CC BY
44
moTi№i'^p7iZs Оригинальные статьи
© 2000, СПб РО РААКИ
ХАРАКТЕРИСТИКА АУТОИММУННОГО КОМПОНЕНТА ХРОНИЧЕСКОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА ПРИ ИДИОПАТИЧЕСКОМ ФИБРОЗИРУЮЩЕМ АЛЬВЕОЛИТЕ
Сесь Т.П., Колодкина Л.А., Котенко Т.В., Суркова Е. А., Новикова JIM.у Двораковская И.В., Бажанов А.А.
Научно-исследовательский институт пульмонологии при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им.академика И.П.Павлова
Резюме. Идиопатический фиброзирующий альвеолит (ИФА) характеризуется развитием в легочной ткани хронического воспалительного процесса с привлечением в очаг воспаления из периферической крови активированных нейтрофилов. Результаты нашего исследования показали, что число нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа при обострении ИФА в 110 раз превышает величину этого показателя у здоровых некурящих волонтеров. “Нейтрофильный” альвеолит у больных ИФА характеризуется развитием выраженного дисбаланса в протеазо-антипротеазной и оксидантно-антиоксидантной системах, что приводит к активации деструктивных процессов в легочной ткани и образованию аутоантигенных структур. При обострении ИФА в периферической крови больных регистрируются высокие уровни аутоантител к ДНК, антигенам ткани легкого, а также соединительнотканным белкам - эластину и коллагену.
Ключевые слова: аутоантитела, протеолитические ферменты, а. 1 -ингибитор протеиназ, антиоксиданты
Ses Т.Р., Kolodkina L.A., Kotenko Т. V., Surkova Е.А., Novikova L.N., Dvorakovskaya I. V., Bazhanov A.A.
CHARACTERISTIC OF AUTOIMMUNE COMPONENT
OF CHRONIC INFLAMMATORY PROCESS IN IDIOPATHIC PULMONARY FIBROSIS
Abstract. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is characterized by development of chronic inflammatory process in pulmonary tissue and attraction of activated neutrophils from peripheral blood to inflammatory site. The results of our investigation have shown that neutrophils number in BAL fluid in exacerbation of IPF was 110 higher than the same index in healthy nonsmoking volunteers. “Neutrophil” alveolitis in patients with IPF is characterized by an imbalance in pro-tease-antiprotease and oxidative-antioxidative systems, that leads to the activation of destructive processes in lung tissue and formation of autoantigen structures. In an exacerbation of IPF high levels of autoantibodies to DNA, to lung tissue antigens and to connective tissue proteins - collagens and elastin were registered in peripheral blood. (Med.lmmunol., 2000, vol. 2, N 3,pp 291-298)
В настоящее время трудами отечественных и за- Для клинической иммунологии по-прежнему
рубежных ученых накоплены многочисленные дан- наиболее важной остается проблема практического ные о молекулярных механизмах межклеточных вза- применения накопленных знаний для поиска диф-имодействий в развитии разных типов воспаления, ференциально-диагностических показателей, выбо-
о роли цитокинов и их рецепторов в поляризации ра правильной стратегии и тактики терапии и раз-иммунного ответа, о важном значении хемокинов и работки объективных критериев оценки эффектив-адгезионных молекул, о структурных и функцио- ности проводимого лечения.
нальных особенностях сигнальных клеточных сис- Данные о характере поляризации иммунного от-
тем. вета при развитии того или иного заболевания лег-
------------------------------------------ ли в основу новых направлений в терапии. Так, для
Адрес для переписки: успешного лечения заболеваний, вызываемых внут-
197089, С.-Петербург, ул. Рентгена д. 12. риклеточной инфекцией (туберкулез, малярия и др.),
Лаборатория молекулярной пульмонологии, требуется активация Т-лимфоцитов-хелперов 1 типа
Тел.. (812) 234-19-24 (Thl). При аутоиммунной патологии, напротив, сле-
Факс: (812) 234-90-46 Дует осуществлять лечебную тактику, направленную
на снижение функциональной активности ТЫ, при этом возможны различные схемы воздействий:
• применение антагонистов дифференцировки ТЫ, снижающих продукцию интерлейкина 12 (1Ь-12);
• защита от активированных натуральных киллеров (1ЧК) путем активации секреции IЬ-4 и/или 1Ы0[ 17].
Разработка подобных подходов к лечению аутоиммунной патологии наиболее интенсивно осуществляется в экспериментах на животных [6]. В последние годы появились также работы, свидетельствующие об успешном лечении аутоиммунных заболеваний в клинике при использовании блокирующих моноклональных антител к цитокинам [15].
