CC BY
15
https://doi.org/10.31631/2073-3046-2019-18-4-67-74
Характеристика показателей клеточного иммунитета у вакцинированных против чумы лиц, проживающих на территории Прикаспийского песчаного природного очага чумы
А. Л. Кравцов, В. А. Кожевников*, С. Н. Клюева, О. М. Кудрявцева, Т. Н. Щуковская, Н. И. Микшис, С. А. Бугоркова
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»», Саратов
Резюме
Цель - сравнительный анализ с помощью проточной цитометрии клеточных показателей иммунного статуса у лиц, проживающих на территории Прикаспийского природного очага чумы и привитых вакциной чумной живой по эпидемическим показаниям. Материалы и методы. Лейкоциты в цельной крови 120 человек исследовали на проточном цитометре с использованием двух четырёхцветных реагентов меченых моноклональных антител (Cyto-Stat CD45-FITC, CD4-PE, CD8-ECD, CD3-PC5 и Cyto-Stat CD45-FITC, CD56-PE, CD19-ECD, CD3-PC5), а также реагента CD95-FITC. Результаты учитывали до вакцинации, через 1 месяц и 6 месяцев после прививки. Определяли относительное содержание в крови лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, лейкоцитов, несущих маркер раннего апоптоза CD95, Т и В- лимфоцитов, NK-клеток, а также Т-лимфоцитов хелперов (Th) и цитоток-сических Т-лимфоцитов (Tcyt) для вычисления иммунорегуляторного индекса (ИРИ). Результаты и обсуждение. У14 человек (11,7%) до вакцинации против чумы были выявлены характерные для иммунодефицитного состояния аномально низкие значения иммун регуляторного индекса (ИРИ < 1) и отмечали менее интенсивную и менее длительную реакцию клеток иммунной системы в ответ на противочумную вакцинацию. У остальных обследованных лиц регистрировали ИРИ в диапазоне 1,4-1,5 до вакцинации и плавное его нарастание через месяц после вакцинации, при сохранении установленного интервала ИРИ в диапазоне 1,6-1,8 спустя 6 месяцев после прививки. Заключение. Для оценки эффективности противочумной вакцинации в рамках мониторинга качества проводимых мероприятий по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения, проживающего на территории природных очагов чумы, важен своевременный контроль иммунного статуса у лиц из групп риска по заражению чумой (охотники, чабаны, работники сельского хозяйства, медицинские работники).
Ключевые слова: природный очаг, вакцинация, чума, иммунный статус, иммунорегуляторный индекс, проточная цитометрия Конфликт интересов не заявлен.
Для цитирования: Кравцов А. Л., Кожевников В. А., Клюева С. Н. и др. Характеристика показателей клеточного иммунитета у вакцинированных против чумы лиц, проживающих на территории Прикаспийского песчаного природного очага чумы. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2019; 18 (3): 67-74. https://doi: 10.31631/2073-3046-2019-18-4-67-74.
Cellular Immune Status Indicators of Anti-Plague Vaccinated Persons, Living on the Caspian Sandy Natural Plague Focus Territory
A.L. Kravtsov, V.A. Kozhevnikov**, S.N. Klyueva, O.M. Kudryavtseva, T.N. Schukovskaya, N.I. Mikshis, S.A. Bugorkova
Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov
Abstract
Aim. To compare by flow cytometry the cellular immune status indicators in persons, living on the territory of the Caspian sandy natural plague focus for epidemic indications. Materials and methods. Whole blood leukocytes of 120 people were examined by flow cytometry with using the two four-color labeled monoclonal antibody reagents (Cyto-Stat CD45-FITC, CD4-PE, CD8-ECD, CD3-PC5 и Cyto-Stat CD45-FITC, CD56-PE, CD19-ECD, CD3-PC5) and by means of CD95-FITC reagent. The results were taken into account before and in a month and 6 months after vaccination. We were determined in the blood the relative content of lymphocytes, monocytes, granulocytes, leukocytes carrying an early apoptosis marker (CD95), T and B- lymphocytes, NK cells as well T - lymphocyte helpers (Th) and cytotoxic T-lymphocytes (Tcyt) for immunoregulatory index (IRI) calculation. Results. Before anti-plague vaccination in 14 people (11,7%) were found abnormally low immunoregulatory index values characterized the immunodeficiency state (IRI<1) and noted less intensive and
" Для переписки: Кожевников Виталий Александрович, м.н.с. отдела иммунологии Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», 410005, Россия, Саратов, ул. Университетская, 46. +7 9279198442, 787868@mail.ru. ©Кравцов А. Л. и др. For correspondence: Kozhevnikov Vitaly A., junior researcher of department of immunology of Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Universitetskaya str., 46 Saratov 410005, Russian Federation/ +79279198442, 787868@mail.ru. ©Kravtsov AL et al.
Practical Aspects of Epidemiology and Vaccine Prevention
less prolonged immune system cell reaction in response to anti-plague vaccination. In the other surveyed persons IRI were registered before vaccination in the range 1,4-1,5 with a smooth increase in it a month after vaccination and with preservation of the established IRI interval in a range 1,6-1,8 later 6 months after an inoculation. Conclusion. To estimate the effectiveness of anti plague vaccination within the framework of the ongoing measures quality monitoring to ensure sanitary and epidemiological welfare of the population, living on territory of the natural plague foci, the timely immune status monitoring is important in persons at risk for plague infection (hunters, shepherds, agricultural workers, medical workers).
