CC BY
41
60. V'yunova T.V., Andreeva L.A. Peptide interactions with receptor systems of cells. 6th International Conference «Biological Basis of Individual Sensitivity to Psychotropic Drugs». Moscow region, Mytishchi area 9—13 november, 2015. Eksperimental'naya i klinicheskayafarmakologiya. 2015; (9): 17. (in Russian)
Vyunova TV, Medvedeva E.V., Andreeva L.A., Dergunova L.V., Limborska S.A., Myasoedov N.F.
POSSIBLE ROLE OF TRANSTHYRETIN IN THE BIOLOGICAL MECHANISM OF THE REGULATORY PEPTIDE NEUROPROTECTION
Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation
The peptide preparation Semax has been effectively used for therapy of ischemic stroke. However, the mechanisms of its action are insufficiently understood and actively studied. The full-genome analysis of the transcriptome implemented in our recent work demonstrated that under conditions of focal ischemia of rat brain the Semax modified the profile of the transcription activity of many genes. In this case, the difference in the transcription levels of the gene encoding the protein transthyretin (Ttr) expression in rats under the pathological conditions of ischemia and in the presence of
Semax was very high. High similarity between the effects of Ttr and coupled molecular systems with the Semax effects in ischemic stroke allowed us to suggest that the neuroprotection mechanisms of Semax (and, possibly, of other neuroprotection mechanisms of Semax) could be mediated by Ttr. In this review, we discussed the role of Ttr in CNS and its possible role in the neuroprotection mechanism of Semax.
Key words: regulatory peptides, Semax, transthyretin (prealbumin), cerebral ischemia, neuroprotection
For citation: Vyunova T.V., Medvedeva E.V., Andreeva L.A., Dergunova L.V., Limborska S.A., Myasoedov N.F. Possible Role of Transthyretin in the Biological Mechanism of the Regulatory Peptide Neuroprotection. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobi-ologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2016; 34(3): 4-11 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613 -2016-34-3-104-109.
For correspondence: Ekaterina V. Medvedeva - Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, 123182, Moscow, Russian Federation; E-mail: [email protected] Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Funding. This work was supported by the Russian Science Foundation (Project No. 16-14-00077).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.67
Крестьянова И.Н.1, СахибгараеваЛ.Ф.1, Березина О.В.1, Рыков С.В.1, Завьялов А.В.1, Зверлов В.В.2'3, Яроцкий С.В.1
ХАРАКТЕРИСТИКА ГРИБНЫХ ШТАММОВ — ПРОДУЦЕНТОВ ТЕРМОСТАБИЛьНЫХ
ксилоглюканаз из всероссийской коллекции промышленных
микроорганизмов
1 ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», 117545, Москва, Россия; 2 Технический университет г. Мюнхена, Институт микробиологии, 85345, Фрайзинг, Германия; 3 Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, Россия
Проведен скрининг ксилоглюканазной активности грибных штаммов, участвующих в биодеградации природной растительной биомассы, из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). В условиях глубинного культивирования термофильные штаммы Sporotrichum thermophile ВКПМ F-972, Myceliophthora thermophila ВКПМ F-244 и 8ро-rotrichum pruinosum ВКПМ F-235 секретировали ксилоглюка-назы с оптимумом активности при 60 °С, рН 5,0. Ферменты сохраняли 88—100% исходной активности после инкубации при 50 °С и 79—84% исходной активности после инкубации при 60 °С в течение часа. Штаммы S. thermophile ВКПМ F-972, M. thermophila ВКПМ F-244 и S. pruinosum ВКПМ F-235 могут быть использованы в качестве источников генов для дальнейшего получения высокоактивных продуцентов термостабильных ксилоглюканаз.
Ключевые слова: растительная биомасса, ферментативный гидролиз, ксилоглюкан, ксилоглюканаза, Mycelio-phthora thermophila, Sporotrichum thermophile, Sporotrichum pruinosum.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-3-109-114.
Для корреспонденции: Березина Оксана Валентиновна, канд. биол.
наук, старший научный сотрудник лаборатории технологического
развития ФГУП ГосНИИгенетика, e-mail: [email protected]
Ксилоглюкан (КГ) — один из основных структурных полисахаридов первичной клеточной стенки I типа, которой обладают все двудольные и значительная часть однодольных растений (например, Lilianae, Aranae). В клеточной стенке I типа КГ и пектины формируют матрикс, в который погружены микрофибриллы целлюлозы, образующие каркас. В клеточной стенке II типа (однодольные коммелино-видной группы: Poanae, Arecanae, Commelinanae, Bromelianae, Zingeberanae, Juncanae) основу ма-трикса составляют P-D-глюкан со смешанным типом связей и глюкуроноарабиноксилан (табл. 1). В семенах некоторых растений (Tamarindus indica, Tropaeolum majus) КГ выполняет запасающую функцию и поэтому может служить богатым источником сахаров для биотехнологических процессов [1—4].
