CC BY
46
УДК 579.835.222
ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ДИА30ТР0ФНЫХ РИЗОБАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE SR55
А.С. Бойко, О.Н. Коннова, С.А. Коннова, Ю.П. Федоненко, 6.В. Игнатов
Саратовский государственный университет, кафедра биохимии и биофизики E-mail: Konnova [email protected]
Исследованы липополисахариды грамотрицательных диазо-трофных ризобактерий, стимулирующих рост растений, - Azospi-rillum brasilense SR55, изолированных с корней пшеницы в Саратовской области. Из наружной мембраны фенольной экстракцией выделен липополисахарид и изучен его химический состав. Среди основных компонентов гидрофобной части идентифицированы 3-гидрокситетрадекановая, 3-гидроксигексадекановая, гекса-декановая и октадеценовая кислоты, а в углеводной составляющей - рамноза, галактоза, З-О-метилрамноза и глюкуроновая кислота. Показано, что повторяющееся звено О-специфического полисахарида A. brasilense SR55 является разветвленным октасахаридом с остатком глюкуроновой кислоты в боковой цепи.
Characterization of the Lipopolysaccharide of the Diazotrophic Rhizobacterium Azospirillum Brasilense Sr55
A.S. Boyko, O.N. Konnova, S.A. Konnova, Yu.P. Fedonenko, V.V. Ignatov
This work was undertaken to investigate the lipopolysaccharide from gram-negative, plant-growth-promoting diazotrophic rhizobacterium Azospirillum brasilense SR55 isolated from the roots of wheat in Saratov oblast. The lipopolysaccharide was extracted from the outer membrane with phenol, and its chemical makeup was studied. The major components of the hydrophobic portion included 3-hydroxy-tetradecanoic, 3-hydroxyhexadecanoic, hexadecanoic, and octade-canoic acids; those of the carbohydrate portion included rhamnose, galactose, 3-0-methilrhamnose, and glucuronic acid. The repeated unit of the О-specific polysaccharide of A. brasilense SR55 was found to be a branched octasaccharide with a glucuronic acid residue in its sidechain.
Бактерии рода Azospirillum, распространенные в почвах прикорневой зоны широкого круга растений, являются диазотрофами, стимулирующими их рост. Большой научный и практический интерес представляют ассоциации бактерий Azospirillum brasilense со злаками, и в частности с пшеницей, в процессе формирования которых важная роль отводится поверхностным гликополимерам бактерий, в том числе и липополисахаридам (ЛПС) [1-3]. ЛПС вместе с белками обеспечивают целостность и стабильность бактериальной мембраны, селективную проницаемость, а также межклеточные взаимодействия с другими биосистемами [4]. Однако химическая структура ЛПС азоспирилл и сте-
пень участия в процессах взаимодействия с растениями исследованы недостаточно. В связи с этим целью нашей работы стало выделение и анализ ЛПС бактерий A. brasilense SR55, изолированных из ризосферы пшеницы Харьковская-46.
Бактериальная культура A. brasilense SR55 [5] получена из коллекции ИБФРМ РАН. Бактерии выращивали на жидкой ма-латной среде до окончания экспоненциальной фазы роста (18-20 ч) [1]. Капсульный материал с поверхности клеток отмывали 0.15 М NaCl с добавлением NaN3. Экстракцию ЛПС проводили из высушенных ацетоном клеток по методу Вестфаля [6].
Высокомолекулярную фракцию полимера получали методом гель-фильтрации на колонке с носителем Sepharose CL-4B («Pharmacia», Щвеция), элюцию проводили 0.025 М NH4HCO3 (pH 8.3).
Ионообменную хроматографию выполняли на колонке с анионитом DEAE-Toyo-pearl 650 М (“Toyosoda”, Япония). Элюцию осуществляли ступенчато: вначале буфером трис-НС1 (0.01 М; pH 7.2), затем раствором NaCl в том же буфере в градиенте от 0.01 М до 1 М. Детекцию материалов проводили с помощью дифференциального проточного рефрактометра LKB 2142 (“LKB”, Швеция) и по оптической плотности продуктов реакции с фенолом и серной кислотой, измеренной при длине волны 490 нм.
Биополимерный состав препаратов определяли стандартными колориметрическими методами, описанными ранее [1]. Деградацию ЛПС проводили 1%-ной уксусной кислотой (pH 2.8) в течение 4 ч при 100°С.