Key words: natural focus, vaccination, plague, immune status, imminoregulatory index, flow cytometry No conflict of interest to declare.
For citation: Kravtsov AL, Kozhevnikov VA, Klyueva SN et al. Cellular Immune Status Indicators of Anti-Plague Vaccinated Persons, Living on the Caspian Sandy Natural Plague Focus Territory. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2019; 18 (3): 67-74. (In Russ.). https:// doi: 10.31631/2073-3046-2019-18-4-67-74.
Введение
Прикаспийский песчаный природный очаг чумы площадью 71 950 кв. км отличается частыми периодами высокой эпизоотической активности. Его территория охватывает часть Астраханской области и Ставропольского края, Республики Калмыкия, Дагестан, Чечня. Эпидемические осложнения в границах данного очага неоднократно возникали в период с 1923 г. по 1979 г.
Особенностью последнего десятилетия было сокращение применения для неспецифической профилактики чумы на территориях природных очагов этой инфекции высокотоксичных химических средств, предназначенных для дератизации и дезинсекции [1], что обусловлено возрастанием внимания к проблеме экологической чистоты окружающей среды и контроля здоровья населения, постоянно проживающего на таких территориях.
Иммунный статус человека является ключевым параметром, контролируемым при наблюдениях за здоровьем населения на территориях с высоким риском заражения возбудителями инфекционных заболеваний, поскольку люди с врождёнными и приобретёнными иммунодефицитами более восприимчивы к инфекциям [2,3]. Среди вероятных причин истощения возможностей иммунной системы выделяют факторы, связанные с изменением общей экологической обстановки на конкретной территории, с возрастанием антигенной нагрузки за счет широкого применения вакцин для профилактики различных инфекционных заболеваний [4]. В этих условиях контроль состояния клеточных показателей иммунного статуса у лиц, постоянно проживающих на территориях природных очагов чумы, приобретает особую важность.
Имеющий место случай заболевания чумой ранее привитого вакциной чумной живой (ВЧЖ) человека, зарегистрированный на территории Горно-Алтайского высокогорного природного очага этой инфекции в 2015 г. [5], способствовал активизации исследований по оценке иммунологической эффективности вакцины. Для этого необходим сравнительный анализ состояния клеточных показателей иммунного статуса до и после противочумной вакцинации у лиц из групп риска по заражению
чумой. Однако для больших групп населения, проживающего в природных очагах чумы Российской Федерации,такие исследования с использованием современных методов цитологического анализа не проводились.
В мировой практике для адекватной оценки клеточных показателей иммунного статуса у пациентов принято использовать проточную цитоме-трию [2,3,6]. В последнее десятилетие этот метод всё чаще применяется для определения у людей характера и интенсивности индивидуальной поствакцинальной иммунологической перестройки на клеточном уровне [7], для изучения механизмов клеточного иммунитета при чуме [8-11].
Цель настоящей работы - сравнительный анализ с помощью проточной цитометрии клеточных показателей иммунного статуса лиц, проживающих на территории Прикаспийского природного очага чумы и привитых вакциной чумной живой по эпидемическим показаниям.
Материалы и методы
Исследовали лейкоциты цельной крови 120 человек в возрасте от 24 до 53 лет (средний возраст 43,3 года), проживающих на территории Прикаспийского песчаного природного очага чумы. Из них 80 человек - жители Лаганского (г. Лагань) и Черноземельского (п. Артезиан) районов Республики Калмыкия, а 40 - сотрудники ФКУЗ «Астраханская противочумная станция». Всего было изучено 360 образцов крови, поскольку для каждого из обследуемых результаты учитывались как до, так и после вакцинации (через 1 месяц и 6 месяцев). В условиях длительного обострения эпизоотической активности в природном очаге, регистрируемой с 2014 г., в Республике Калмыкия проводилась специфическая профилактика ВЧЖ на протяжении 3-х последних лет, а персонал ФКУЗ «Астраханская ПЧС», в соответствии с инструкцией по применению препарата, ежегодно вакцинируется против чумы. Среди обследованных 20 человек были три раза вакцинированы против чумы, 95 -более 3-х раз, 5 - впервые вакцинированы ВЧЖ.
От каждого участвующего в исследовании предварительно было получено письменное
согласие на его проведение. Работа одобрена этическим комитетом Саратовского государственного медицинского университета (протокол № 5 от 02.02.2016 г.). В работе использовали ВЧЖ производства ФКУЗ «Ставропольский НИПЧИ» (серия №1-15, 12.03.2015-12.03.2018), представляющую собой лиофилизированную живую культуру вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV НИИЭГ со стабилизатором. Вакцинация ВЖЧ проводилась накожным способом персоналом больниц Астраханской области и районов Калмыкии. Забор крови из локтевой вены осуществляли в пробирки с антикоагулянтом (гепарином). Иммунофенотипирование лейкоцитов проводили с использованием двух четырёхцветных реагентов меченых флуорохромами моноклональных антител (Cyto-Stat CD45-FITC, CD4-PE, CD8-ECD, CD3-PC5 и Cyto-Stat CD45-FITC, CD56-PE, CD19-ECD, CD3-PC5), разработанных фирмой Backman Coulter (США) для быстрой оценки основных показателей, характеризующих состояния иммунной системы людей на клеточном уровне [12]. С помощью этих реагентов и параметров светорассеяния мы определяли в микрообъёмах цельной крови относительное содержание лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов (клеток с фенотипом CD45+), а также относительное количество в суммарных популяциях лимфоцитов Т-клеток (CD3+), В-клеток (CD19+), натуральных киллеров (NK-клеток, СD56+), Т-лимфоцитов хелперов (Th, CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (Tcyt, CD8+). Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) вычисляли как отношение Th к Tcyt [3]. Для определения в крови относительного количества лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов, несущих поверхностный фенотипический маркер раннего апоптоза, применяли одноцветный реагент СD95-FITC (Backman Coulter, США) [10].
