CC BY
61
УДК 628.394.17:665.6:576.8.095(262.54)
ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕССОВ САМООЧИЩЕНИЯ МОРСКОЙ СРЕДЫ С УЧАСТИЕМ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В РАЙОНЕ АВАРИИ ТАНКЕРА В КЕРЧЕНСКОМ ПРОЛИВЕ
© 2010 г. И.Е. Цыбульский1, И.Г. Корпакова1, Л.В. Белова1, М.А. Сазыкина2, И.С. Сазыкин2, Д.Ф. Афанасьев1, М.А. Коленко1
1Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства, 1Azov Fisheries Research Institute,
ул. Береговая, 21/2, г. Ростов-на-Дону, 344002, Beregovaya St., 21/2, Rostov-on-Don, 344002,
riasfp@aaanet.ru riasfp@aaanet.ru
2 Научно-исследовательский институт биологии 2 Research Biology Institute of Southern Federal University,
Южного Федерального утаерсишеша Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344104,
ул. Стачки, 194/1, г. Ростов-на-Дону, 344104, niib@sfedu ru
niib@sfedu.ru
Дана характеристика и определена таксономическая принадлежность ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из воды и донных отложений в районе аварийного разлива нефтепродуктов в Керченском проливе в ноябре 2007 г. Показаны изменения количественных показателей углеводородокисляющих бактериоценозов в зоне аварии и прилегающих акваториях.
Ключевые слова: нефтеокисляющие бактерии, ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов, биоремедиация, нефтепродукты, загрязнение окружающей среды.
Associations of hydrocarbon oxidizing microorganisms isolated from water and bottom sediments in the Kerch Strait where oil spill had occurred in November, 2007 were characterized and their taxonomic status was determined. Changes were shown in quantitative parameters of hydrocarbon oxidizing bacteriocenoses in the region of the accident and in the adjoining areas as well.
Keywords: oil oxidizing bacteria, associations of hydrocarbon oxidizing microorganisms, bioremediation, mineral oil products, environmental pollution.
В процессе самоочищения морей от нефтяного загрязнения ведущее положение занимает биологический фактор, решающую роль в котором играют микробиологические процессы. В результате деятельности нефтеокисляющих бактерий происходит трансформация сырой нефти, нефтепродуктов и углеводородов автохтонного происхождения до простых соединений (углекислоты и воды), накопление нового органического вещества за счет нарастания биомассы микроорганизмов, включение углеводородных компонентов в общий круговорот углеводорода [1].
Способность к окислению углеводородов обнаружена у представителей родов Pseudomonas, Achromo-bacter, Mycobacterium, Flavobacterium, Corynebacte-rium, Micrococcus, Bacillus, Vibrio, Actinomyces, Proac-tinomyces, Streptomyces [1]. Многие из них выделены из воды и донных отложений Азовского и Черного морей. Так, из воды Черного моря выделены штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов, относящиеся к родам Marinomonas, Azotobacter, Erithrobacter, Mari-nococcus, Mezophilobacter, Altheromonas, Bacillus, Mi-crobacterium, Arthorobacter, Micrococcus и Vibrio [1]. Наибольшее количество микроорганизмов выделялось в районах нефтяного загрязнения, при этом численность бактерий, растущих на нефти, доходила до 106 - 107 на 1 г донного осадка [2].
Существует тесная взаимосвязь между наличием в море микроорганизмов, растущих на углеводородах, и нефтяным загрязнением морской воды. Способность микроорганизмов использовать в качестве единственного источника углерода и энергии специфические органические соединения (в частности, углеводороды нефти) используется как метод микробной индикации нефтяного загрязнения [3, 4].
Цель настоящего исследования - характеристика процессов биотрансформации углеводородов нефти в Керченском проливе и прилегающих акваториях Азовского и Черного морей, включая выделение ассоциаций аборигенных микроорганизмов-деструкторов, участвующих в процессах биоремедиации морской среды. Естественным полигоном для изучения формирования углеводородокисляющих бактериоце-нозов в морских экосистемах явилась акватория Керченского пролива после аварийных разливов нефтепродуктов в ноябре 2007 г.