Идиопатический фиброзирующий альвеолит (ИФА) не относится к классическим аутоиммунным заболеваниям - таким, например, как системная красная волчанка или ревматоидный артрит. Однако у больных ИФА при обострении заболевания и активации деструктивных процессов в легочной ткани могут развиваться аутоиммунные реакции в ответ на образующиеся в очаге воспаления аутоантигенные структуры [4,7,20 ].
Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей развития аутоиммунного компонента хронического воспалительного процесса, протекающего в легочной ткани больных ИФА.
Материал и методы исследования
Обследовано 32 больных ИФА (30 женщин и 2 мужчины среднего возраста 44,5±2,3 лет), находившихся на лечении в отделении интерстициальных заболеваний легких НИИ пульмонологии СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова. У всех обследованных больных заболевание характеризовалось хроническим течением, как правило,начиналось после перенесенного гриппа или ОРЗ и сопровождалось выраженной одышкой, кашлем, субфебрильной температурой тела, похуданием, слабостью. На рентгенограммах органов дыхания у больных отмечалась сетчатая деформация легочного рисунка. В зависимости от фазы заболевания больные были разделены на 2 группы: 16 человек обследованы в период обострения заболевания, 16 - в состоянии относительной клинической ремиссии. Контрольную группу составили 20 здоровых лиц, включая 12 некурящих волонтеров, которым был выполнен бронхоальвеолярный лаваж.
Материалом исследования служили клетки, выделенные из жидкости бронхоальвеолярного лава-жа (ЖБАЛ), а также образцы сыворотки крови.
В сыворотке крови методом иммуноферментно-го анализа определяли уровни аутоантител к ДНК,
эластину, коллагену, антигенам ткани легкого с использованием тест-систем производства НИИВС им И.И.Мечникова, Москва. С помощью наборов реагентов определяли аутоантитела в исследуемых сыворотках за счет специфического взаимодействия их с антигенами, сорбированными на пластике. Образовавшийся комплекс “антиген - антитело” выявляли с помощью конъюгата IgG - пероксидаза хрена. В качестве субстрата использовали перекись водорода, индикатором служил 0,8 % раствор 5 - аминосалициловой кислоты. Учет реакции осуществляли при длине волны 450 нм с помощью анализатора Е-LIZA - 3000 MAT (DRG, США) с программным управлением. Результаты выражали в условных единицах.
Содержание альвеолярных макрофагов, нейтро-филов и лимфоцитов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа оценивали методом световой микроскопии с использованием микроскопа “Jenaval”.
Субпопуляционный состав Т-лимфоцитов (число CD4+ и CD8+ клеток) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа изучали методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием реагентов НИИ иммунологии (“Сорбент”). Подсчет клеток осуществляли с помощью люминесцентного микроскопа “Люмам-Р1”.
Активность натуральных киллеров в ЖБАЛ определяли с помощью метода радиоиммунного анализа [5]. В качестве клеток-мишеней использовали перевиваемую миелолейкозную линию клеток человека К 562, отношение эффекторы/мишени составляло 25/1. Радиоактивность проб оценивали с помощью счетчика Racbeta (LKB).
Величину цитотоксического индекса рассчитывали по формуле:
ЦИ = ( 1 - имп/мин в лунках : эффекторы+мишени ) х 100%. имп/мин в контрольных лунках
Активность эластазы в ЖБАЛ определяли спектрофотометрическим методом [19] с использованием синтетического субстрата N-терт-бутилокисикар-бонил-1-аланин-паранитрофенилового эфира в ацетонитриле (BANPE) производства Государственного университета, Санкт-Петербург.
К 0,1 мл жидкости бронхоальвеолярного лаважа добавляли 2,8 мл 0,05 М фосфатного буфера (pH -6,5), пробу инкубировали в течение 5 минут при 25°С; добавляли 0,1 мл субстратного раствора BANPE. Прирост оптической плотности измеряли на спектрофотометре “SPECOLL 220” при длине волны 347,5 нм против пробы на реактивы в течение 15 минут с 5-минутными интервалами.
Активность эластазы выражали в условных единицах, одна условная единица активности соответствовала 1 нмоль гидролизированного субстрата за
1 минуту.
Расчет проводили по формуле:
0347 5- 3 ■ 546 /0,1 = ед / мл,
где 0347 5- прирост оптической плотности за 1 минуту;
3 - разведение исследуемого образца;
546 - коэффициент пересчета Б347 5 в 1 нмоль гидролизированного субстрата;
0,1 - количество жидкости бронхоальвеолярного лаважа, взятой в пробу /мл/.
