Характеристика неврологического дефицита у крыс в модели тяжелой ЧМТ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

Статья поступила в редакцию 25.11.2011 г.

ХАРАКТЕРИСТИКА НЕВРОЛОГИЧЕСКОГО ДЕФИЦИТА У КРЫС В МОДЕЛИ ТЯЖЕЛОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ

CHARACTERISTICS OF NEUROLOGICAL DEFICIT IN A MODEL OF SEVERE TRAUMATIC BRAIN INJURY IN RATS

Половников Е.В. Ступак В.В. Самохин А.Г. Васильев И.А. Шевела Е.Я. Черных Е.Р.

ФГУ Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии

Росмедтехнологий,

НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск, Россия

Polovnikov E.V. Stupak V.V. Samokhin A.G. Vasilyev I.A. Shevela E.Y. Chernykh E.R.

Novosibirsk scientific research institute of traumatology and orthopedics,

Scientific research institute of clinical immunology, Novosibirsk, Russia

Цель - настоящая работа посвящена оценке неврологических расстройств и спонтанного восстановления в модифицированной модели контролируемого коркового повреждения головного мозга у крыс. Материалы и методы. Исследования проводили на крысах линии Вистар (самцы и самки в равном соотношении; масса тела 250-270 г; n = 51). Травматическое повреждение головного мозга моделировали с использованием оригинального пружинного механизма, позволяющего дозировать силу удара. Неврологические нарушения оценивали с помощью модифицированной шкалы по Chen, теста вертикальной сетки и водного лабиринта Морриса. Результаты исследования. Сравнение неврологического дефицита в трех группах животных с нарастающей силой удара позволило определить оптимальные условия для индукции тяжелых неврологических расстройств с минимальным летальным исходом. Индуцированные в таких условиях нарушения двигательной активности восстанавливались к исходу 14-х суток, статическая физическая выносливость оставалась сниженной до 21-х суток наблюдения, остаточные явления в виде монопареза сохранялись до 28-х суток, нарушения интеллектуально-мнестических функций наблюдались в течение 3-х недель.

Выводы. Таким образом, использование пружинного механизма силой удара от 0,06 до 0,09 Дж по энергии ударного воздействия позволяет моделировать у крыс стабильно воспроизводимый, тяжелый неврологический дефицит, ассоциированный с когнитивными нарушениями. Ключевые слова: модель контролируемого коркового повреждения; неврологический дефицит; спонтанное восстановление.

The aim of the study - the present article estimates the neurological responses and spontaneous recovery in the modified model of controlled cortical brain injury in rats.

Materials and methods. The study was performed on Wistar rats (males and females in equal proportions, body weight - 250-270 g; n = 51). Traumatic brain injury was produced with original spring-loaded mechanism to precise dosing of impact force. Neurological disorders were assessed with the modified Chen scale, vertical grid test and Morris water maze.

Results. Comparison of neurological deficits in three groups of animals with increasing impact force allowed to determine the optimal conditions for induction of severe neurological disorders with minimal mortality. Produced in such conditions, the violations of physical activity were found to be restored by the end of 14th day, the static physical endurance remained reduced up to 21st day, residual monoparesis persisted until 28th day, cognitive impairments were observed for 3 weeks.

Conclusions. Thus, use of the spring mechanism with impact force of 0,06-0,09 J allows to produce consistently reproducible, severe neurological disorders associated with cognitive impairment in rats.

Key words: controlled cortical injury model; neurological impairment; spontaneous recovery.

H

изкая эффективность лечения черепно-мозговой травмы (ЧМТ) в значительной степени обусловлена недостаточным пониманием патогенеза данной патологии и отсутствием адекватных экспериментальных моделей для оценки эффективности новых терапевтических стратегий. Большинство экспериментальных моделей ЧМТ (жидкостно-перкуссионная травма мозга, модель контролируемого коркового повреждения, модель черепно-мозговой травмы в резуль-

тате падения груза, модель ударного ускорения) не позволяют точно дозировать силу повреждения. Моделирование тяжелого неврологического дефицита всегда также связано с высокой и, зачастую, малопрогнозируемой гибелью животных [1, 2]. Кроме того, недостаточная характеристика неврологического дефицита затрудняет проведение сравнительной оценки неврологических расстройств в различных моделях и оценку динамики спонтанного восстановления [3, 4]. В

этой связи разработка подходов к моделированию «стандартизированного» повреждения, вызывающего тяжелый неврологический дефицит, представляется важной научно-практической задачей.