Сахарный состав анализировали методом ГЖХ ацетатов полиолов после полного гидролиза полисахаридов 2 М CF3COOH (120°С, 2 ч), восстановления и ацетилирова-
© А.С. Бойко, О.М. Коннова, С.А. Коннова, ЮЛ, Федоненко, В.В. Игнатов, 2007
ния, а также методом ГЖХ-масс-спектромет-рии частично метилированных ацетатов по-лиолов [7]. Анализ образцов осуществлялся на хроматографе Hewlett-Packard 5890 с капиллярной колонкой Ultra 2 в градиенте температуры от 180 до 290°С со скоростью нагрева 10°С/мин и хромато-масс-спектрометре Hewlett-Packard 5889 с капиллярной колонкой HP-1 («Hewlett-Packard», США). Метилирование жирных кислот гидрофобной части молекулы JinCsR55 выполняли согласно методике [7]. В качестве стандартов применяли эталонные образцы фирмы «SUPLECO» (США). Электрофорез препарата JIHCsrss в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия проводили по методу Hitchcock (1983) [8].
Несмотря на то,что для азоспирилл не выявлено строгой приуроченности к расте-ниям-хозяевам, обнаружены некоторые особенности строения поверхностных гликополимеров, возможно, связанные с обитанием микроорганизмов в сходных экологических нишах. В частности, для большинства бактериальных штаммов, ассоциированных с пшеницей, показано преобладание рамнозы в составе капсульных полисахаридов и ЛПС [9]. В этом плане бактерии у! brasilense SR55 интересны тем, что были изолированы из ассоциации с пшеницей твёрдого сорта, в отличие от всех исследованных ранее «пшеничных» штаммов азоспирилл.
Для извлечения ЛПС§к55 использовали экстракцию горячим фенолом, что позволило получить препарат, практически свободный от примесей белка и нуклеиновых кислот. Выделение из экстракта высокомолекулярной фракции ЛПС§я55 проводили гель-фильтрацией, в результате чего получили очищенный препарат с выходом 2.1%. ЛПС$я55 выходил с холостым объемом колонки, имел профиль элюции, характерный для ЛПС азоспирилл (рис.1).
При определении биополимерного состава специфическими реакциями на каждый компонент обнаружено, что содержание углеводов было сравнительно невысоким и составляло 24.5+1.2%. Количество 2-кето-З-дезоксиоктоновой кислоты, являющейся связующим звеном между гидрофильной и гидрофобной частями молекулы ЛПС, составило 1.3±0.1%, а общего фосфора, участвующего
Аю
X, мл
Рис. 1. Профиль элюции ЛПС А. brasUen.se 8К55 на колонке с носителем БерИаи^е СЬ-4В
в закреплении полимера в мембране, -3.3±0.6% - больше, чем у других «пшеничных» штаммов. Достаточно низкое содержание белка (1.7±0.1%) и следовые примеси нуклеиновых кислот свидетельствовали о высокой степени очистки препарата.
После мягкого кислотного гидролиза ЛПС5Я55 1%-ной уксусной кислотой из гидролизата центрифугированием осадили липид А, выход которого составил 26.7%, а из растворимой фракции методом гель-фильтраций выделили ОПС5Я55 с выходом 14.5% от навески исходного препарата. Известно, что ЛПС в составе бактериальной мембраны может быть представлен тремя молекулярными формами: ^-формой, для которой характерно наличие «полноценного» О-специфического полисахарида (ОПС), ^-формой, у которой ОПС отсутствует, и £Я-формой, в которой к кору вместо полимерной цепи присоединено одно звено ОПС. Методом электрофореза в ПААГ показано, что в препарате ЛПС вяз 5» наряду с молекулами 5-формы, присутствовали Я-формы молекул в высокой концентрации (рис.2), чем, очевидно, и объясняется относительно невысокий выход препарата ОПС8Я55-
В составе гидрофобного компонента ЛПС8я55 - липида А, участвующего в стабилизации полимера в мембране за счет гидрофобного взаимодействия с фосфолипидами, методом ГЖХ метиловых эфиров идентифицированы насыщенные, гидрокси- и ненасы-
Бпологпя
61
Ріс. 2. Результат эжкгрофореза в ПААТ препарата JTTTCsr55
щенные жирные кислоты с длиной углеродной цепи ОТ С9 ДО С19- При этом основными по содержанию являлись 3-гидрокси-тетра-декановая, 3-гидроксигексадекановая, гекса-декановая и октадеценовая кислоты. Процентное соотношение и состав жирных кислот ЛПС5К55 оказались близкими к таковым других штаммов и видов азоспирилл, в том числе выделенных из ризосферы пшеницы [10,11].