Остов молекулы КГ состоит из мономеров 1,4-0-D-глюкотетрозы, три из четырех глюкозных остатков в которой связаны а-1,6 связями с остатками D-ксилозы. В свою очередь остатки ксилозы могут быть соединены Р-1,2 связями с остатками D-галактозы или L-арабинозы. Остатки D-галактозы могут быть связаны а-1,2 связями с остатками L-фукозы (рис. 1).
Модификация остатков ксилозы видоспецифична, что определяет разнообразие типов КГ в растениях.
Эндоксилоглюканазы (ксилоглюкан-специфические эндо-Р-1,4-глюканазы, EC 3.2.1.151) расщепляют Р-1,4 связи между мономерами молекулы КГ, при этом конечными продуктами гидролиза наиболее изученного КГ из семян тамариска являются олигосахариды XXXG, XLXG, XXLG, XLLG. По классификации CAZY (The Carbohydrate-Active Enzymes database, http://www.cazy. org/) эндоксилоглюканазы относятся к семействам гликозил-гидролаз GH5, GH9, GH12, GH16, GH26, GH44, GH74. Ксилоглюкан-специфические экзо-Р-1,4-глюканазы (EC 3.2.1.155, GH74) процессивно отщепляют мономеры КГ с концов цепи. Экзо-ксилоглюканазы типа OXG-RCBH (oligoxyloglucan reducing-end-specific cellobiohydrolase, EC 3.2.1.150, GH74) отщепляют два глюкозных остатка с редуцирующего конца цепи.
Эффективный гидролиз ксилоглюканового матрик-са — необходимое условие для последующей полной деградации растительной биомассы до сахаров. Кроме того, КГ может служить ценным источником разнообразных олигосахаридов для пищевой и кормовой промышленности, производства пищевых добавок и фармацевтики [5]. Царство «Грибы» включает большое количество видов, участвующих в биодеградации природной растительной биомассы и продуцирующих широкий спектр гликозил-гидролаз, включая специфические кси-логлюканазы [6—10]. Сапротрофные и фитопатогенные виды грибов могут служить источниками новых ксило-глюканаз для биотехнологии, при этом особый интерес вызывают термофильные штаммы, продуцирующие термостабильные ферменты.
Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) содержит 644 грибных штамма, принадлежащих к различным таксономическим группам. Цель данной работы — поиск грибных штаммов-продуцентов термостабильных ксилоглюканаз в коллекции ВКПМ. В задачи работы входили определение уровня активности ксилоглюканаз, секретируемых штаммами в условиях глубинного культивирования, исследование зависимости активности внеклеточных ксилоглюканаз от температуры и pH, исследование термостабильности.
Материал и методы
Скрининг культур. 21 штамм грибов, участвующих в биодеградации природной растительной биомассы и продуцирующих гликозил-гидролазы, из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) был использован для оценки уровня внеклеточной кси-логлюканазной активности (табл. 2). Все культуры хранились в лиофилизированном виде в запаянных ампулах. Штаммы, секретирующие ксилоглюканазы, активные при повышенной (60 °С) температуре, были отобраны для дальнейшей работы.
Реактивы. Для приготовления микробиологических сред использовали компоненты производства «HiMe-dia», Индия, и глюкозу производства «Maize Products», Индия. Для определения ферментативной активности использовали ксилоглюкан семян Tamarindus indica (Megazyme, Ирландия), натриевую соль карбоксиметил-целлюлозы средней вязкости (КМЦ), Р-глюкан из ячменя, 3,5-динитросалициловую кислоту (ДНС) производства Sigma-Aldrich, США. В работе использовали изо-пропанол, соли, кислоты, щелочи квалификации ОСЧ и ХЧ («Химмед», Россия).
Культивирование штаммов. Для выращивания штаммов F-235, F-244, F-972, F-249, F-339, F-367, F-199, F-623, F-63, F-989, F-498, F-834 использовали карто-
L-Fuc (а1-2) i
D-Gal(pl-2) D-Gal(pl-2)
I I
D-Xyl(a1 -6) D-Xyl(a1 -6) D-Xyl(a1-6)
I I i
-D-Glu(p1-4)-D-Glu(p 1-4)-D-Glu(p1-4)-D-Glu(p 1-4) -
D-Gal(pi-2) L-Ara(a1-2)
I I
D-Xyl(a1 -6) D-Xyl(a1-6) D-Xyl(a1 -6)
I I I
-D-Glu(p 1 -4) - D-Glu(f31 -4) - D-Glu(f? 1 -4) - D-Glu(p 1 -4) -
Рис. 1. Структура и аббревиатура некоторых олигосахаридов ксилоглюкана (предложена Фраем [1]). D-глюкоза модифицирована: X — D-ксилозой; 1 — D-ксилозой и D-галактозой; F — D-ксилозой, D-галактозой и Ь-фукозой; S — D-ксилозой и Ь-арабинозой; G — D-глюкоза не модифицирована.