Одной из наиболее распространенных моделей ЧМТ является способ «контролируемого коркового повреждения», который предполагает воздействие жестким ударником на интактную твердую мозговую оболочку (ТМО) [1, 3]. Однако недостатком использова-

ния пневматического устройства является невозможность четко дозировать силу удара и прогнозировать выраженность неврологических расстройств. Для решения этой проблемы нами было разработано пружинное устройство, позволяющее воспроизводить заданную, стабильную силу удара [5].

Целью настоящей работы явилась характеристика моторных и когнитивных расстройств и исследование динамики спонтанного восстановления неврологического дефицита в модели ЧМТ у крыс при использовании указанного устройства.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились с соблюдением этических норм, регламентированных приказом МЗ РФ № 266 от 19.03.2003 г. Для экспериментов использовали крыс линии Вистар (самцы и самки в равном соотношении; масса тела 250-270 г; п = 51). Под кетаминовым наркозом животным проводился разрез кожных покровов, скелетирова-лись лобная и теменная кости черепа и при помощи высокооборотной фрезы в лобно-теменной области справа наносилось фрезевое отверстие. Твердая мозговая оболочка не вскрывалась. Повреждение наносилось однократно при помощи ударника с насадкой диаметром 5 мм и пружинным механизмом, фиксированным к вертикальному металлическому держателю; при этом голова животного не фиксировалась [5]. Силу удара рассчитывали по энергии ударного воздействия (энергия сжатия пружины) либо по деформации пружины, исходя из формул:

1) рЛпж> = ИМ = <Ш?1(мм>*

2) |„ (мм) где

L — деформация пружины в мм.

В зависимости от силы удара, были сформированы три группы животных. Животным первой группы (п = 5) наносился удар при растяжении пружины в диапазоне от 6 до 14 мм (6, 8, 10, 12, 14 мм) или менее 0,06 Дж по энергии ударного воздействия; животным второй

группы (n = 38) — при растяжении от 15 до 18 мм (15, 16, 17, 18 мм) или от 0,06 до 0,09 Дж; животным третьей группы (n = 8) — более 18 мм (19, 20, 22, 24, 26, 28, 30 мм) или более 0,10 Дж по энергии ударного воздействия.

После оперативного лечения все животные однократно получали антибактериальную и противоот-ечную терапию. Степень выраженности неврологического дефицита оценивали с помощью шкалы оценки тяжести неврологических нарушений (ОТНН, Chen et al., 2001) [6]. Наличие неврологического дефицита, соответствующего 13-18 баллам, расценивалось как выраженное повреждение головного мозга, 7-12 баллов — умеренное повреждение, от 1 до 6 баллов — легкое повреждение.

Когнитивные нарушения оценивали с помощью теста водного лабиринта Морриса [3, 7]. Для этого использовалась ванна с жесткими стенками высотой 50 см, заполненная теплой водой (t = 24 ± 1°C), в которой была установлена «фиксированная» платформа размером 12 х 12 см. Уровень жидкости составлял 35 см от дна ванны, что позволяло исключить касание дна ванны задними лапами крупными особями. Светопроницаемость воды устраняли добавлением небольшого количества сухого молока. Оценка когнитивных функций проводилась по времени, которое требовалось животным для нахождения платформы. Соответствующий показатель у здоровых крыс после 8-10 тренировочных заплывов составлял 8-12 сек.

Физическое состояние животных и выраженность двигательных на-

рушений, в частности статическую выносливость, оценивали также с помощью метода «вертикальной сетки» [8]. «Вертикальная сетка» представляет собой проволочную сетку с ячейками 1,5 х 1,5 мм и площадью 30 х 60 см. Животное помещали на сетку и регистрировали время с момента посадки до момента падения с сетки. Измерения проводили с тремя повторами, используя максимальное время удержания. Время удержания здорового животного составляло 300 сек и более.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statisti-ca 6.0. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

После нанесения травмы у всех животных местно отмечался разрыв твердой мозговой оболочки и видимое повреждение вещества головного мозга в виде участка вдавления и размозжения с последующим отеком, ликворреей и незначительным кровотечением.