Изучение углеводного компонента -ОПС5я55 начали с исследования его гетерогенности по плотности отрицательного заряда на колонке с ЭЕАЕ-Тоуореаг! 650М, в результате чего выявили его «анионные» свойства.
Анализ моносахаридного состава ОПС8я55 методом ГЖХ ацетатов полиолов продемонстрировал присутствие рамнозы, галактозы и неидентифицированного сахара в соотношении 4:2:1, т.е. преобладающим компонентом вновь оказалась рамноза, как и у ранее изученных «пшеничных» штаммов азосирилл. Наличие в составе ОПС8я55 глюкуроновой кислоты было показано ГЖХ ацетилирован-ных метиловых эфиров октилгликозидов. Методом ГЖХ-МС частично метилированных ацетатов полиолов (с С031) в ОПС^.^ были идентифицированы 3-замещенная гек-соза, 4-замещенная 6-дезоксигексоза, 3-заме-щенная 6-дезоксигексоза, 2,3-дизамещенная
6-дезоксигексоза, терминальная гексоза и 4-замещенная 3-0-Ме-6-дезоксигексоза в соотношении 2:2:1:1:1:1. Данные согласуются с результатами ГЖХ, если учесть, что в ходе подготовки образцов для ГЖХ-МС карбонильная группа глюкуроновой кислоты на стадии восстановления превратилась в гидроксил, а неидентифицированный моносахарид является З-О-метилрамнозой.
Таким образом, по предварительным данным повторяющееся звено OnCSR55 представлено разветвленным октасахаридом с остатком глюкуроновой кислоты в боковой цепи. Следует отметить, что это первый случай обнаружения гетероолигосахарида в качестве повторяющегося звена ОПС среди «пшеничных штаммов» A. brasilense и, кроме того, уроновая кислота, характерная для капсульных ПС азоспирилл, в составе ОПС выявлена впервые. Полученные результаты расширяют представление о молекулярном разнообразии гликополимеров, опосредующих взаимодействие азоспирилл с корнями растений.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (гранты 05-04-48123 и НШ 6177.2006.4).
Библиографический список
1. Konnova S.A., Makarov О.Е., Skvortsov I.М., Ignatov V. V. Isolation, fractionation and some properties of polysaccharides produced in a bound from by Azospirillum brasilense and their possible involvement in A zospiri II um - who at root interaction // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V.l 18. P.93-99.
2. Yegorenkova I. V., Konnova S.A., Sachuck V.N., Ignatov V. V. Azospirillum brasilense colonization of wheat roots and role of lectin-carbohydrate interactions in bacterial adsorption and root-hair deformation JJ Vlant SoiJ. 200J. V.231. P.275-282.
3. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. 2001. Т.70, №3. С.384-390.
4. Newman М.A., Dow J.M., Daniels M.J. Bacterial lipopoly-saccharides and plant-pathogen interactions // Europ. J. Plant Pathology. 2001. V.107. P.95-102.
5. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.В. и др. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология. 1988. Т.57, №2. С.275-278.
6. Вестфаль О., Янн К. Бактериальные липополисахари-ды // Методы химии углеводов. М.: Мир, 1967. С.325-332.
7. Hakomori S.-I. A rapid permetylation of glycolypids and polysaccharides catalyzed by methylsulfinyl carbanion in demethylsulfoxide//J. Biochem. 1964. V.55. P.205-208.
62
Научный отдел
8. Hitchcock P.J., Brown Т. М. Morphological heterogeneity among Salmonella lypopolysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983. V. 154. P.269-277.
9. Коннова C.A., Федоненко Ю.П., Игнатов В.В. Структура и функции гликополимеров поверхности азоснирилл // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями. М.: Наука, 2005. С.42-63.
10. Choma A., Russa R., Mayer Н., Lorkiewicz Z. Chemical analysis of Azospirillum lypopolysaccharides // Arch. Microbiol. 1987. V.146. P.341 -345.
11. Федоненко Ю.П., Здоровенко Э.Л., Коннова С.А. и др. Сравнительная характеристика липополисахаридов и О-спсцифических полисахаридов Azospirillum brasilense Sp245 и его Омегон-Кт-мутантов КМ018 и КМ252 // Микробиология. 2004. Т.73, №3. С. 180-187.