Определение уровня а - ингибитора протеиназ в ЖБАЛ проводили методом ракетного электорофо-реза [1]. В качестве калибратора использовали стандарт а,- ИП (БЕУАС, Чехия). 10 мл 2% раствора агарозы на электродном буфере расплавляли на водяной бане, затем охлаждали до 56°С и добавляли 10 мл электродного буфера, содержащего 0,5 мл антисыворотки к а -ИП (состав буфера на 1литр дистиллированной воды : мединал - 6,5 г; веронал - 1,04 г; трис - 22,6 г; глицин - 28,16 г; pH - 8,8). Полученным раствором заливали стекло размером 9x12 см и формировали лунки. В первые 5 лунок вносили стандартный раствор а,-ИП в концентрации от 0,06 до 1 мкг на лунку, в остальные лунки вносили 5мкл исследуемых образцов жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Электрофорез проводили в течение 18 часов при и=100 В и 1=20 гпА. После окончания электрофореза гель высушивали фильтровальной бумагой под прессом в течение 20 минут при комнатной температуре и затем при 56°С - в течение 5 минут. Окрашивали гель 0,01% раствором Кумасси в-250 (10 минут). Отмывали гель раствором, содержащим 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты. Содержание о^-ИП в образцах жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных определяли по калибровочной кривой в зависимости от высоты получаемых пиков стандарта с^-ИП. Результаты выражали в мкг/мл.
Гидроперекисные радикалы (ГПР) определяли спектрофотометрическим методом [3]. Из 0,5 мл супернатанта ЖБАЛ или 0,25 мл сыворотки крови экстрагировали ГПР : довавляли 4 мл смеси изопропа-нол-гептан (1:1) и 1мл НС1 (pH 2), встряхивали, затем реэкстрагировали ГПР 2 мл гептана. После расслаивания раствора прозрачный верхний слой фотомет-рировали на спектрофотометре при 233 нм. Расчет концентрации проводили, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 2,2х10'5 М''см''. Результаты выражали в мМ/л.
Определение продуктов, реагирующих с тиобар-битуровой кислотой, в эритроцитах крови (малоновый диальдегид-МДА) проводили методом спектро-фотометрии [13]. К приготовленной из гепаринизи-рованпой крови 5% суспензии эритроцитов в смеси фосфатного буфера (pH 7,4) и физиологического раствора (1:1) добавляли 0,16 мл азида натрия и 2мл
0,68% перекиси водорода. Контролем служила проба, содержащая вместо перекиси водорода 2 мл физ. раствора. Пробы инкубировали 1 час при 37°С и после инкубации охлаждали, добавляли 1 мл 1% водного раствора тиобарбитуровой кислоты и помещали в водяную баню при 100°С на 15 мин. Затем пробы охлаждали и измеряли оптическую плотность растворов на спектрофотометре СФ-26 при 535 нм. Расчет концентрации производили, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 1,56 х 105 см-1 моль'1. Результаты выражали в мкмоль/мл эритроцитов.
Общую антиокислительную активность определяли спектрофотометрическим методом, используя в качестве субстрата свободный радикал 2,2 -дифенил-1-пикрил-гидразил (ДФПГ) [3,12 ].
В 0,25 мл сыворотки крови или 0,5 мл супернатанта ЖБАЛ осаждали белки смесью 10% водного раствора ванадиевого кислого Иа и 1/3 N серной кислоты (1:1); доводили полученный раствор до объема 1,5 мл дистиллированной водой, центрифугировали и к супернатанту добавляли 3 мл метанольного раствора ДФПГ (оптическая плотность 0,5-0,7 при 517 нм). Содержимое пробирки тщательно встряхивали и через 5 мин. (строго по времени) приливали 4 мл толуола. Экстрагировали остаток непрореагировавшего ДФПГ в верхний слой и после разделения фаз производили фотометрирование верхнего слоя на спекторофотометре СФ -26 при 517 нм. Результаты оценивали по калибровочной кривой (0,1 мкэкв. аскорбиновой кислоты вызывает падение оптической плотности на 0,24) и выражали в мкМ/л.
Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) проводили с помощью метода спекторофо-тометрии [3]. Выделение СОД из эритроцитов проводили следующим образом: эритроциты из 1мл ге-паринизированной крови гемолизировали 2 мл Н20, добавляли 1мл смеси хлороформ-этанол (2:1) и после центрифугирования и охлаждения супернатант разводили в 5 раз фосфатным буфером (pH 7,4). 0,2 мл экстракта из эритроцитов или 0,5 мл супернатанта ЖБАЛ вносили в реакционную смесь, состоящую из натрий-трифосфат-ЭДТА буфера pH 8,3 (1,3 мл) и водных растворов нитротетразолиевого синего (200мкг/мл - 1мл), феназинметасульфата (69 мкг/мл - 0,3 мл) и НАДФН2 (0,0002 М - 2мл). Полученный раствор фотометрировали при 532 нм на спектрофотометре СФ-26. Контролем служила дистиллированная вода. Результаты выражали в процентах подавления генерации супероксидного радикала в используемой реакционной среде.
