского, Центрального и Булганского аймаков Монголии. Более чем три четверти степных клещей были инфицированы риккетсиями (78 %). Зараженность клещей I.persulcatus составила риккетсиями - 46 % и микроорганизмами семейства Anaplasmataceae - 43 %. При этом инфицированность клещей рода Dermacentor микроорганизмами семейства Anaplasmataceae была значительно ниже, чем таежных клещей, и составила соответственно 2 %.
Для идентификации микроорганизмов порядка Rickettsiales были определены и проанализированы следующие нуклеотидные последовательности:
- 29 фрагментов гена rOmpA от клещей рода Dermacentor;
- 20 фрагментов гена rOmpA от клещей I.persu-lcatus;
- 10 фрагментов гена 16S rRNA от клещей I.per-sulcatus.
Филогенетический анализ полученных последовательностей показал, что клещи Dermacentor в Прибайкалье инфицированы двумя видами риккетсий - R. rao-ultii и R. sibirica, причем доля R. sibirica составила лишь 3,5 процента. Отмечено, что R. raoultii представлена двумя вариантами - DnS14 (прототип Khabarovsk) и DnS28 (прототип Elanda) с преобладанием варианта DnS14 (70 %). В клещах из Монголии к настоящему времени обнаружна только R. raoultii, вариант DnS14.
Риккетсии, инфицирующие клещей I.persulcatus в Прибайкалье и Монголии, принадлежат к одному виду и имеют идентичную структуру гена rOmpA. Нуклео-тидная последовательность фрагментов этого гена