Материалы и методы исследований
Ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов выделяли из воды и донных отложений, отобранных на месте аварии танкера «Волганефть-139» и других судов в Керченском проливе в ноябре 2007 г. Пробы воды и донных отложений отбирали на южной сторо-
не косы Тузла, в зоне псевдолиторали, после загрязнения акватории пролива нефтепродуктами (мазут, дизельное топливо, льяльные воды). Нефтеокисляющие бактерии выращивали на среде Диановой-Ворошиловой [5, 6] с добавлением в качестве единственного источника углерода 0,3 и 0,6 % сырой нефти Тенгизского месторождения.
Чистые культуры нефтеокисляющих микроорганизмов получали методом пассирования на мясо-пептонном агаре (МПА), выделяя штаммы из однотипных колоний, выросших в большом количестве [7]. С целью дополнительного контроля углеводоро-докисляющей способности полученных штаммов бактерий выделенные культуры засевали в колбы со средой, где единственным источником углерода была сырая нефть.
Идентификацию выделенных штаммов проводили стандартными методами, применяемыми в микробиологии, с использованием биотестов для диагностики бактерий [8]. Оценивали культуральные признаки (размер, форма и пигментация колоний), морфологические (окраска по Граму, форма клеток, наличие спор), а также физиолого-биохимические свойства бактерий. Окрашивание микроорганизмов проводили по Граму, окраску спор - по методу Ожешко [7].
На основании полученных диагностических признаков проводилась идентификация выделенных штаммов согласно «Определителю бактерий Берджи» [9].
Динамику перестройки углеводородокисляющего бактериоценоза при попадании в экосистему углеводородов нефти в Керченском проливе и прилегающих акваториях Азовского и Черного морей оценивали по содержанию нефтеокисляющих бактерий.
Станции наблюдений расположены в Азовском море (19), Керченском проливе (12), Черном море (7). Воду для микробиологического анализа отбирали батометром на 3 горизонтах: поверхностном, 5 м и придонном. В Черном море на глубоководных станциях воду дополнительно отбирали с горизонтов 10 и 20 м. Пробы донных отложений отбирали дночерпателем Петерсена. В общей сложности проанализировано 98 проб воды и 38 - донных отложений.
Определение численности нефтеокисляющих бактерий проводили по методу Е.П. Розановой и Т.Н. На-зиной [10]. В качестве питательного субстрата применяли стерильную минеральную среду Диановой-Ворошиловой [5, 6].
Результаты и обсуждение
Из отобранных в прибрежном районе косы Тузла воды и донных отложений в общей сложности было выделено 18 штаммов нефтеокисляющих микроорга-
низмов, участвующих в биоремедиации морской среды, причем 6 штаммов микроорганизмов выделено из воды, 12 - из донных отложений. По таксономической принадлежности 4 штамма относятся к плесневым грибам, 1 - к дрожжам (класс Saccharomycetes, порядок Saccharomycetales), 13 - к бактериям.
Для идентификации были отобраны только бактериальные штаммы, так как культуры плесневых грибов при индивидуальном культивировании на среде с нефтью показали более слабый рост.
Среди выделенных микроорганизмов обнаружено 5 форм грамположительных, 7 - грамотрицательных, 2 штамма проявляли вариабельную реакцию по Граму.
По форме клеток преобладали палочкообразные: крупные, средние, короткие и тонкие палочки, как одиночные, так и собранные в цепочки. Среди кокковидных форм встречались одиночные в группах и тетрадах, сферические клетки, в виде бочонка. Преобладали подвижные формы бактерий (9 штаммов из 14). Спорообра-зующие формы микроорганизмов не обнаружены.
Установлено, что все выделенные культуры являются аэробами. Облигатно анаэробных культур не выделено, что определяется особенностями среды обитания данных микроорганизмов. 6 культур имели признаки пигментации, остальные - лишены пигментов. Из 14 выделенных культур 6 росли при температуре 42 °С, остальные - при более низких температурах. Все выделенные культуры микроорганизмов росли на МПА, большинство развивались на среде Эндо.