У животных с силой удара < 0,06 Дж (1-я группа) летальных исходов не наблюдалось. Оценка двигательных нарушений (табл. и рис. 1а) показала, что неврологический дефицит в этой группе имел слабо выраженный характер (от 0 до 6 баллов по Chen) и проявлялся в виде легкого гемипареза, купирующегося самостоятельно к 7 суткам.

Несмотря на незначительную выраженность нарушений двигатель-

Таблица

Сравнительная характеристика неврологических нарушений в зависимости

от силы удара

1 группа 2 группа 3 группа

N1 5 38 8

Сила удара 6-14 мм 15-18 мм > 18 мм

(< 0,06 Дж) (0,07-0,09 Дж) (> 0,09 Дж)

Летальность 0 2/38 8/8

ОТНН2 0,8 ± 0,37 12,6 ± 0,71* -

Примечание: * - достоверность (р < 0,05) различий между 1-й и 2-й группами по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни; 1 - число животных в группах, 2 - балл для выживших животных.

75

№ 1[март] 2012

ной активности, у животных этой группы наблюдалось значительное снижение статической физической выносливости, о чем свидетельствовало снижение времени удержания на вертикальной сетке (240 ± 0,26 сек против 300 сек у интактных крыс, р = 0,012). Данная функция полностью восстанавливалась к 21-м суткам (рис. 1б). Кроме того, у животных первой группы наблюдались нарушения когнитивных функций. Так, оценка животных в тесте Морриса на 7-е сутки выявила значимое возрастание времени нахождения платформы (15,2 ± 0,34 сек против 10,2 ± 0,14 сек у интактных особей). Однако уже к исходу 14-х суток когнитивные функции восстанавливались (рис. 1в).

У животных второй группы летальный исход наблюдался в 5,3 % случаев (у 2 из 38). Балл ОТНН в этой группе варьировал от 13 до 18, что соответствовало тяжелому неврологическому дефициту. У всех особей этой группы развивался глубокий гемипарез (в большей степени в задней конечности) и отмечалось значительное снижение тонуса хвоста. Оценка животных этой группы в тесте вертикальной сетки и Морриса была невозможна в силу выраженности двигательных нарушений. Тем не менее, уже к исходу 14-х суток наблюдалась регрессия моторных расстройств, о чем свидетельствовало достоверное снижение балла ОТНН (3,5 ± 0,3; р = 0,03). Статическая физическая выносливость восстанавливалась менее эффективно, оставаясь сниженной до 21-го дня наблюдения. Обучаемость крыс и способность ориентироваться при проведении теста Морриса были также существенно снижены на протяжении всего срока наблюдения (в течение 4-х недель).

Важно отметить, что, несмотря на постепенное уменьшение гемипаре-за, у животных 2-й группы отмечались остаточные явления неврологического дефицита. Эти изменения проявлялись преимущественно в дистальных отделах конечности (на противоположной стороне от места нанесения травмы) в виде монопареза, четко идентифицировались на 28-е сутки, обуславливая

Рисунок

Динамика двигательных нарушений по шкале ОТНН (а), статической выносливости («вертикальная сетка», (б) и когнитивных нарушений (водный тест Морриса, (в) в модели ЧМТ у крыс

■ 1 т> Ягл

1-ые

7-ые

1-1-ь н

21-ые

СУТКИ

I Ы(!

7-ые

14-ые

-ые

сутки

1 -ые

7-ые

11'Ые

21 ые

лутки

Примечание: 1 группа — моделирование ЧМТ при растяжении пружины 6-14 мм; 2 группа — при растяжении пружины 15-18 мм; * — достоверность различий (р < 0,05) между группами по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

неуверенную постановку стопы на плоской поверхности, и разрешались только к 45 суткам.

Нанесение силы удара более 0,09 Дж (3-я группа) вызывало летальный исход либо непосредственно после нанесения удара (при силе удара, превышающей 24 мм; п = 4), либо через несколько часов после травмирующего воздействия.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании нами были охарактеризованы нарушения

моторных и когнитивных функций, а также динамика их спонтанного восстановления у крыс в модели тяжелой ЧМТ, индуцированной с помощью пружинного механизма. Предлагаемый способ, по сути, является модификацией модели «контролируемого коркового повреждения». Однако использование в качестве модификации пружинного механизма позволило точно рассчитать силу удара и сравнить выраженность неврологических расстройств в трех группах животных с нарастающей силой удара.