В 100 мкл цельной крови вносили 10 мкл препарата меченых моноклональных антител, перемешивали на Вортекс V-3 и через 20 мин экспозиции образца в темноте при комнатной температуре к нему добавляли 2 мл реагента (BD FACS Lysing Solution), созданного фирмой BD Biosciences (США) для эффективного лизиса эритроцитов крови человека в условиях, одновременно обеспечивающих фиксацию и обеззараживание исследуемого материала. Реагент готовили согласно инструкции по его применению. Для исключения потерь клеток на этапе подготовки исследуемых образцов центрифугирование не использовали. Обработанные лизирующим и фиксирующим реагентом окрашенные образцы крови хранили в темноте при 4 ± 0,5 oC до 3-х суток, времени необходимого для доставки образца с территории природного очага в специализированную лабораторию. Выбранный режим подготовки проб обеспечивал качественные результаты цитометрического анализа.
Лейкоциты исследовали на лазерном проточном цитометре СуАп ADP DakoCytomation (Дания), который готовили к работе с образцами цельной
периферической крови человека согласно рекомендациям [12]. Для визуализации, анализа и статистической обработки цитометрических данных применяли программное обеспечение Summit v. 4.3 Built 2445 (Dako).
Для определения продукции цитокино в разводили венозную кровь с антикоагулянтом в соотношении 1:4 средой RPMI 1640, содержащей 100 мкг/ мл гентамицина. В качестве индуктора продукции цитокино в использовали стандартный Т-клеточный митоген конканавалин А (ПанЭко, Россия) в концентрации 15 мкг/мл. Контролем служили клетки крови, культивируемые только в среде RPMI-1640. Опытные и контрольные образцы инкубировали в течение 24 часо в при температуре 37 °С. Затем клеточную суспензию осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 мин, полученные образцы замораживали и хранили до использования при температуре -20 ± 0,5 °С [13].
Индуцированную конканавалином А продукцию цитокино в определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) с помощью коммерческих наборо в для определения IL-1P, IL-2, IL-6, IFN-y (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) и IL-17A (eBioscience, Австрия) на автоматическом им-муноферментном анализаторе «LAZURIT» (Dynex Technologies, США) при длине волны 450 нм.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием стандартных статистических программ, определяя среднее значение анализируемого показателя (М) и ошибку средней арифметической (m). Достоверность различий показателей в исследуемых группах оценивали по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Стандартный протокол цитометрического анализа для быстрого определения в крови человека относительного количества лимфоцитов, моноцито в и гранулоцитов, а также количества Т-лимфоцито в хелперов, цитотоксических Т-лимфоцито в и общего числа Т-клеток, представлен в виде наглядных цитограмм на рисунке 1. Цитограмма на рисунке 1А свидетельствует, что целые неповреждённые CD45+лейкоциты обладают, в отличие от клеточного дебриса, интенсивной иммунофлуорес-ценцией после взаимодействия с мечеными FITC моноклональными антителами и дифференцируются в область R1. Чтобы исключить дебрис, локализованный вне зоны R1, и обеспечить этим адекватное определение лейкоцитарной формулы по параметрам светорассеяния (рис. 1В), проводили по R1 автоматическое гейтирование. По степени внутриклеточной гранулярности на основании оценки параметра SS (см. рис.1 В) обеспечивалось чёткое дифференцирование лимфоцито в (область R2) и моноцито в (R19) от гранулоцитов. Относительное содержание трёх типо в клеток иммунной системы в суммарной лейкоцитарной
Рисунок 1. Протокол экспресс-анализа лейкоцито в в микрообъёме цельной крови человека с использованием четырёхцветного реагента CYTO-STAT CD45-FITC, CD4-PE, CD8-ECD, CD3-PC5
Figure 1. Protocol for the rapid analysis of leukocytes in the microvolume of human whole blood using the four-color reagent CYTO-STAT CD45-FITC, CD4-PE, CD8-ECD, CD3-PC5
Примечание: А - дифференцирование от клеточного дебриса CD45+ лейкоцитов (WBC - white blood cells), регистрируемых в области R1; В - дискриминация дебриса из зоны анализа путём гейтирования по области R1 (G1:R1) при дифференциальном подсчёте лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов; подсчёт Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток (С), а также общего сила Т-лимфоцитов (D) после выбора зоны, соответствующей лимфоцитам (R2), и гейтирования по R1 и R2 (G3:R1&R2).