Определение белка в исследуемых образцах производили спектрофотометрическим методом [22]. К 300 мл исследуемого образца ЖБАЛ добавляли 1мл раствора, содержащего 185 шМ Ма2С03, 98,1 шМ ИаОН, 0,39 тМ Си504 х 5Н20 и 0,7 шМ К№С4Н406х4 Н20(тартрат К,Ма). Пробы инкубировали в течение
3 мин. при 37°С, после чего добавляли раствор Фо-лина (1:1) и вновь инкубировали 3 мин. при 37°С. Величину оптической плотности определяли с помощью спектрофотометра СФ-26 при 750 нм. Расчет концентрации белка в исследуемых образцах производили с помощью калибровочной кривой, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА), результаты выражали в мкг/ мл.
Результаты
Изучение клеточного состава жидкости бронхоальвеолярного лаважа позволяет объективно оценить интенсивность и характер воспаления, протекающего в легочной ткани больных. В табл. 1 представлены данные, характеризующие общее число клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных ИФА, а также результаты дифференциального счета клеток.
Наиболее выраженные изменения клеточного состава ЖБАЛ у больных ИФА по сравнению со здоровыми отмечаются при подсчете абсолютного числа нейтрофилов (106 /мл). У некурящих волонтеров число нейтрофилов в ЖБАЛ составляет
0,03±0,002 х10б /мл. У больных ИФА при обострении заболевания число нейтрофилов в ЖБАЛ в 110 раз превышает это значение и составляет 3,3±0,3 х10б/мл. При относительной ремиссии заболевания число нейтрофилов достоверно (Р<0,05) снижается до 1,9±0,3 х106/мл, что, однако, по-прежнему существенно (более, чем в 63 раза) превышает контрольные значения.
В меньшей степени (в 5 раз) в ЖБАЛ больных ИФА повышено абсолютное число лимфоцитов по сравнению с группой здоровых (ЛФ, 106/мл), а содержание альвеолярных макрофагов (АМ, 106/мл) при обострении ИФА не отличается от показателей у волонтеров.
Полученные данные свидетельствуют о важной роли нейтрофилов в развитии воспаления в легочной ткани больных ИФА, в этой связи в литературе нередко используется термин “нейтрофильный аль-веолит”.
Адгезия нейтрофилов к эндотелию легочных капилляров и миграция в легкие из периферической крови сопровождается активацией ферментативных и оксидантных свойств нейтрофилов. Освобождение протеолитических ферментов из гранул нейтрофилов и генерация кислородных радикалов в очаге воспаления, как известно, приводит к активированию деструктивных процессов в легочной ткани. При этом наиболее выраженным ферментативным действием по отношению почти ко всем соединительнотканным структурам легких обладает нейтрофиль-ная эластаза, содержащаяся в азурофильных гранулах и экзоцитирующаяся в межклеточное простран-
Табл.1. КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ ЖБАЛ У БОЛЬНЫХ ИФА
Фаза Обострение Ремиссия Здоровые
АМ, % АМ, 106/мл НФ,% НФ,106/мл ЛФ,% ЛФ, 106/мл 52,1+5,6 * 5,7+0,6 29,6±5,6 * 3,3+0,3 * 18,2+4, * 2,0+0,4 * 59,7+7,6 * 6,3+0,5 * 18,3+2,3 * 1,9+0,3 * 22,0+3,4 * 2,3±0,3 * 92,7+1,4 4,9+0,5 0,6+0,04 0,03+0,002 6,7+0,4 0,4±0,03
Условные обозначения:
АМ-альвеолярные макрофаги,
НФ -нейтрофилы,
ЛФ-лимфоциты;
знак * в этой и последующих таблицах означает достоверность различий параметров у больных с показателями у здоровых (Р<0,05).
Табл. 2. УРОВЕНЬ <х,-ИП И АКТИВНОСТЬ ЭЛАСТАЗЫ В ЖБАЛ БОЛЬНЫХ ИФА
Фаза N Обострение 16 Ремиссия 16 Здоровые 12
Активность
эластазы,
нМ
10бкл/мин. 3,2+0,2 * 2,6±0,2 * 0,5±0,03
Уровень
а,-ИП,
мкг/мл 9,5+1,4 * 3,8+0,6 2,5+1,0
ство в условиях воспаления, а основным ее ингибитором в легочной ткани является с^- ингибитор про-теиназ (с^-ИП). Результаты изучения активности эластазы и уровня о^-ИП в ЖБАЛ больных ИФА, а также характеристика оксидантно-антиоксидантно-го баланса в крови и в ЖБАЛ представлены в табл. 2 и 3.