Биохимические признаки свидетельствуют о положительной реакции на присутствие аргининдегидрола-зы - у 6 штаммов микроорганизмов, лизиндекарбокси-лазы - у 9 и орнитиндекарбоксилазы - у 4. Все культуры являются каталазоположительными. Из 14 культур только 3 оксидазоотрицательные, остальные 9 - оксида-зоположительные. Ферменты дезаминаза фенилалани-на и уреаза у выделенных бактерий не обнаружены, положительный ответ на присутствие нитратредуктазы дали 5 штаммов. Все выделенные штаммы не могли образовывать индол и сероводород, способностью гид-ролизовать крахмал обладал 1 бактериальный штамм. Все без исключения штаммы не обладали возможностью метаболизировать инозит. Арабиноза, манноза, сорбит, маннит, сахароза, лактоза и мальтоза ферментировались различными штаммами.
Пять культур были устойчивы к левомицитину, устойчивых к полимиксину и гентамицину не обнаружено.
На основании диагностических признаков 13 культур бактерий, выделенных из проб воды и донных отложений на месте аварийного разлива нефтепродуктов в Керченском проливе в ноябре 2007 г., отнесены к 10 родам: Pseudomonas (2), Alcaligenes (2), Aci-netobacter (2), Сytophaga (1), Deleya (1), Marinococcus (1), Comamonas (1), Аcidovorax (1), Kurtia (1), Micro-ccocus (1). Один штамм был отнесен к дрожжам (порядок Saccharomycetales). Его родовая принадлежность не определена, так как точная идентификация дрожжей только на основании биохимических и морфологических признаков не возможна.
Из 8 штаммов, которые можно отнести к потенциальной ассоциации деструкторов нефти, выделенных из донных отложений, 1 относится к дрожжам (порядок Saccharomycetales), 7 культур - бактериальные
формы: Сytophaga sp., Deleya аquamarina, Marinococcus hispanicus, Alcaligenes faecalis, Alcaligenes latus, Acinetobacter calcoaceticus, Comamonas terrigena.
Потенциальная бактериальная ассоциация нефтео-кисляющих микроорганизмов, выделенных из воды, объединила в своем составе 6 штаммов: Аcidovorax delafieldii, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas f. Inters-tinalis, Kurtia gibsonii, Acinetobacter calcoaceticus, Mi-croccocus sp.
Углеводородокисляющие микроорганизмы выделялись из большинства проб воды и из всех проб донных отложений, отобранных на исследованных акваториях Керченского пролива, Азовского и Черного морей.
Общая численность нефтеокисляющих бактерий в воде изменялась в Азовском море от 0 до 1000 кл./мл и в среднем составила у поверхности 100 кл./мл на горизонте 5 м и у дна - около 5 кл./мл. Наиболее высокая численность углеводородокисляющих микроорганизмов (200+330 кл./мл) встречалась в поверхностном горизонте воды на станциях в южном, восточном и юго-восточном районах Азовского моря, включая Темрюкский залив (рис. 1).
J
- у 100- L
-
или-1-1-1-1-1-1-1-1—--—--
35.00 3550 36 00 36.50 37 00 37.50 38 00
Рис. 1. Содержание нефтеокисляющих бактерий в поверхностном горизонте воды в Керченском проливе и прилегающих акваториях Азовского и Черного морей (ноябрь-декабрь 2007 г.)
Численность углеводородокисляющих бактерий в донных отложениях Азовского моря находилась в пределах от 10 до 1000 кл./г и в среднем составила 100 кл./г. На рис. 2 хорошо видно, что наиболее высокая численность бактерий-деструкторов в донных отложениях отмечается в южной части Азовского моря, на участке, примыкающем к Керченскому проливу, где их численность на большинстве станций составила 1000 кл./г.