Note: A - differentiation from cell debris of CD45 + white blood cells (WBC - white blood cells) recorded in the R1 region; B - discrimination of debris from the analysis zone by gating in the R1 (G1: R1) region with differential counting of lymphocytes, monocytes and granulocytes; counting T-helpers and cytotoxic T-cells (C), as well as the total strength of T-lymphocytes (D) after selecting the area corresponding to lymphocytes (R2) and gating according to R1 and R2 (G3: R1 & R2).
популяции приводится в данном случае для каждой из областей анализа под цитограммой и составляет соответственно 33,2, 4,6 и 62,2% - нормальная лейкоцитарная формула у людей [2].
Цитограмма на рисунке 1 С - это результат анализа образца крови по таким параметрам, как относительное содержание в нём CD4+ Т-лимфоцито в хелперо в (47,29% в области R10) и СD8+ цитотоксических Т-лимфоцито в (15,32% в области R7). Значение ИРИ в данном случае это отношение 47,29/15,32 = 3,14. На характерной цитограмме (рис. 1 D) представлен результат определения в том же образце крови общего числа CD3+ Т-лимфоцито в (64,91% в области R15).
Впервые на территории Прикаспийского природного очага чумы проводили оценку иммунного статуса лиц, привитых проти в чумы. Это позволило выявить группу людей, в организме которых процессы Т-клеточной иммунорегуляции существенно отличались от нормы. В таблице 1 представлено относительное содержание популяций лимфоцито в и субпопуляций Т-клеток у вакцинированных ВЧЖ. Так, у 14 человек (11,7%) из 120 обследованных лиц (группа II, п = 14) по данным проточной цитометрии регистрировали аномально низкие исходные значения ИРИ (ИРИ < 1). В основном среди этих людей были лица ранее многократно вакцинированные ВЧЖ. Самые низкие значения ИРИ (0,56 и 0,63) были
Practical Aspects of Epidemiology and Vaccine Prevention
Таблица 1. Относительное содержание популяций лимфоцито в и субпопуляций Т-клеток в крови лиц, вакцинированных проти в чумы
Table 1. The relative content of lymphocyte populations and subpopulations of T cells in the blood of people vaccinated against plague
Группа Group Срок после прививки в месяцах Post vaccination period month Исследуемый показатель, в % (M+m) The studied indicator, in % (M + m) ИРИ Immunoregulatory index
Th (CD4+) Tcyt (CD8+) T-клетки (œ3+) В-клетки (CD19+) NK-клетки (CD56+)
I 0 37,3 ± 1,3 27,8 ± 1,1 б8,б ± 1,б 10,5 ± 0,7 14,9 ± 1,0 1,44 ± 0,12
1 43,3 ± 0,9** 25,5 ± 1,7 71,0 ± 2,5 12,4 ± 0,4 1б,7 ± 1,1 1,7б ± 0,09**
6 35,7 ± 3,б 24,0 ± 1,5 б5,7 ± 2,8 9,1 ± 0,9 17,8 ± 1,б 1,б3 ± 0,14**
II 0 28,8 ± 1,б * 37,5 ± 1,3* 73,7 ± 1,8 7,б ± 1,0 9,9 ± 0,7* 0,84 ± 0,03*
1 41,2 ± 1,4** 37,3 ± 1,4 78,7 ± 1,1 8,б ± 0,8 10,7 ± 0,9 1,13 ± 0,07**
6 30,2 ± 1,0 38,0 ± 1,3 б8,0 ± 1,б 9,2 ± 0,7 10,б ± 1,1 0,81 ± 0,05*
III 0 34,7 ± 0,9 23,7 ± 1,2 бб,4 ± 1,б 9,3 ± 0,9 10,9 ± 1,0 1,52 ± 0,08
1 44,5 ± 1,2** 23,8 ± 1,3 б9,5 ± 1,7 10,0 ± 1,2 12,4 ± 0,8 1,89 ± 0,11**
6 37,2 ± 1,3 24,5 ± 1,0 б5,1 ± 1,4 10,1 ± 0,4 14,0 ± 0,9** 1,77 ± 0,09**
Примечание: *достоверность различий между показателями в группах 1 и 2 (p < 0,05); **достоверность различий по отношению к 0 сроку в 1-ой группе (p < 0,05).
Note: *significance of differences between indicators in groups 1 and 2 (p < 0.05); ** significance of differences with respect to the 0th term in the 1st group (p < 0.05).
зарегистрированы при исследовании лейкоцито в крови двух человек, имеющих на момент обследования соответственно 20-ю и 11-ю прививку ВЧЖ.
В отличие от многократно вакцинированных, для людей, ранее не прививавшихся ВЧЖ (группа I, n = 5), а также для большинства лиц, вакцинированных проти в чумы неоднократно (группа III, n = 101), регистрировали перед очередной вакцинацией нормальные значения ИРИ (см. табл. 1), которые, как известно, должны быть больше единицы [3].