В ЖБАЛ больных ИФА при обострении заболевания активность эластазы в 6,4 раза превышает величину этого показателя в группе здоровых. При относительной ремиссии активность эластазы в ЖБАЛ снижается до 2,6±0,2 нМ 106кл/мин, что, однако, по-прежнему достоверно выше нормальных значений (Р<0,01).
Уровень с^-ИП в ЖБАЛ больных ИФА по сравнению с группой здоровых также достоверно повышен и составляет 9,5±1,4мкг/мл в фазу обострения. Такое выраженное повышение с^-ИП в ЖБАЛ больных при активном воспалении в легочной ткани, вероятно, носит компенсаторный характер. Вместе с тем, если рассчитать отношение с^-ИП / эластаза, то у здоровых лиц эта величина составляет 5,0, а у больных ИФА при обострении - всего лишь 2,97 (у.ед.).
Табл. 3. ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССОВ ПЕРОКСИДАЦИИ И АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ В КРОВИ И В ЖБАЛ У БОЛЬНЫХ ИФА
Показатель КРОВЬ ЖБАЛ
ИФА здоровые ИФА здоровые
п=19 п=20 п=16 п=12
ГПР, мМ/л 4,7+0,7 3,6+0,9 5,6+0,8 * 1,8+0,9
МДА,мкМ/мл эритр. 17,9+1,8 * 5,6+0,6 - -
АОА, мкМ/л 1090±80 1020+92 90±20 * 337+62
СОД, % 50,2±2,2 * 69,0±5,8 15,3+6,1 * 34,0+5,6
Белок, г/л - - 1,49+0,10 * 0,78±0,16
В ЖБАЛ больных ИФА достоверно (Р<0,001) повышен уровень гидроперекисных радикалов на фоне существенного снижения активности СОД (более, чем в 2 раза) и общей антиоксидантной активности (более, чем в 3 раза) по сравнению с соответствующими показателями у здоровых. В эритроцитах периферической крови больных ИФА отмечается достоверно (Р<0,001) более высокий уровень МДА на фоне сниженной активности СОД (Р<0,05) по сравнению с группой здоровых.
Таким образом, у больных ИФА наблюдается выраженный дисбаланс в системе а -ИП - эластаза, что, наряду с активацией процессов пероксидации на фоне снижения антиоксидантной защиты, может способствовать развитию процессов деструкции и приводить к образованию аутоантигенных структур с последующим запуском аутоиммунного ответа, в котором активное участие принимают хелперы ТЫ-типа. Безусловно, для полной характеристики типа поляризации иммунного ответа необходимо изучение уровней важнейших регуляторных цитокинов -интерлейкинов 4, 10, 12 , у-интерферона, играющих ключевую роль в запуске разных типов иммунного ответа. Анализ же общего числа СЭ4 и СО 8 клеток в ЖБАЛ больных ИФА несет информацию лишь о количестве различных субпопуляций лимфоцитов в непосредственной близости к очагу воспаления, при этом вычисление так называемого “субпо-пуляционного индекса” (СБ4 /С08 ), по-видимому, является не вполне целесообразным, поскольку поляризация ответов характерна как для СЭ 4 , так и для СБ 8 клеток.
Абсолютное число СЭ4 лимфоцитов (106кл/мл) в ЖБАЛ больных ИФА превышает величину этого показателя у здоровых в 6-7 раз, а число СБ8 клеток - в 8-9 раз, что свидетельствует об интенсивности иммунных реакций, протекающих в легочной ткани больных ИФА. Известно, что одним из ключевых факторов, запускающих дифференцировку Т-лимфоцитов по пути ТЬ 1 , наряду с 1Ь-12, является у-интерферон, важным источником которого в очаге воспаления служат активированные натуральные киллеры.
Табл. 4. СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ЖБАЛ БОЛЬНЫХ ИФА
Фаза N Обострение 16 Ремиссия 16 Здоровые 12
СО 4+, % 30,0±2,9 32,6+3,8 26,3±2,3
СО 4+,
106кл/мл 0,66+0,05 * 0,73±0,07 * 0,11 ±0,01
СО 8+, % 21,2+1,7 * 19,4+1,8 * 13,4±1,2
СО 8+,
106кл/мл 0,45+0,03 * 0,43+0,03 * 0,05+0,006
Табл. 5. АКТИВНОСТЬ НАТУРАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ В ЖБАЛ БОЛЬНЫХ ИФА
Фаза Обострение Ремиссия Здоровые
N 16 16 12
ЦИ £
ЖБАЛ, % 38,3±3,1 * 20,5+2,9 * 5,1+0,8
ЦИ о
ЖБАЛ, % 53,4±5,0 * 57,8±5,6 * 36,4±4,2
Условные обозначения:
ЦИ X ЖБАЛ - величина цитотоксического индекса Ж- клеток в суммарном клеточном составе ЖБАЛ;
ЦИ о ЖБАЛ - активность ИК после осаждения на пластик альвеолярных макрофагов.