фельный агар, г/л: картофель — 200, глюкоза — 20, бактериологический агар — 15. Для выращивания штаммов F-608, F-1126, F-266, F-632, F-181, F-575, F-682 использовали мальт-агар, г/л: мальт-экстракт — 30, микологический пептон — 5, бактериологический агар — 15.
Штаммы высевали на чашки с картофельным или мальт-агаром (1-я генерация). Характерную морфологию клеток и отсутствие посторонней микрофлоры проверяли путем микроскопирования («раздавленная» капля или фиксированный мазок, окрашенный метиленовым синим).
Культуры 1-й генерации пересевали на чашки со средами того же состава (2-я генерация). Культуры 2-й генерации пересевали в пробирки со скошенным агаром того же состава (3-я генерация). Культуры каждой генерации выращивали в течение 10 сут на каждом этапе до достижения стадии споруляции.
Глубинное культивирование. Для биосинтеза кси-логлюканаз была использована жидкая ферментационная среда, г/л: овсяные отруби—20, дрожжевой экстракт—0,5, №N03 — 6; КНГО4 —1,52, КС1 — 0,52, MgS04•7H20 — 0,52, ZnSO4•7H20 — 0,001, Feaз — 0,000085, рН 5,0. Для засева ферментационной среды использовали партии культур 3-й генерации. Мицелий со скошенного агара площадью 0,5 см2 измельчали в 10 мл стерильной воды до образования суспензии, которую в объеме 10% стерильно вносили в колбы для культивирования. Глубинное культивирование проводили на качалке при 240 об/мин в течение 7 сут в колбах Эрленмейера объемом 750 мл при оптимальной для каждого штамма температуре (см.
Таблица 1
Содержание основных полимеров в нелигнифицированной первичной клеточной стенке I и II типа (цит. [2])
Полимер Тип I Тип II
Целлюлоза 30 30
Пектиновые вещества 35 5
Глюкуроноарабиноксилан 5 30
Р-глюкан со смешанным типом связей 0 30
Ксилоглюкан 25 4
Белки 5 1
Таблица 2
Результаты скрининга грибных штаммов из коллекции ВКПМ
№ Название и номер штамма в ВКПМ Источник выделения /применение штамма* Температура ферментации, °C Морфология культуры Активность на КГ, Ед/мл
1 Humicola grisea древесина гниющего пня/источник 28 Рост слабый. В среде много автолизиро- не обнару-
F-181 целлюлаз ванных клеток. Артроспор с проростками нет жена
2 Termitomyces sp. F-339 —/ источник целлюлаз 28 Активный рост. Рост локально-диффузный, из плотных микроколоний. Имеются лизированные участки гиф не обнаружена
3 Phellinus igniarius плодовое тело на березе/древоразру- 28 Рост слабый. Мицелий слабо развет- не обнару-
F-575 шитель влен, много обрывков и пустых гифов. Мицелий распался, споры в поле зрения жена
4 Geotrichum candidum F-266 производственная биомасса гидролизного завода/порча растительной биомассы 28 Рост слабый. Присутствуют короткие гифы. Обнаружены лизированные пустые гифы 0,04
5 Byssochlamys nivea F-985 коллекция DSM (штамм DSM 1824)/ порча фруктов и силоса 28 Рост слабый. В среде много автолизиро-ванных клеток. Артроспор с проростками нет 0,04
6 Sepedonium sp. F-249 солома озимой пшеницы/продуцент комплекса целлюлитических ферментов; источник гидролитических ферментов 28 Активный рост. Мицелий в виде гиф из цепочек артроспор 0,09
7 Phlebia radiate F-682 —/деструкция целлюлозы; древораз-рушитель 28 Активный рост. Многочисленные микроколонии из артроспор с проростками 0,12
8 Fusarium sambucinum F-199 почва/источник пектиназы 28 Активный рост. Многочисленные микроколонии из артроспор с проростками 0,15
9 Fusarium avenaceum F-623 стебель клевера ползучего/фитопа-тоген 28 Активный рост. Культура густая, образована артроспорами с проростками 0.17
10 Ganoderma applanatum F-632 древесина березы/древоразрушитель 28 Активный рост. Культура густая, образована артроспорами с проростками 0,23
11 Trichoderma longibrachiatum F-367 почва/основа ФП Целлобранин; силосование кормов 28 Рост слабый. В среде много автолизиро-ванных клеток. Артроспор с проростками нет 0,63
12 Schizophyllum commune F-498 древесина, коллекция АТСС (ATCC 38548)/ древоразрушитель; источник целлюлаз и гемицеллюлаз 28 Рост слабый. Мицелий слабо разветвлен, базофилия слабо выражена, споры отсутствуют 0,63