Причиной низких значений ИРИ у лиц группы II являлось повышенное содержание в их крови цитотоксических Т-лимфоцито в при одновременно сниженном количестве Т-лимфоцито в хелперо в (см. табл. 1). Истощение пула Т-хелперов, обладающих уникальными распознающими рецепторами, является признаком иммунодефицитного состояния, при котором из-за нарушения Т-клеточной иммунорегу-ляции резко снижается эффективность распознавания новых антигено в и формирование адекватного специфического иммунного ответа [4,15]. Поскольку люди с таким состоянием иммунной системы обладают повышенной восприимчивостью к инфекциям и попадают в группу риска, например, по туберкулёзу [3], возможно, для лиц, проживающих на территориях природных очаго в чумы и входящих в группу риска по заболеванию этой инфекцией (охотники, чабаны, жители сельской местности, медицинские работники), имеет смысл выделять группы повышенного риска по заражению чумой с учетом исходных показателей их иммунного статуса.
Кроме того, среди лиц, отнесенных к группе II, регистрировали методом проточной цитометрии снижение
относительного количества натуральных киллеро в при повышенном содержании общего числа лимфоцитов. Доля гранулоцито в в крови лиц группы II была ниже, чем в крови лиц, ранее не прививавшихся ВЧЖ. Причём, сниженное количество клеток врождённого иммунитета, играющих ключевую роль в антибактериальной защите [14], регистрировали на фоне повышения в крови относительного числа гранулоцитов, несущих поверхностный фенотипический маркер раннего апоптоза CD95 (рис. 2, табл. 2).
В таблице 3 представлены данные по продукции цитокино в клетками крови лиц, вакцинированных ВЧЖ. Во всех выделенных группах встречались лица, отличающиеся по продукции некоторых цитокино в (IL-2 и IL-17), индуцируемых в крови активатором Т-клеточной пролиферации, что, возможно, свидетельствовало о различном (индивидуальном) исходном функциональном состоянии Т-клеточного звена иммунитета среди людей.
Через месяц после применения ВЧЖ результаты оценки изменений клеточных показателей иммунного статуса у лиц, относящихся к трем группам, подтвердили экспериментальные данные, ранее полученные нами с помощью проточной цитоме-трии у вакцинированных проти в чумы сотруднико в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» [10]. В этот срок, независимо от исследуемой группы, под влиянием ВЧЖ в крови достоверно повышалось относительное количество моноцито в и Т-лимфоцито в хел-перов. Особенностью реакции клеток иммунной системы у лиц группы II было более высокое общее число CD3+ Т-клеток на ранней стадии иммунологической перестройки (см. табл. 1, 2).
Practical Aspects of Epidemiology and Vaccine Prevention
Рисунок 2. Алгоритм анализа образцо в крови на наличие гранулоцитов, положительных по фенотипическому маркеру раннего апоптоза (СD95)
Figure 2. Algorithm for analysis of blood samples for the presence of granulocytes positive for the phenotypic marker of early apoptosis (CD95)
Примечание: А - выбор зоны анализа, соответствующей гранулоцитам по параметрам светорассеяния (R2); Гистограммы В и С иллюстрируют различное содержание CD95+ гранулоцито в (область R4) в образцах крови лиц, относящихся, соответственно, к группам II (7,15%) и III (1,52%).
Note: A - selection of the analysis zone corresponding to granulocytes according to light scattering parameters (R2); Histograms B and C illustrate the different contents of CD95 + granulocytes (region R4) in blood samples of individuals belonging, respectively, to groups II (7.15%) and III (1.52%).
О влиянии противочумной вакцинации на функциональную активность Т-клеточного звена иммунитета у людей свидетельствовали данные сравнительной оценки митоген-индуцируемой продукции цитокинов, особенно через 6 месяце в после прививки (табл. 3). Однако метод проточной цитометрии позволил получить важную информацию об изменениях относительного содержания в крови Т-клеток, ответственных за иммунорегуля-цию на субпопуляционном уровне. Значения ИРИ через месяц после вакцинации за счёт повышения доли Т-хелперо в в суммарном пуле лимфоцито в достоверно увеличивались во всех трёх группах,
но через полгода эти изменения сохранялись на том же уровне только в группах I и III. В группе II регистрируемые методом проточной цитометрии индивидуальные значения ИРИ возвращались через 6 месяце в к своим исходно низким значениям (ИРИ < 1). То есть, интенсивность клеточного иммунного ответа у людей на ВЧЖ зависела от индивидуальных клеточных показателей иммунного статуса организма (см. табл. 1) до начала проведения мероприятий по специфической профилактике, что согласуется с полученными ранее данными при обследовании персонала противочумных учреждений [15].