Табл. 6. УРОВНИ АУГОАНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИФА
Фаза Обострение Ремиссия Здоровые
N 15 14 15
Уоовни
антител.
у.ед.:
к ДНК 1,83+0,18 * 1,37±0,13 1,23±0,21
к эластину 3,58+0,41 * 2,14±0,48 2,02+0,20
к коллагену 3,91 ±0,65 * 1,88±0,37 2,05±0,30
к антигенам
легочной
ткани 4,27±0,79 * 1,40±0,20 1,91 ±0,16
Результаты изучения функциональной активности ИК в очаге воспаления у больных ИФ А представлены в табл. 5.
Активность натуральных киллеров в ЖБАЛ больных ИФА при обострении процесса более, чем в 7 раз превышает величину цитотоксического индекса у здоровых, а при относительной клинической ремиссии величина ЦИ несколько снижается, однако по-прежнему достоверно (Р<0,01) превышает уровень контрольных значений. При этом альвеолярные макрофаги как у больных ИФА, так и у волонтеров, оказывают супрессирующее влияние на 1МК: после осаждения АМ величина ЦИ у здоровых возрастает с 5,1 ±0,8 до 36,4±4,4 % ; у больных ИФА при обострении заболевания - с 38,3±3,1 до 53,4±5,0 % , а при клинической ремиссии - с 20,5±2,9 до 57,8±5,6 %.
Столь выраженная активация натуральных киллеров и, вероятно, высокий уровень синтеза ими у-интерферона в очаге воспаления, могут создавать предпосылки к преимущественной активации ТЫ и формированию аутоиммунного ответа на вновь образующиеся в условиях воспаления аутоантигены. Об интенсивности аутоиммунных процессов у больных ИФА можно судить по уровню аутоантител в периферической крови (табл. 6).
При относительной клинической ремиссии в периферической крови больных ИФА не отмечаются повышенные уровни аутоантител к исследуемым антигенам. При обострении воспалительного процесса достоверно повышены уровни антител к ДНК, эластину, коллагену и антигенам легочной ткани (табл. 6). Полученные данные указывают на активацию аутоиммунных процессов у больных ИФА в период обострения заболевания.
Обсуждение
Идиопатический фиброзирующий альвеолит -заболевание легких неустановленной этиологии, которое характеризуется развитием в легочной ткани хронического воспалительного процесса с привлечением в очаг воспаления из периферической крови активированных нейтрофилов. Процессы деструкции и фиброзирования легочной ткани приводят к формированию выраженного пневмофиброза. На рентгенограммах органов дыхания на поздних стадиях развития заболевания у больных ИФА отмечается ячеистая перестройка легочного рисунка по типу “сотового легкого”, представляющего собой чередование участков фиброза и околорубцовой эмфиземы [2,11]. При этом жизненная емкость легких у таких больных существенно снижена, и при отсутствии адекватного лечения больные погибают вследствие нарастающей дыхательной недостаточности.
Известно, что приток нейтрофилов в легочную ткань из периферической крови активируется рядом
факторов воспаления. Основными хемоаттрактанта-ми для нейтрофилов являются интерлейкин 8, С5а-компонент комплемента и лейкотриен В4 [10,23]. Наиболее полно процессы адгезии нейтрофилов к эндотелию легочных капилляров охарактеризованы в экспериментах на животных, в которых изучено действие блокирующих моноклональных антител к интерлейкину 8 и к различным адгезионным молекулам на скорость притока нейтрофилов в легочную ткань и интенсивность формирования пневмофиб-роза[25].
Активированные альвеолярные макрофаги и ней-трофилы реализуют в очаге воспаления свои проте-олитические и оксидативные свойства. Основными ферментами, принимающими участие в процессах деструкции легочной ткани, являются:
• сериновые протеиназы - нейтрофильная эластаза, катепсин О, протеиназа 3
• цистеиновые протеиназы - катепсин Ь
• металлопротеиназы - желатиназа В.
Наиболее мощным повреждающим действием по
отношению к соединительнотканным структурам легочной ткани обладает нейтрофильная эластаза, преобладание которой над местным содержанием ее основного ингибитора -а,-ингибитора протеиназ приводит к выраженному дисбалансу в протеиназо-антипротеиназной системе и развитию деструктивных процессов в легочной ткани [18].