13 Penicillium griseofulvum F-63 отмершая древесина, коллекция АТСС (ATCC 10120)/источник бета-1,3-глюканазы 28 Активный рост. Рост диффузный из мелких микроколоний, образованных цепочками артроспор. Базофилия выражена 1,12
14 Rhizomucor miehei коллекция DSM (DSM 1330)/ источ- 37 Рост слабый. Присутствуют короткие не обнару-
F-989 ник альфа-амилазы гифы. Обнаружены лизированные пустые гифы жена
15 Talaromyces древесина, коллекция ATCC (ATCC 37 Рост слабый. Мицелий слабо развет- не обнару-
thermophilis F-834 10518)/— влен, базофилия слабо выражена, споры отсутствуют жена
16 Sporotrichum pruinosum F-278 —/источник целлюлазы 37 Активный рост. Мицелий сильно разветвлен, базофилия хорошо выражена, спор мало 0,77
17 Sporotrichum pruinosum F-235 —/источник эндоглюканазы 40 Активный рост. Мицелий сильно разветвлен, базофилия хорошо выражена, спор мало 0,84
18 Myceliophthora thermophila F-244 коллекция DSM (DSM 1807)/источ-ник целлюлаз 40 Активный рост. Мицелий сильно разветвлен, базофилия хорошо выражена, спор мало 0,99
19 Sporotrichum thermophile F-972 коллекция ATCC (ATCC 36347)/ис-точник глюкоамилазы 40 Активный рост. Мицелий сильно разветвлен, базофилия выражена, спор много 1,40
20 Thermomyces ил, коллекция DSM (DSM 10635)/ис- 43 Рост слабый. В среде много автолизиро- не обнару-
lanuginosus F-1126 точник ксиланазы ванных клеток. Артроспор с пророст- жена
ками нет
21 Rhizomucor pusillus F-608
рубец коровы, коллекция ATCC (ATCC 42782)/—
43
Рост слабый. Мицелий слабо разветвлен, базофилия слабо выражена, споры отсутствуют
0,18
Примечание. * данные коллекции ВКПМ. — информация отсутствует.
Таблица 3
Получение 10-кратных ККж штаммов F-972, F-244 и F-235
Продуцент Объем Суммарный Общая Удельная активность, Степень Выход, %
препарата, мл белок, мг активность*, ед. ед./мг белка очистки, раз
КЖ Б-972 30 63,0 51,0 0,8 1 100
ККЖ Б-972 3 15,3 46,2 3,0 3,9 90,6
КЖ Б-244 30 48,0 35,1 0,7 1 100
ККЖ Б-244 3 11,4 31,8 2,8 4 90,6
КЖ Б-235 30 36,0 27,9 0,8 1 100
ККЖ Б-235 3 12,6 25,2 2,0 2,5 90,3
Примечание. * — Данные получены при 60°С.
табл. 2). Информация об оптимальной температуре роста штаммов предоставлена коллекцией ВКПМ.
Получение концентратов культуральной жидкости (ККж). По окончании процесса ферментации куль-туральную жидкость (КЖ) центрифугировали при 3000 g, биомассу удаляли. Белки, содержащиеся в супернатан-тах КЖ, осаждали, добавляя 3,5-кратный объем изо-пропанола. Осадок отделяли центрифугированием при 12 000 g и растворяли в 1/10 исходного объема 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,0. Нерастворимую фракцию отделяли центрифугированием при 10 000 g. Содержание белков в концентратах определяли по Брэдфорд [11]. При концентрировании изопропанолом потери ксило-глюканазной активности не превышали 10%, степень очистки составила 2,5—4 раза (табл. 3).
Оценка внеклеточной гликозил-гидролазной активности. Активность секретируемых гликозил-гидролаз определяли спектрофотометрически с помощью динитросалицилового реагента [12]. Для скрининга ксилоглюканазной активности использовали отделенную от мицелия КЖ грибных штаммов. Реакцию гидролиза ксилоглюкана проводили в 1 мл смеси, содержащей 100 мкл КЖ, 0,5% КГ, 0,1 М ацетатный буфер, рН 5,0. Гидролиз ксилоглюкана проводили в течение 10 мин при 50 °С. Для оценки субстратной специфичности избранных штаммов реакцию гидролиза проводили в течение 10 мин при 50°С в 1 мл смеси, содержащей 50 мкл ККЖ, 0,5% субстрат (КГ, Р-глюкан или КМЦ) и 0,1 М Па-фосфатный буфер, рН 6,0. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое
Рис. 2. Активность ксилоглюканаз в КЖ грибных штаммов. А — культивирование при 28°С: 1 — F-266, 2 — F-985, 3 — F-249, 4 — F-682, 5 — F-199, 6 — F-623, 7 — F-632, 8 — F-367, 9 — F-498; 10 — F-63; Б — культивирование при 37°С: 11 — F-278; В — культивирование при 40°С: 12 — F-235, 13 — F-244, 14 — F-972; Г — культивирование при 43°С: 15 — F-608.