Таблица 2. Влияние противочумной вакцинации на лейкоцитарную формулу, на экспрессию маркера раннего апоптоза на поверхности лимфоцито в крови и клеток врождённого иммунитета
Table 2. The effect of anti-plague vaccination on the leukocyte formula, on the expression of a marker of early apoptosis on the surface of blood lymphocytes and cells of innate immunity
Группы Срок после прививки в месяцах Post vaccination period month Исследуемый параметр The investigated parameter
Л, % L, % М, % M, % Г, % G, % ^ % ^ % % ^ % Г* % %
Группа I Group I (n = 5) 0 32,7 ± 1,2 4,6 ± 0,4 62,8 ± 1,5 0,1 ± 0,01 0,2 ± 0,1 1,7 ± 0,6
1 30,0 ± 1,0 7,1 ± 0,7* 63,0 ± 1,3 - - -
6 28,4 ± 2,1 3,9 ± 0,6 67,7 ± 1,7 ,1 ± 0,03 1,4 ± 0,7** 5,4 ± 0,3**
Группа II Group II (n = 14) 0 38,5 ± 1,1* 5,6 ± 0,3 54,0 ± 1,3* 0,2 ± 0,06 0,3 ± 0,16 4,5 ± 0,2*
1 33,2 ± 1,6 8,2 ± 0,5** 59,3 ± 2,3 - - -
6 29,1 ± 1,8** 4,9 ± 0,4 61,2 ± 2,0 0,2 ± 0,05 0,3 ± 0,1 7,0 ± 1,1**
Группа III Group III (n = 101) 0 35,1 ± 1,0 4,8 ± 0,3 59,1 ± 1,3 0,2 ± 0,04 0,2 ± 0,1 6,3 ± 0,9*
1 37,8 ± 1,3 8,5 ± 0,3** 58,6 ± 1,2 - - -
6 26,8 ± 1,4** 4,6 ± 0,2 64,5 ± 1,5 0,1 ± 0,02 0,8 ± 0,2** 6,2 ± 0,7
Примечание: оценивали относительное содержание в крови лимфоцито в (Л), моноцито в (М) и гранулоцито в (Г). Л95, М95 и Г95 - это клетки, экспрессирующие на поверхности CD95. Группы и обозначения достоверных различий в группах как в таблице 1. Note: the relative blood levels of lymphocytes (L), monocytes (M) and granulocytes (G) were evaluated. L95, M95 and G95 are cells expressing on the surface CD95. Groups and designations of significant differences in groups as in table 1.
Таблица 3. Митоген-индуцированная продукция цитокино в ex vivo в крови ревакцинированных лиц, проживающих на территории Прикаспийского песчаного природного очага чумы
Table 3. Mitogen-induced ex vivo cytokine production in the blood of revaccinated individuals living in the Caspian sandy natural plague focus
Цитокины Cytokines Митоген-индуцированная продукция, пг/мл (M ± m) Mitogen-induced production, pg / ml (M ± m)
До вакцинации Before vaccination 1 месяц после вакцинации 1 month after vaccinatio 6 месяце в после вакцинации 6 month after vaccinatio
I группа I group II группа II group III группа III group I группа I group II группа II group III группа III group I группа I group II группа II group III группа III group
IFN-Y 8,9 ± 1,8 7,7 ± 1,7 7,5 ± 0,5 12,6 ± 3,5 13,5 ± 3,5 11,6 ± 0,9 660,6 ± 107,2* 476,9 ± 72,8** 443,7 ± 18,9**
IL-1ß 207,8 ± 27,5 222,9 ± 16,3 189,2 ± 9,3 17,1 ± 11,8** 11,7 ± 3,4** 16,2 ± 3,2** 269,9 ± 58,2 109,6 ± 30,7* 112,2 ± 10,9*
IL-2 0,08 ± 0,1 0,3 ±0,1* 0,3 ± 0,03* 0,1 ±0,04 0,2 ± 0,1 0,2 ±0,05 65,9 ± 33,6** 71,4 ± 19,4** 89,1 ± 6,4**
IL-6 175,4 ± 57,7 115,6 ± 14,5 92,01 ± 7,8 1,1 ± 0,7** 1,8 ± 0,5** 4,3 ± 1,2** 370,4 ± 8,9 630,0 ± 168,5** 708,5 ± 117,1**
IL-17 0,8 ± 0,2 0,9 ± 0,3 1,5 ± 0,2 0,7 ± 0,2 1,9 ± 0,6** 2,5 ± 0,7** 108,2 ± 24,7** 83,3 ± 14,** 145,7 ± 11,3**
Примечание: *достоверность различий между показателями в группах I и II (p < 0,05); **достоверность различий по отношению к 0 сроку (до вакцинации) в I группе (p < 0,05).
Note: *significance of differences between indicators in groups I and II (p < 0.05); ** significance of differences in relation to the 0th term (before vaccination) in group I (p < 0.05).
Автоматизация и стандартизация цитологических исследований на основе технологии импульсной проточной цитометрии существенно повышает информативность, достоверность и производительность оценки клеточных показателей иммунного статуса при обследовании больших групп населения [2,3] и может быть использована для своевременного выявления лиц с иммунодефицитами среди населения, проживающего на территории природных очаго в чумы и входящих в группы риска по заражению этой инфекцией.
Выводы
1. Применение метода проточной цитометрии при мониторировании состояния иммунного статуса у лиц, проживающих на территориях природных очаго в чумы, позволяет эффективно выявлять лиц с низким значением ИРИ для выделения групп повышенного риска по заболеванию чумой и слабым формированием защитных реакций на специфическую профилактику этой инфекции.
2. Установлено, что исходные показатели иммунного статуса влияют на интенсивность
последующей клеточной иммунологической 3. Проведение иммунологического мониторинга сре-
перестройки у людей в ответ на вакцина- ди лиц, проживающих на территориях природных
цию ВЧЖ. Для группы риска с аномаль- очаго в чумы и подвергающихся вакцинации ВЧЖ
ными значениями ИРИ характерна менее по эпидемическим показаниям, расширяет воз-
интенсивная и менее длительная ответная можности для принятия управленческих решений,
клеточная реакция, свидетельствующая об направленных на сбалансированное применение
относительном истощении возможностей методо в специфической и неспецифической про-
иммунной системы. филактики этой особо опасной инфекции.