В развитии такого дисбаланса важную роль могут играть также и другие протеиназы. Так, например, цистеиновая протеиназа - катепсин Ь, проявляющая эластолитическую активность, в 100 раз превышающую активность катепсина В, способна к каталитической инактивации а, -ингибитора протеиназ [14]. Метаболиты активированного кислорода также способны к окислительной инактивации а,-ИП [9]. Субстратом большинства оксидантов, освобождаемых активированными нейтрофилами, альвеолярными макрофагами, и другими клетками-эф-фекторами воспаления, становятся белковые и липидные структуры мембран альвеолярного эпителия и, в меньшей степени, эндотелия легочных капилляров, а также белки базальной мембраны, липиды и гликопротеины сурфактанта. Длительно протекающий воспалительный процесс с местной наработкой большого количества метаболитов активированных кислорода может приводить к истощению системы антиоксидантной защиты легких, включающей ан-тиоксидантную активность трахеобронхиальных слизистых секретов; сурфактанта, содержащего глу-татионпероксидазу и глутатионредуктазу; актиокси-дантную активность клеточных мембран, представленную белковыми и небелковыми тиолами, холестерином, токоферолом; ферментативные защитные механизмы. И хотя в ответ на оксидантную агрессию в легочной ткани повышается антиоксидантный защитный потенциал: нарастает продукция глутати-
она, повышается активность супероксиддисмутазы и каталазы в альвеолярных макрофагах и эритроцитах, длительно протекающий воспалительный процесс может приводить к срыву адаптационных механизмов и к развитию дисбаланса в системе оксиданты- антиоксиданты [16]. Повреждение легочной ткани оксидантами - более сложный процесс, чем это предполагалось ранее. Тонкий баланс между ок-сидантными и антиоксидантными системами имеет важное значение для поддержания нормальной структуры и функции легких. В условиях патологии превалирование оксидантов, способных реагировать с большинством биологических макромолекул , включая липиды, протеины и нуклеиновые кислоты, приводит к модификации макромолекул и способствует потенцированию воспаления. Соотношение окисленного и восстановленного глутатиона, наличие кислородных интермедиатов, а также уровень внутриклеточных ферментов антиоксидантной защиты являются важными регуляторными факторами для запуска экспрессии генов и синтеза про-воспалительных цитокинов. Активация транскрипционного нуклеарного фактора (ЫР)-кВ под действием оксидантов повышает интенсивность синтеза и освобождения широкого ряда цитокинов эффек-торными клетками воспаления, к тому же сами оксиданты могут непосредственно индуцировать освобождение целого ряда хемокинов клетками легочной ткани [24].
При этом создаются условия для развития само-поддерживающегося процесса: в ЖБАЛ больных повышено содержание цитокинов и липидных медиаторов, которые могут прямо или косвенно активировать оксидантные свойства нейтрофилов. Генерируемые нейтрофилами активные формы кислорода и их производные, в свою очередь, стимулируют эф-фекторные клетки воспаления к продукции провос-палительных цитокинов, привлекающих нейтрофи-лы в легочную ткань.
Все эти и, возможно, другие механизмы, приводят в конечном итоге к повреждению легочной ткани, образованию аутоантигенных детерминант и индукции аутоиммунного ответа с последующим выходом в системную циркуляцию антител к ДНК, антигенам ткани легкого и к соединительнотканным белкам - эластину и коллагену.
Согласно современной концепции поляризации иммунного ответа, основными эффекторными клетками при аутоиммунной патологии являются Т-лимфоциты-хелперы 1 типа. В модельных экспериментах на мышах и при изучении ТЫ -типа ответа у человека показана важная роль у-интерферона и интерлейкина - 12 в индукции ТЫ: присутствие 1Ь-12 и/или у-интерферона в культуральной среде приводит к формированию пула Т- хелперов 1 типа, экспрессирующих оба компонента рецептора к интерлейкину 12 - (3, и (32 [21]. В настоящее время разраба-
тываются новые экспериментальные подходы к терапии аутоиммунной патологии, целью которых является подавление развития Thl - типа ответа. Показано, что если процесс созревания Т-лимфоцитов происходит в среде, содержащей IL-4 и нейтрализующие IL-12 моноклональные антитела, то развивающиеся Т клетки полностью теряют способность к экспрессии (32 - субъединицы IL-12-рецептора и, соответственно, к ответу на IL-12 [8 ].
Развитие ответа ТЫ-типа в легочной ткани больных ИФА может определяться совокупностью факторов, в том числе способностью эффекторных клеток воспаления к синтезу IL-12 и у-интерферона. Повышение активности натуральных киллеров в ЖБАЛ больных ИФА, по-видимому, может служить косвенным доказательством важной роли NK в активации ТЫ-типа. Остается открытым вопрос о причинах столь выраженной активации натуральных киллеров в легочной ткани больных ИФА. Поскольку вирусная этиология ИФА не исключена, мишенями для NK в легких, по:видимому, могут служить вирустранс-формированные клетки организма-хозяина.