необходимо для образования 1 мкмоль восстанавливающих сахаров в минуту. В качестве стандарта использовали калибровочный раствор глюкозы.
Для определения оптимумов рН и температуры использовали ККЖ штаммов. рН оптимум активности исследовали при рН 3—6 (в 0,1 М ацетатном буфере) и рН 6—8 (в 0,1 М Па-фосфатном буфере) при 50 °С. Температурный оптимум активности определяли в диапазоне температур 40—80 °С с интервалом 5 °С при рН 6,0 (0,1 М Па-фосфатный буфер).
Термостабильность ферментов, гидролизующих КГ, определяли путем преинкубации КЖ при 50, 55, 60, 65, 70, 75 °С, рН 6,0 (0,1 М Па-фосфатный буфер) в течение часа с дальнейшим определением активности на КГ при 50 °С.
Все измерения проводили не менее 3 раз, погрешность измерений не превышала 4%.
Результаты и обсуждение
Из коллекции ВКПМ, содержащей 644 грибных штамма, был выбран 21 штамм грибов, участвующих в биодеградации природной растительной биомассы и продуцирующих различные гликозил-гидролазы (см. табл. 2).
В условиях глубинного культивирования на синтетической ферментационной среде при оптимальной температуре 15 штаммов синтезировали внеклеточные ксилоглюканазы. Наиболее высокий уровень активности на ксилоглюкане при 50 °С проявляли штаммы Р. griseofulvum F-63 (1,12 ед./мл КЖ), pruinosum F-278 (0,77 ед./мл КЖ), М. ^егторЫШ F-244 (0,99 ед./мл КЖ), ЛегторЫк F-972 (1,4 ед./мл КЖ), pruinosum F-235 (0,84 ед./мл КЖ) (табл. 2, рис. 2).
При 60 °С активность штамма F-63 понизилась и составила 0,73 ед./мл КЖ. Активность остальных четырех штаммов, наоборот, повысилась и составила 1,17 ед./мл КЖ у F-244, 1,7 ед./мл КЖ у F-972, 0,93 ед./мл КЖ у F-235 и 0,9 ед./мл КЖ у F-278. Для более подробной характеристики ксилоглюканазной активности были выбраны три штамма с наиболее высокой активностью при 60 °С: М. ЛегторЫ1а F-244, 5. ЛегторЫк F-972 и 5. pruinosum F-235. Необходимо отметить, что 5роюМсЫт ЛегторЫк и МусеНорЫЫт ЛегторЫ1а являются соответственно анаморфной и телеоморфной формами одного вида грибов. Тем не менее 5. ЛегторЫк F-972 и М. ЛегторШа F-244 — разные штаммы одного и того же вида.
Показано, что в условиях глубинного культивирования штаммы 5. ЛегторЫк F-972, М. ЛегторЫ1а F-244 и 5. pruinosum F-235 помимо ксилоглюканаз синтезировали внеклеточные ферменты, гидролизующие Р-глюкан и КМЦ (табл. 4). При измерении удельной активности на трех субстратах в ККЖ, для всех тестируемых штаммов наибольшая активность была зарегистрирована на Р-глюкане, наименьшая — на КМЦ. В одинаковых условиях культивирования удельная активность штам-
Таблица 4
зависимость активности ферментов, гидролизующих ксилоглюкан, от температуры
Штамм Относительная активность %
40 °C 45 °C 50 °C 55 °C 60 °C 65 °C 70 °C 75 °C 80 °C
S. thermophile F-972 28,1 43,1 62,0 76,5 100,0 92,1 48,4 44,7 22,3
M. thermophila F-244 34,8 49,8 70,5 84,2 100,0 88,1 34,8 15,2 2,2
S. pruinosum F-235 28,2 42,4 53,6 80,4 100,0 83,4 33,2 31,3 21,6
Таблиц а 5 c
зависимость активности ферментов, гидролизующих ксилоглюкан, от pH
Штамм Относительная активность, %
pH 3,0 pH 4,0 pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0
S. thermophile F-972 0 45,3 100 71,2 51,4 24,9 9,9
M. thermophila F-244 0 39,2 100 73,1 55,4 26,9 12,3
S. pruinosum F-235 0 40,5 100 67,9 47,6 21,4 10,7
ма F-972 на каждом из трех субстратов в два раза выше, чем у штамма F-244, что может быть следствием различий как между штаммами, так и между анаморфной и телеоморфной формами гриба.
Исследованы зависимости ксилоглюканазной активности от температуры в диапазоне 40—80 °С и от рН в диапазоне 3,0—9,0. Температурный оптимум внеклеточной ксилоглюканазной активности штаммов 5. thermophile F-972, М. ЛегторЫ1а F-244 и 5. pruinosum F-235 составил 60 °С; при 70 °С сохранялось 33—48% от исходной активности (табл. 5). рН оптимум ксилоглюканазной активности для всех трех штаммов составил 5,0 (табл. 6).