а

Одно из основных требований к экспериментальным моделям травмы — соответствие тяжести повреждения прилагаемой механической силе и пропорциональное возрастание выраженности повреждений по мере увеличения силы травмирующего воздействия [3]. Полученные нами данные продемонстрировали прогрессирование неврологического дефицита при увеличении силы удара и позволили определить оптимальный диапазон ударной силы, приводящий к формированию тяжелых неврологических нарушений. Важно подчеркнуть, что моделирование ЧМТ с использованием данного диапазона воздействий ассоциируется с низкой летальностью животных, не превышающей 5,3 %, в то время как в большинстве аналогичных моделей этот показатель варьирует от 15 до 50 % [9].

Еще одним важным моментом при моделировании травмы является четкая количественная характеристика неврологических расстройств и динамики спонтанного восстановления. К сожалению, эти параметры, как правило, недостаточно полно исследуются авторами, что существенно затрудняет сравнение разных моделей и оценку различных терапевтических воздействий. В нашем исследовании анализ физического состояния и двигательных нарушений проводился с помощью модифицированной шкалы ОТНН и метода «вертикальной сет-

ки», а выраженность когнитивных нарушений оценивалась в водном тесте Морриса. Полученные таким образом результаты показали, что в оптимальном диапазоне ударной силы (при растяжении пружины от 15 до 18 мм или от 0,06 до 0,09 Дж по энергии ударного воздействия) у животных развивался тяжелый неврологический дефицит и выраженные когнитивные нарушения. Несмотря на спонтанное восстановление двигательной активности к исходу второй недели, остаточные проявления неврологического дефицита сохранялись еще длительное время и разрешались только к 45-м суткам. При этом на протяжении трех недель у животных сохранялись нарушения интеллектуаль-но-мнестических функций, которые на период 21-го дня полностью не восстанавливались.

Следует отметить, что одним из существенных недостатков при моделировании ЧМТ с использованием пневматического устройства является быстрое спонтанное восстановление моторных функций. Так, по данным Mahmood, регрессия двигательных расстройств в указанной модели наблюдается уже к 7-8 суткам [10]. В предложенной нами модели нарушения двигательной активности сохраняются дольше и восстанавливаются только к исходу 14-х суток, статическая физическая выносливость остается сниженной вплоть до 21-х

суток наблюдения. Кроме того, до 28-х суток сохраняются остаточные явления в виде монопареза. Более стойкий и выраженный неврологический дефицит, по нашему мнению, может быть связан с двумя причинами: большей глубиной повреждения мозгового вещества [1, 11] и иной локализацией нанесения удара, в частности, в лобно-теменной области (вместо теменно-височной). Действительно, учитывая особенности локализации двигательных зон у крыс [12], повреждение лобно-те-менной области может быть более эффективным для формирования двигательного дефицита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, использование пружинного механизма силой удара от 0,06 до 0,09 Дж по энергии ударного воздействия позволяет моделировать у крыс стабильно воспроизводимый, тяжелый неврологический дефицит, ассоциированный с когнитивными нарушениями. В отличие от большинства аналогичных моделей, предложенная модель характеризуется низким уровнем летальности и более длительным спонтанным восстановлением моторных функций, на фоне сохраняющихся остаточных явлений двигательных нарушений. Использование подобного подхода может быть полезным для оценки эффективности новых видов лечения при повреждении головного мозга.

Литература:

1. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat /C.E. Dixon, G.L. Clifton, J.W. Lighthall [et al.] //J. Neurosci. Methods. - 1991. - Vol. 39. - P. 253-262.

2. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat /C.E. Dixon, B.G. Lyeth, J.T. Povlichock [et al.] //J. Neurosurg. -1987. - Vol. 67. - P. 110-119.

3. Белошицкий, В.В. Современные принципы моделирования черепно-мозговой травмы в эксперименте /В.В. Белошицкий //Украинский нейрохирургический журнал. - 2008. - № 4. - С. 9-15. Буреш, Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения /Я. Буреш, О. Бурешова, Дж.П. Хьюстон. - М.: Высшая школа, 1991. - 400 с.

Пат. 2414005 Российская Федерация, МПК G 09 B 23/28 Устройство для моделирования очагового поражения головного мозга /Самохин А.Г., Кузьмин А.В., Ступак В.В. и др.; патентообладатель ФГУ Новосибирский НИИТО Росмедтехнологий. - № 2009129577/14; заявл. 31.07.2009; опубл. 10.03.2011, Бюл. № 7; приоритет 31.07.2009. - 9 с.: ил.