Литература
1. Матросо в А.Н., Лопатин А.А., Попо в Н.В. и др. Неспецифическая профилактика чумы в Прикаспийском песчаном природном очаге//Здоровье населения и среда обитания. 2015. Т. 262, № 1. С. 30-32.
2. Козинец Г.И., Высоцкий В.В., Погорело в В.М. и др. Кровь и инфекция. М.: Триада-Фарм; 2001.
3. Васильева Е.В., Кудрявце в И.В., Максимо в Г.В. и др. Влияние ВИЧ-инфекции и туберкулёза на степень дифференцировки Т-лимфоцито в периферической крови //Инфекция и иммунитет. 2017. Т. 7, № 2. С. 151-161.
4. Макарова В.Г., Устинова О.Ю., Долгих О.В., Загумённых А.Д. Иммунологический профиль и состояние поствакцинального иммунитета к инфекциям, управляемым средствами иммунопрофилактики у детей в условиях комбинированной аэрогенной экспозиции химическими веществами техногенного происхождения //Здоровье населения и среда обитания. 2013. Т. 11, № 248. С. 27-29.
5. Балахоно в С.В., Попова А.Ю., Мищенко А.И. и др. Случай заболевания человека чумой в Кош-Агачском районе Республики Алтай в 2015 г. Сообщение 1. Кли-нико-эпидемиологические и эпизоотологические аспекты // Проблемы особо опасных инфекций. 2016. № 1. С. 55-60.
6. Кудрявце в И.В., Субботовская А.И. Опыт измерения параметро в иммунного статуса с использованием шестицветного цитофлуориметрического анализа // Медицинская иммунология. 2015. Т. 17, № 1. С. 19-26.
7. Во^оп D., Roederer M. Flow cytometry and the future of vaccine development // Expert Rev Vaccines. 2009. Vol. 8, N 6. P. 779-789.
8. Saikh K, Kissner T, Dyas B. Human cytolytic T cell recognition of Yersinia pestis virulence proteins that target innate immune response //J Infectious Diseases. 2006. N 194. P. 1753-1760.
9. Богачева Н.В., Крючко в А.В., Дармо в И.В. и др. Экспериментальная оценка методом проточной цитофлуориметрии уровня клеточной иммунологической памяти у лиц, вакцинированных проти в чумы и сибирской язвы // Клиническая лабораторная диагностика. 2013. № 11. С. 48-53.
10. Кравцо в А.Л., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н., Бугоркова С.А. Проточно-цитофлуориметрическое исследование влияния противочумной вакцинации на по-пуляционный соста в лейкоцито в крови человека и экспрессию на клеточной поверхности медиатора апоптоза // Российский иммунологический журнал. 2015. Т. 9, № 4. С. 435-445.
11. Куличенко А.Н., Абзаева Н.В., Гостищева С.Е. и др. Использование антигенспецифических клеточных тесто в in vitro для оценки формирования поствакцинального противочумного иммунитета//Инфекция и иммунитет. 2017. Т. 7, № 2. С. 203-208.
12. Хайдуко в С.В., БайдунЛ.А., Зурочка А.В., Тотолян А.А. Стандартизованная технология «исследование субпопуляционного составалимфоцито в периферической крови с применением проточных цитофлуориметров-анализаторов» (проект) //Медицинская иммунология. 2012. Т. 14, № 3. С. 225-268.
13. Клюева С.Н., Шмелькова Т.П., Щуковская Т.Н. Влияние олигодезоксинуклеотида CpG ODN 2006 на продукцию цитокино в клетками крови людей, вакцинированных проти в чумы//Медицинская иммунология. 2014. Т. 16, № 6. С. 531-538.
14. Нестерова И.В, Колесникова Н.В., Чудилова Г.А. и др. Новый взгляд на нейтрофильные гранулоциты: переосмысление старых догм. Часть 1 //Инфекция и иммунитет. 2017. Т. 7, № 3. С. 219-230.
15. Герасимова К.И. Показатели иммунного статуса людей, вакцинированных проти в чумы: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Саратов; 1990.
References
1. Мatrosov AN, Lopatin AA, Popov NV, et al. Non-specific prophylaxis of plague in the natural sandy focus of the Caspian sea region. Zdorov'e naseleniya i sreda obitaniya [Health and Habitat]. 2015;1(262):30-32. (In Russ.)
2. Kozinets GI, Vysotsky VV, Pogorelov VM, et al. Blood and infection. M.: Triada-Farm; 2001. (In Russ.)
3. Vasileva EV, Kudryavtsev IV, Maximov GV, et al. Impact of HIV infection and tuberculosis on the peripheral blood T-cell differentiation. Infektsiya i immunitet [Russian Journal of Infection and Immunity]. 2017;7(2):151-161. (In Russ.)
4. Makarova VG, Ustinova OU, Dolgikh OV, Zagumennyh AD. Immune profile and postvaccinal immune status for infections, controlled by the immunoprophylaxis implements for children under the combined aerogenic explosion by chemical anthropogenic substances. Zdorov'e naseleniya i sreda obitaniya [Health and Habitat]. 2013;11(248):27-29. (In Russ.)