Исследована термостабильность ксилоглюканаз в диапазоне температур 50—75 °С (см. табл. 6). Показано, что ферменты сохраняют 88—100% исходной активности после инкубации при 50 °С и 79—84% исходной активности после инкубации при 60 °С в течение часа. Инкубация при 75 °С приводила к полной инактивации ферментов.
По данным СА2У и BEWNDA, грибные штаммы обычно синтезируют ксилоглюканазы, принадлежащие семействам GН74, GН12 или GН7. В настоящее вре-
Таблица 6
Термостабильность ксилоглюканаз, секретируемых штаммами S. thermophile F-972, M. thermophila F-244 и S. pruinosum F-235. Преинкубация в течение часа
Температура Остаточная активность, %
преинкубации, M. thermophila S. thermophile S. pruinosum
°C F-244 F-972 F-235
50 55 60 65 70 75
100 92,7 80,9 9,7 0,0 0,0
87,9 85,1 79,4 4,7 1,2 0,0
95,9 94,8 84,0 4,2 3,9 0,0
Таблица 7
Субстратная специфичность штаммов S. thermophile F-972, M. thermophila F-244 и S. pruinosum F-235
Штамм Удельная активность, Ед/мг общего белка ККЖ
Ксилоглюкан р-Глюкан | КМЦ
S. thermophile F-972 7,6 19,5 3,2
M. thermophila F-244 2,8 10,9 1,4
S. pruinosum F-235 6,0 18,1 2,9
мя определены нуклеотидные последовательности геномов Myceliophthora thermophila ATCC 42464 и Phanerochaete chrysosporium RP78 (S. pruinosum — анаморфная форма P. chrysosporium). В геноме M. thermophila ATCC 42464 обнаружены открытые рамки считывания (ОРС), гомологичные генам ксилоглюканаз из семейств GH 7 (6 ОРС), GH 12 (1 ОРС) и GH 74 (1 ОРС). В геноме Р. chrysosporium найдены ОРС, гомологичные генам ксилоглюканаз из семейств GH 7 (8 ОРС), GH 12 (1 ОРС), GH 74 (1 ОРС). Большое количество гомологичных последовательностей существенно затрудняет идентификацию генов ксилоглюканаз. Кроме того, многие семейства гликозил-гидролаз включают ферменты с разной субстратной специфичностью. Например, семейство GH12 помимо ксилоглюкан-специфических эндо-Р-1,4-глюканаз (ЕС 3.2.1.151) содержит эндоглю-каназы (ЕС 3.2.1.4), Р-1,3-1,4-глюканазы (ЕС 3.2.1.73) и ксилоглюкан-эндотрансгликозилазы (ЕС 2.4.1.207).
Наиболее хорошо изученными являются ксило-глюканазы семейства GH74. Согласно данным базы CAZY, на сегодняшний день охарактеризовано 10 бактериальных и 7 грибных гликозил-гидролаз из этого семейства. Большая часть из них являются представителями классов EC 3.2.1.150 и EC 3.2.1.151. Подробно исследован фермент Xgh74A из термофильной бактерии Ruminiclostridium thermocellum (ранее известной как Clostridium thermocellum). Являясь субъединицей цел-люлосомы, Xgh74A деполимеризует КГ на мономеры XXXG, XLXG (или XXLG) и XLLG, гидролизуя гли-козидные связи у немодифицированных остатков глюкозы. Xgh74A проявляет также высокую активность на лихенане и слабую на КМЦ и глюкуроноксилане [13]. Недавно исследован катаболизм КГ в R. thermocellum. Показано, что, кроме Xgh74A, по крайней мере еще три фермента целлюлосомы принимают участие в гидролизе КГ до олигосахаридов, которые затем импортируются в клетку специфическими белками-транспортерами. Дальнейший гидролиз олиго-ксилоглюканов до моносахаров происходит с участием цитоплазматических ферментов: Р-галактозидазы, а-ксилозидазы и Р-глюкозидазы [14].
Грибные ксилоглюканазы семейства GH74 охарактеризованы у представителей некоторых видов родов Aspergillus, Geotrichum, Phanerochaete и Trichoderma (данные CAZY). Из них наиболее подробно изученной являются экзоксилоглюканаза OXG-RCBH (EC 3.2.1.150) из Geotrichum sp. M128, отщепляющая целлобиозу с редуцирующего конца основной цепи КГ. Пространственная структура и механизм действия этого фермента определены [15, 16]. Кроме того, на сегодняшний день биохимически охарактеризована и экспрессирована в Pichia pastoris кси-логлюканаза Xgh74B из P. chrysosporium (S. pruinosum) [9], а также биохимически охарактеризована ксилоклю-каназа размером 78 кДа из штамма M. thermophila, ранее известного как Chrysosporium lucknowense [17].