4

5

№ 1[март] 2012

6. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats /J. Chen, P.R. Sanberg, Y. Li [et al.] //Stroke. - 2001. - Vol. 32. - P. 2682-2688.

7. The impact-acceleration model of head injury: injury soverity predicts motor and cognitive performans after trauma /A. Beaumont, A. Marmarou, A. Czigner [et al.] //Neurol. Rls. - 1999. - Vol. 21.

- P. 742-754.

8. Пономарева, Н.С. Нейротропная активность аналога С-конце-вого фрагмента аргинин-вазопрессина-Ас-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH2: дис. ... канд. биол. наук /Н.С. Пономарева. - М., 2000.

- 194 с.

9. Действие аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на репаративные процессы в нервной ткани при диффузной травме головного мозга крыс /В.В. Южаков, А.Г. Конопляников, А.Ф. Цыб [и др.] //Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении: материалы Всерос. и междунар. научной конф., г. Москва, 30-31 мая, 2007 г. - М., 2007. - Режим доступа: rsmu.ru/fileadmin/rsmu/documents/.../book_tezisi_2007.doc

10. Apoptosis and expression of p53 response proteins and cyclin Dl after cortical impact in rat brain /S.S. Koya, A. Mahmood, Y. Li [et al.] //Brain Res. - 1999. - Vol. 818, N 1. - P. 23-33.

11. Brody, D.L. Electromagnetic controlled cortical impact device for precise, graded experimental traumatic brain injury /D.L. Brody, C. Mac Donald, C.C. Kessens //J. Neurotrauma. - 2007. - Vol. 24, N 4. - P. 657-673.

12. Лурия, А.Р. Высшие корковые функции человека и их нарушения при локальных поражениях мозга /А.Р. Лурия. - 2-е доп. изд. - М.: Энциклопедия, 1969. - 437 с.

Сведения об авторах: Information about authors:

Половников Е.В., аспирант, ФГУ Новосибирский НИИ травмато- Polovnikov E.V., postgraduate student, Novosibirsk scientific re-

логии и ортопедии Росмедтехнологий, г. Новосибирск, Россия. search institute of traumatology and orthopedics, Novosibirsk, Russia.

Ступак В.В., д.м.н., профессор, зав. отделением нейрохирургии, Stupak V.V., PhD, professor, head of neurosurgery department, No-

ФГУ Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии Росмедтехно- vosibirsk scientific research institute of traumatology and orthopedics,

логий, г. Новосибирск, Россия. Novosibirsk, Russia.

Самохин А.Г., к.м.н., зав. экспериментальной лабораторией, ФГУ Samokhin A.G., PhD, head of experimental laboratory, Novosibirsk

Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии Росмедтехнологий, scientific research institute of traumatology and orthopedics, Novosibirsk,

г. Новосибирск, Россия. Russia.

Васильев И.А., нейрохирург, ФГУ Новосибирский НИИ травмато- Vasilyev I.A., neurosurgeon, Novosibirsk scientific research institute

логии и ортопедии Росмедтехнологий, г. Новосибирск, Россия. of traumatology and orthopedics, Novosibirsk, Russia.

Шевела Е.Я., к.м.н., ст.н.с., лаборатория клеточной иммуноте- Shevela E.Y., candidate of medical sciences, senior researcher of

рапии, НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск, cellular immunotherapy laboratory, Scientific research institute of clinical

Россия. immunology, Novosibirsk, Russia.

Черных Е.Р., д.м.н., профессор, зав. лабораторией клеточной Chernykh E.R., PhD, professor, head of cellular immunotherapy labo-

иммунотерапии, зам. директора по науке, НИИ клинической иммуно- ratory, deputy director for science, Scientific research institute of clinical

логии СО РАМН, г. Новосибирск, Россия. immunology, Novosibirsk, Russia.

Адрес для переписки: Address for correspondence:

Шевела Е.Я., Shevela E.Y.,

ул. Ядринцевская, 14, г. Новосибирск, 630099, Россия. Yadrintsevskaya St., 14, Novosibirsk, 630099, Russia.

Тел: 8 (3832) 36-03-29 Tel: 8 (3832) 36-03-29

E-mail: ct_lab@mail.ru; pev37@mail.ru E-mail: ct_lab@mail.ru; pev37@mail.ru

т