В воде Керченского пролива численность нефтеокисляющих микроорганизмов изменялась от 0 (в придонном горизонте некоторых станций) до 106 кл./мл. В поверхностном горизонте водной толщи численность бактерий была максимальной и в среднем по всей акватории пролива составила 3 • 104 кл./мл. С увеличением глубины титр бактерий существенно снижался (до 50+100 кл./мл). Максимально высокая численность бактерий-деструкторов нефти (на уровне 105+106 кл./мл) зарегистрирована в поверхностном горизонте воды в районе косы Тузла и Таманском заливе (по траверзу пос. Тамань). В южной части
Керченского пролива, а также в районе косы Чушка титр бактерий заметно снижался (рис. 1).
В Керченском проливе титр бактерий-деструкторов нефти был максимален - в среднем 104 кл./г при диапазоне значений от 10 до 105 кл./г. Станции, где содержание нефтеокисляющих бактерий в донных отложениях было максимальным, расположены в районе косы Тузла (северная сторона) и центральной части Таманского залива (рис. 2). В южной части Керченского пролива и в районе косы Чушка титр бактерий-деструкторов в донных отложениях был заметно ниже.
J
/ <3 ч &
-1-1-1-1-1-1-г^-
35.00 35.50 36.00 36.50 37 00 37.50 38.00
Рис. 2. Содержание нефтеокисляющих бактерий в донных отложениях в Керченском проливе и прилегающих акваториях Азовского и Черного морей (ноябрь-декабрь 2007 г.)
В воде Черного моря численность бактерий-деструкторов сравнима с их численностью в Азовском море и значительно ниже, чем в Керченском проливе. Максимальный титр бактерий также регистрировался в поверхностном горизонте водной толщи и в среднем по всей исследованной акватории составлял 200 кл./мл. В слое воды от поверхности до глубины 10 м, в районе пос. Абрау, содержание бактерий-деструкторов нефти было максимальным для этой акватории - 1000 кл./мл (рис. 1). В районе предпроливья содержание бактерий не превышало 100 кл./мл.
В Черном море средняя численность нефтеокисляющих микроорганизмов в донных отложениях составила 250 кл./г, по отдельным станциям исследованной акватории показатели численности изменялись от 100 до 1000 кл./г. В отличие от воды для донных отложений более высокая численность углеводо-родокисляющих бактерий характерна для центрального района исследованной акватории (от м. Железный рог до пос. Благовещенская) (рис. 2).
Таким образом, плотность бактерий в воде, не зависимо от района исследований, снижается от поверхностного горизонта к придонному. Максимальная их численность во всех горизонтах воды наблюдается в Керченском проливе в районе косы Тузла и в центре Таманского залива. Здесь же обнаружено максимально высокое для всего района исследований содержание нефтеокисляющих бактерий в донных отложениях.
В результате сравнительной оценки общей численности бактерий в воде и донных отложениях следует, что титр микроорганизмов сравним в воде поверхностного горизонта и в донных отложениях. В
толще воды и в придонных горизонтах плотность бактерий значительно ниже.
Высокий титр нефтеокисляющих бактерий, обнаруженный на ряде станций в Керченском проливе (на уровне 104 -И()' кл./г), может свидетельствовать об активно протекающих в поверхностном горизонте воды микробиологических процессах трансформации углеводородов нефтяного происхождения. Для донных отложений Керченского пролива также характерна максимальная интенсивность метаболизма нефтепродуктов, оцененная по количеству углеводородокисляющих бактерий. Повышенные по сравнению с другими исследованными районами показатели численности бактерий-деструкторов свидетельствуют об интенсификации процессов самоочищения. В то же время в связи с низкими температурами, общая численность нефтео-кисляющих бактерий в компонентах среды морских экосистем оставалась достаточно низкой.