Таким образом, термофильные штаммы грибов Sporotrichum thermophile F-972, Myceliophthora thermophila F-244 и Sporotrichum pruinosum F-235 из коллекции ВКПМ могут служить источниками генов термостабильных ксилоглюканаз для конструирования высокоактивных рекомбинантных продуцентов. Для ксилоглюканаз из перечисленных штаммов оптимум активности составляет 60 °C, pH 5,0. Ферменты сохраняют 88—100% исходной активности после инкубации при 50 °C и 79—84%
исходной активности после инкубации при 60 °C в течение часа.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014—2020 годы», соглашение о предоставлении субсидии № 14.628.21.0001, уникальный идентификатор соглашения — RFMEFI62814X0001.
Благодарность. Авторы выражают искреннюю благодарность зав. лабораторией молекулярных основ биотрансформаций Института биохимии им. А.Н. Баха РАН д.б.н. Королевой Ольге Владимировне за ценные советы при обсуждении результатов, а также с.н.с. ВКПМ к.б.н. Рыбакову Юрию Александровичу и зав. лабораторией генетики актинофагов и актиномицетов ФГУПГосНИИгенетика к.б.н. Воейковой Татьяне Александровне за помощь в культивировании штаммов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Fry S.C., Aldington S., Hetherington P.R., Aitken J. // Plant. Physiol. — 1993. — V. 103. — P. 1—5.
2. Горшкова Т. А. Растительная клеточная стенка как динамичная система.— М.: Наука, 2007.
3. Thompson J.E., Fry S.C. // Planta. — 2000. — V. 211. — P. 275—86.
4. Popper Z.A., Fry S.C. // Ann. Bot. — 2005. — V. 96. — P. 91—9.
5. Moreno F.J., Sanz M.L. (eds). Food Oligosaccharides production, analysis and bioactivity. — IFT Press Wiley Blackwell, 2014.
6. Markov A.V., Gusakov A.V., Dzedzyulya E.I., Ustinov B.B., Antonov A.A., Okunev O.N., Bekkarevich A.O., Sinitsyn A.P. // Appl. Biochem. Microbiol. — 2006. — V. 42. — № 6. — P. 573—83.
7. Синицына О.А., Федорова Е.А., Правильников А.Г., Рожкова А.М., Скомаровский А.А., Матыс В.Ю., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Ви-нецкий Ю.П., Синицын А.П. // Биохимия. — 2010. — Т. 75. — Вып. 1. — С. 52—62.
8. Марков А.В., Гусаков Л.В., Кондратьева Е.Г., Окунев О.Н., Бекка-ревич А.О., Синицын А.П. // Биохимия. — 2005. — Т. 70. — Вып. 6. — С. 796—804.
9. Ishida T., Yaoi K., Hiyoshi A., Igarashi K., Samejima M. // FEBS J. — 2007. — V. 274. — P. 5727—36.
10. Song S., Tang Y., Yang S., Yan Q., Zhou P., Jiang Z. // Appl Microbiol Biotechnol. — 2013. — V. 97. — P. 10013—24.
11. Bradford M.M. // Anal. Biochem. — 1976. — V. 72. — P. 248—54.
12. ГОСТ Р 53046—2008.
13. Zverlov V.V., Schantz N., Schmitt-Kopplin P., Schwarz W.H. // Microbiology. — 2005. V. 151. — P. 3395—401.
14. Ravachol J., de Philip P., Borne R., Mansuelle P., Maté M.J., Perret S., Fierobe H.-P. // Scientific Reports. — 2015. — V. 6:22770. — DOI: 10.1038/srep22770.
15. Yaoi K., Mitsuishi Y. // J Biol Chem. — 2002. — V. 277. — P. 48276—81.
16. Yaoi K., Kondo H., Noro N., Suzuki M., Tsuda S., Mitsuishi Y. // Structure. — 2004. — V. 12. — P. 1209—17.
17. Grishutin S.G., Gusakov A.V., Markov A.V., Ustinov B.B., Semenova M.V., Sinitsyn A.P. // Biochim. Biophys. Acta. — 2004. — V. 1674. — P. 268—81.
Поступила 01.04.16
REFERENCES
1. Fry S.C., Aldington S., Hetherington P.R., Aitken J.// Plant. Physiol. — 1993. — V. 103. — P. 1—5.
2. Gorshkova T. A. Plant cell wall as a dynamic system. — Moscow: Nauka, 2007.
3. Thompson J.E., Fry S.C. // Planta. — 2000. — V. 211. — P. 275—86.
4. Popper Z.A., Fry S.C. // Ann. Bot. — 2005. — V. 96. — P. 91—9.
5. Moreno F.J., Sanz M.L. (Eds.) // Food Oligosaccharides production, analysis and bioactivity. — IFT Press Wiley Blackwell, 2014.
6. Markov A.V., Gusakov A.V., Dzedzyulya E.I., Ustinov B.B., Antonov A.A., Okunev O.N., Bekkarevich A.O., Sinitsyn A.P. // Appl. Biochem. Microbiol. — 2006. — V. 42. — № 6. — P. 573—83.