5. Balakhonov SV, Popova AYu, Mishchenko AI, et al. A case of human infection with plague in the Kosh-Agach region of the Republic of Altai in 2015. Communication 1. Clinical-epidemiological and epizootiological aspects. Probl Osobo Opasn Infek [Problems especially dangerous infections]. 2016;1:55-60. (In Russ.)
6. Kudryavtsev IV, Subbotovskaya AI. Application of six-color flow cytometric analysis for immune profile monitoring. Meditsinskaya immunologiya [Medical Immunology]. 2015;17(1):19-26. (In Russ.)
7. Bolton D, Roederer M. Flow cytometry and the future of vaccine development. Expert Rev Vaccines. 2009;8(6):779-789.
8. Saikh K, Kissner T, Dyas B. Human cytolytic T cell recognition of Yersinia pestis virulence proteins that target innate immune response. J Infectious Diseases. 2006;194:1753-1760.
9. Bogacheva NV, Kryuchkov AV, Darmov IV, et al. Experimental evaluation using flow cytofluorometry level of cell immunological memory in individuals vaccinated against plague and anthrax. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika [Clinical Laboratory Diagnostics]. 2013;11:48-53. (In Russ.)
10. Kravtsov AL, Klyueva SN, Schukovskaya TN, Bugorkova SA. Flow cytometric assay of anti-plague vaccination influence on the human blood leukocyte population structure and apoptosis mediator expression on the cell surface. Rossiiskii immunologicheskii zhurnal [Russian Journal of Immunology]. 2015;9(4):435-445. (In Russ.)
11. Kulichenko AN, Abzaeva NV, Gostischeva SE, et al. The antigen-specific cell in vitro tests for post-vaccination anti-plague immunity formation. Infektsiya i immunitet [Russian Journal of Infection and Immunity]. 2017;7(2):203-208. (In Russ.)
12. Khaydukov SV, Baidun LA, Zurochka AV, Totolian AA. Methods. Meditsinskaya immunologiya [Medical Immunology]. 2012;14(3):225-268. (In Russ.)
13. Klyueva SN, Shmelkova TP, Schukovskaya TN. Influence of CpG ODN 2006 oligodeoxynucleatide on cytokine production by blood cells of humans vaccinated against plague. Meditsinskaya immunologiya [Medical Immunology]. 2014;16(6):531-538. (In Russ.)
14. Nesterova IV, Kolesnikova NV, Chudilova GA, et al. The new look at neutrophilic granulocytes: rethinking old dogmas. Part 1. Infektsiya i immunitet [Russian Journal of Infection and Immunity]. 2017;7(3):219-230. (In Russ.)
15. Gerasimova KI. Immune status indicators of the vaccinated against plague people. Doctorate of med. sci. diss. Saratov; 1990. (In Russ.)
Об авторах About the Authors
• Александр Леонидович Кравцов - д.б.н., ведущий научный сотрудник от- • Alexander L. Kravtsov - Dr. Sci. (Biol.), leading researcher of department of дела иммунологии Российского научно-исследовательского противочум- immunology of Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», 46, Univer-ного института «Микроб», 410005, Россия, Саратов, ул. Университетская, 46. sitetskaya str., Saratov, 410005, Russian Federation.
• Виталий Александрович Кожевников - м.н.с., отдела иммунологии Рос- • Vitaliy A. Kozhevnikov - junior researcher of department of immunology сийского научно-исследовательского противочумного института «Ми- of Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», 46, Universitetskaya str., кроб», 410005, Россия, Саратов, ул. Университетская, 46. +7 9279198442, Saratov 410005, Russian Federation. +79279198442, 787868@mail.ru. 787868@mail.ru. • Svetlana N. Klyueva - Cand. Sci. (Med.), researcher, of department of immu-
• Светлана Николаевна Клюева - к.б.н., научный сотрудник отдела имму- nology of Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», 46, Universitets-нологии Российского научно-исследовательского противочумного ин- kaya str., Saratov, 410005, Russian Federation.
ститута «Микроб», 410005, Россия, Саратов, ул. Университетская, 46. • Olga M. Kudryavtseva - Cand. Sci. (Med.), senior researcher, of department
• Ольга Михайловна Кудрявцева - к.б.н., старший научный сотрудник от- of immunology of Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», 46, Uni-дела иммунологии Российского научно-исследовательского противочум- versitetskaya str., Saratov, 410005, Russian Federation.
ного института «Микроб», 410005, Россия, Саратов, ул. Университетская, 46. • Tat'yana N. Shchukovskaya - Dr. Sci. (Med.), professor, of department of
• Татьяна Николаевна Щуковская - д.м.н., профессор, главный научный immunology of Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», 46, Univer-сотрудник отдела иммунологии Российского научно-исследовательского sitetskaya str., Saratov, 410005, Russian Federation.
противочумного института «Микроб», 410005, Россия, Саратов, ул. Уни- Received: 23.05.2019. Accepted: 22.07.2019.
те^тетсгаа 46. Creative Commons Attribution CC BY 4.0.
Поступила: 23.05.2019. Принята к печати: 22.07.2019.
Контент доступен под лицензией CC BY 4.0.