Высокие количественные показатели углеводоро-докисляющего бактериоценоза отмечаются при более высоких температурах воды, присутствии в среде основного субстрата (углеводородов), достаточной обеспеченности микроэлементами и ряда других факторов. Так, летом 2007 г., в период до аварийных разливов нефтепродуктов, по нашим данным в центральном и юго-восточном районах Азовского моря численность нефтеокисляющих бактерий в воде изменялась в пределах 6 порядков (от 10 до 106 кл./мл). Самые высокие показатели численности бактерий обнаружены в придонном горизонте воды (в среднем -105 кл./мл), самые низкие - на горизонте 5 м (в среднем - 103 кл./мл). Численность нефтеокисляющих бактерий в донных отложениях заметно выше и изменялась от 104 до 108 кл./г (в среднем - 7-106 кл./г).
По данным выполняемого нами ежегодного экологического мониторинга, в мае 2008 г. в пробах воды Азовского моря, отобранных в Темрюкском заливе и в районе Керченского пролива, численность нефтео-кисляющих микроорганизмов в поверхностном горизонте оставалась достаточно высокой и составляла 4-104 кл./мл. В придонном горизонте эти показатели были ниже (на уровне 2-102 кл./мл), в донных отложениях достигали средних значений 3-105 кл./г (при диапазоне изменений от 103 до 106). Летом в воде и донных отложениях указанного района численность неф-теокисляющих бактерий несколько снизилась - средний титр бактерий в воде колебался на разных горизонтах от 3-10 до 3-103 кл/мл, в донных отложениях -2-104 кл/г (при диапазоне значений от 102 до 105).
Летом 2008 г. в воде Черного моря в районе, прилегающем к Керченскому проливу, нефтеокисляющие бактерии обнаружены на всех исследованных глубинах. До термоклина средний титр этой группы бактерий составлял 103 кл/мл с пределами колебаний от 10 до 104 кл/мл. На горизонте 100 м плотность нефтеокисляющих бактерий была ниже и составила 102 кл./мл. Осенью показатели численности углеводородокисляющего бакте-риоценоза оставались практически неизменными.
При сопоставимых значениях основных абиотических факторов, поступление дополнительного количества углеводородов в среду является основным условием, определяющим динамику перестройки гетеротрофного углеводородокисляющего бактериоцено-
за, что выражается в возрастании численности, увеличении видового разнообразия и изменении таксономического состава бактерий этой группы [1, 11, 12].
Действительно, по результатам наших наблюдений в акватории Азовского и Черного морей локально встречаются участки с высокой численностью нефте-окисляющих бактерий, расположенные в районах поступления нефтяных углеводородов. Например, в Черном море летом в районе морского нефтяного терминала КТК (пос. Южная Озереевка) уровень неф-теокисляющих бактерий в воде и донных отложениях достигал 104+108 кл./мл и 106+109 кл./г.
С другой стороны, на интенсивность окисления нефтепродуктов микроорганизмами немалое влияние оказывает температура. Для развития углеводородокисляющих бактерий и интенсификации очищения воды от нефти оптимальными являются мезофильные условия (20+28 °С). При температуре 6+15 °С интенсивность окисления нефти снижается в 2,5+4,0 раза по сравнению с оптимальной температурой [1]. При 37 °С разложение нефти также замедляется, и рост бактерий ограничивается.
Ю.П. Копытовым [13] показано, что действие температуры наиболее существенно проявляется в начальном периоде, в первые часы и сутки после внесения нефти в воду. В дальнейшем наблюдается прогрессирующее снижение как скорости процесса биодеградации нефти, так и степени влияния на него повышенных температур. Через 48 ч после начала опыта влияние температуры выше 15 °С становится незначительным либо равным нулю, а еще через сутки температура выше 25 °С может даже ингибировать биоокисление нефти. Однако во всех случаях повышение температуры с 5 до 15 °С положительно воздействует на скорость биодеградации нефти [13]. Скорее всего, температура воды не является главным лимитирующим фактором в процессе биодеградации нефти. Так, в морской воде низкой температуры, среди льдов, была зафиксирована высокая численность нефтеокисляющих микроорганизмов [14]. В Авачинской бухте при температуре воды 9,2-9,6 °С содержание неф-теокисляющих бактерий составило 1,7-104, а в районе портовых акваторий - 1,7-106 [4]. В Черном море, в районе юго-западной оконечности Крыма, численность микроорганизмов, способных расти на углеводородах нефти, составляла в среднем для зимних месяцев 100 кл./мл, для летних -1000 [1].