7. Sinitsyna O.A., Fedorova E.A., Pravilnikov A.G., Rozhkova A.M., Sko-marovsky A.A., Matys V.Y., Bubnova T.M., Okunev O.N., Vinetsky Y.P., Sinitsyn AP. // Biochemistry (Mosc). — 2010. — V. 75(1). — P. 41—9.
8. Markov A.V., Gusakov A.V., Kondratyeva E.G., Okunev O.N., Bekkarevich A.O., Sinitsyn A.P. // Biochemistry (Mosc). — 2005. — V. 70(6). — P. 657—63.
9. Ishida T., Yaoi K., Hiyoshi A., Igarashi K., Samejima M. // FEBS J. — 2007. — V. 274. — P. 5727—36.
10. Song S., Tang Y., Yang S., Yan Q., Zhou P., Jiang Z. // Appl Microbiol Biotechnol. — 2013. — V. 97. — P. 10013—24.
11. Bradford M.M. // Anal. Biochem. — 1976. — V. 72. — P. 248—54.
12. GOST-R 53046—2008.
13. Zverlov V.V., Schantz N., Schmitt-Kopplin P., Schwarz W.H. // Microbiology. — 2005 V. 151. — P. 3395—401.
14. Ravachol J., de Philip P., Borne R., Mansuelle P., Maté M.J., Perret S., Fierobe H.-P. // Scientific Reports. — 2015. — V. 6:22770. — DOI: 10.1038/srep22770.
15. Yaoi K., Mitsuishi Y. // J Biol Chem. — 2002. — V. 277. — P. 48276—81.
16. Yaoi K., Kondo H., Noro N., Suzuki M., Tsuda S., Mitsuishi Y. // Structure. — 2004. — V. 12. — P. 1209—17.
17. Grishutin S.G., Gusakov A.V., Markov A.V., Ustinov B.B., Semenova M.V., Sinitsyn A.P. // Biochim. Biophys. Acta. — 2004. — V. 1674. — P. 268—81.
Krestyanova IN.1, Sakhibgaraeva L.F.1, Berezina O.V.1, Rykov S.V.1, Zavyalov A.V.1, Zverlov V.V.23, Yarotsky S.V.1
CHARACTERISTICS OF FUNGAL STRAINS PRODUCING THERMOSTABLE XYLOGLUCANASES FROM THE RUSSIAN NATIONAL COLLECTION OF INDUSTRIAL MICROORGANISMS
1State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, Moscow, Russian Federation; 2 Technical University of Munich, Institute for Microbiology, Freising, Germany; 3 Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation
Fungal strains degrading plant biomass available from the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) have been screened for the xyloglucanase activity. Under conditions of submerged cultivation, the thermophilic strains Sporotrichum thermophile VKPM F-972, Myceliophthora thermophila VKPM F-244, and Sporotrichum pruinosum VKPM F-235 produced extracellular xyloglucanases with optimal activity at 60°C, pH 5.0. 88-100% of the initial enzyme activity was retained after 1-h incubation at 50°C; 79-84% of the activity was retained after 1-h incubation at 60°C. S. thermophile VKPM F-972, M. thermophila VKPM F-244, and S. pruinosum VKPM F-235 strains may be used as the gene sources for construction of highly active producers of the thermostable xyloglucanases.
Keywords: plant biomass, enzymatic hydrolysis, xyloglucan, xyloglucanase, Myceliophthora thermophila, Sporotrichum thermophile, Sporotrichum pruinosum
For citation: Krestyanova I.N., Sakhibgaraeva L.F., Berezina O.V., Rykov S.V., Zavyalov A.V., Zverlov V.V., Yarotsky S.V. Characteristics of Fungal Strains Producing Thermostable Xyloglucanases from the Russian National Collection of Industrial Microorganisms. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2016; 34(3): 4-11 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-3-109-114.
For correspondence: Oksana V. Berezina - PhD, researcher of the laboratory of technological development, State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms (FGUP Gos-NIIgenetika), 117545, Moscow, Russian Federation; E-mail: [email protected]
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. This work was supported by the Ministry of Education and Sciences of the Russian Federation within the framework of the Federal Targeted Program for Research and Development in Priority Areas of Development of the Russian Scientific and Technological Complex for 2014-2020, Grant Agreement No. 4.628.21.0001, unique identifier RFMEFI62814X0001.
Acknowledgments. We are grateful to Ol'ga Vladimirovna Koroleva, DSc, head of the laboratory of the molecular underpinnings of biological transformations, Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences, for helpful discussions and comments. We are also grateful to Yuri Aleksandrovich Rybakov, PhD, senior researcher of the Russian National Collection of Industrial Microorganisms, and Tatiana Aleksandrovna Voeikova, PhD, head of the laboratory of actinophage and actinomycete genetics, State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, for the help in cultivation of strains.