В наших исследованиях, несмотря на низкие температуры воды, в Керченском проливе и в Таманском заливе обнаружена наиболее высокая численность нефтеокисляющих бактерий, что может свидетельствовать о достаточно активно протекающих микробиологических процессах трансформации углеводородов, источником которых явились разлившиеся в результате аварии судов нефтепродукты (мазут, дизельное топливо). Поскольку легкие фракции нефти при нефтяных разливах в морских акваториях испаряются в первые часы либо, в зависимости от условий, первые сутки [11], источником углерода и энергии, обусловившим развитие этих форм бактерий, послужили высокомоле-
Поступила в редакцию_
кулярные фракции нефтепродуктов, мигрирующие по поверхности воды в акватории Керченского пролива через 2+3 недели после аварии. Этот вывод подтверждается достаточно высокой численностью углеводо-родокисляющих бактерий, обнаруженной нами в первые дни после аварийного разлива нефтепродуктов, преимущественно в поверхностном слое воды. Такое распределение численности бактерий этой группы не всегда характерно для Азовского моря. При более высоких температурах воды (15-20 °С) показатели численности углеводородокисляющих бактерий и, соответственно, скорость биодеградации нефтепродуктов, по данным Ю.П. Копытова [13], были бы выше, по крайней мере, в первые несколько суток после аварии.
При поступлении нефтяных углеводородов в водоем наблюдаются определенные перестройки в таксономическом составе углеводородокисляющего бакте-риоценоза [1, 11, 12]. У 13 штаммов бактерий, выделенных в ходе наших исследований, обнаружена высокая деструкционная активность по отношению к нефтепродуктам. Большинство из них относятся к известным представителям микроорганизмов углево-дородокисляющей группы, характерным для Азово-Черноморских аквальных экосистем.
Литература
1. Миронов О.Г. Нефтеокисляющие микроорганизмы в
море. Киев, 1971. 335 с.
2. Рубцова С.И., Егоров В.Н. Влияние абиотических фак-
торов на численность нефтеокисляющих бактерий в прибрежных районах Черного моря // Экология моря. 2004. Вып. 66. С. 43-49.
3. Миронов О.Г. Биологические ресурсы моря и нефтяное
загрязнение. М., 1972. 102 с.
4. Журавель Е.В., Безвербная И.П., Бузолева Л.С. Микроб-
ная индикация загрязнения прибрежных вод Охотского моря и Авачинской бухты // Биология моря. 2004. Т. 30, № 2. С. 138-142.
5. Родина А.Г. Методы водной микробиологии. М., 1965.
353 с.
6. Методы общей бактериологии. Т. 1 / под ред. Ф. Гер-
хардта [и др.] М., 1984. 536 с.
7. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробио-
логических исследований. М., 1978. 94 с.
8. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и ви-
русологическим методам исследования. М., 1973. 73 с.
9. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. / под ред. Дж. Хо-
улта, Н. Крига, П. Снита, С. Уильямса. М., 1997. 800 с.
10. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Углеводородокисляющие
бактерии и их активность в нефтяных пластах // Микробиология. 1982. Т. 51. С. 324-348.
11. Патин С.А. Экологические проблемы освоения нефтега-
зовых ресурсов морского шельфа. М., 1997. 560 с.
12. Поршнева О.В. Родококки в водных экосистемах: авто-
реф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1998. 24 с.
13. Копытов Ю.П. Влияние температуры на скорость био-
деградации нефти в морской воде // Экология моря. 1983. Вып. 14. С. 75-80.
14. Миронов О.Г., Лебедь А.А. О самоочищении морей Се-
верной Европы от нефтепродуктов // Биологическое самоочищение и формирование качества воды. М., 1975. С. 22-24.
17 февраля 2009 г.