В заключение следует отметить, что существующие в настоящее время схемы терапии больных ИФА, включающие применение кортикостероидов, антиоксидантов и препаратов с антифибротическим действием, при более углубленном изучении особенностей развития хронического воспалительного процесса в легочной ткани больных, могут быть существенно расширены. Так, например, использование блокирующих моноклональных антител к IL-8 способствовало бы снижению интенсивности “нейтро-фильного” альвеолита и процессов деструкции и фиброзирования легочной ткани, а ингибиция диф-ференцировки Т()-лимфоцитов в ТЫ, вероятно, могла бы приводить к снижению интенсивности аутоиммунных процессов при идиопатическом фибрози-рующем альвеолите.
Список литературы
1. Акельсен Н.Дрелль И., Вееке Б. Руководство по электрофорезу.-М.:Мир, 1977.-120 С.
2. Илысович М.М. Заболевания органов дыхания.
- СПб.: Нордмед-Издат, 1998, том 2,- 452 С.
3. Котенко Т.В. Биохимические методы исследования при неспецифических заболеваниях легких. -Методические рекомендации.-Л-д, 1984.
4. Путов Н.В., Илькович М.М. Фиброзирующие альвеолиты.-Л.: Медицина, 1986-120С.
5. Рыкова М.П., Спирадзе И.В., Вергилидзе М.С. Новая высокочувствительная техника тестирования нормальных киллеров //Иммунология,-1981.-N 3.-С.88-90.
6. Adorini L.,Tremblean S. Autoimmune Diabetes as a test for Thl/Th2 paradigm. //The immunologist.-1998.-Vol.
6, N4.-P. 146-150.
7. Agostini C., Semenzato G. Immunology of idiopathic pulmonary fibrosis. // Curr. Opin. Pulm. Med.- 1996. -N2.
- P.364-369.
8. Bach J. - F. Immune disregulation in organ-specific autoimmune diseases. // The Immunologist. - 1998. -Vol.
6, N4. - P.158-160.
9. Buhl R., Meyer A., Vogelmeier C. Oxidant-protease interaction in the lung. // Chest. - 1996. -Vol. 110. - P.267-272.
10. Cossatella M.A. The production of cytokines by polymorphonuclear neutrophils. // Immunology Today.-1995.-Vol. 16, N1.-P.21-26.
11. Dunnhill M.S. Pulmonary fibrosis. // Histopathology. -1990.-N. 16.-P.321-329.
12. Glavind G. Antioxidant in animal tissue. // Acta Chem Scand.-1979.-Vol. 47, N13.-P. 16-35.
13. Janero D.J.Malonedialdehyde and thiobarbituric acid reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injure. // Free Rad. Biol Med.-1990.-N9.-P.515-540.
14. Johnson D.A., Barrett A.J., Mason R.W. Cathepsin L inactivates a 1-proteinase inhibitor by cleavage in the reactive site region. // J. Biol. Chem.-1986.-Vol. 261, N12.-p. 14748-14751.
15. Kumar V., Sercaiz E., Adorini L. Regulatory Mechanisms in organ-specific autoimmunite. // The immunologist.-1998.-Vol. 6, N 4.-P. 161-166.
16. MacNee W. Inflammation and oxidative stress in lung diseases. // Pneumol. News. - 1998. - N3. - P.3-5.
17. Mitchison N.A. Thl / Th2 Recogsidered. // The Immunologist.-1998.-Vol. 6, N4,- P.136-145.
18. Nadel Y.A., Stokley R.A. Proteolytic enzymes and airway diseases. // Eur. Resp.J.-1998.-Vol.12.-P.1250-1251.
19. O’Conner C.M., Gaffney K., Keane G, Southley A., Byrne N., Mahoney S., Fitzerald M. al-Proteinase inhibitor, elastase activity and lung disease severity in cystis fibrosis. // Am. Rev. Resp. Dis. - 1993,-Vol. 148.-P.1665-1670.
20. Obayashi Y., Yamadori I., Fujita J. The role of neutrophils in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis. //Chest. -1997,- Vol. 112. - P.1338-1343.
21. Rogge L., SinigagliaT. Regulation of IL-12 receptor expression in developing T helper cell subsets. // The Immunologist. - 1998,-Vol. 6, N4.-P.142-145.
22. Shakir F.K., Audilet D.,Drake A, Shakir K. A rapid protein determination by modification of the Lowry procedure. // Annal Biochem. -1994. - Vol. 216, N1. - P.232-233.
23. Sibille Y., Marchadise F.-X. Pulmonary immune cells in health and disease: Polymorphonuclear neutrophils. // Eur. Resp J.-1993.-Vol.6,N10.-P. 1529-1543.
24. Suzuki Y. J., Forman H.J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction. // Free Rad. Biol. Med.-1997.-Vol. 22,Nl/2.-P.269-285.
25. Tsang Y.T.M., Neelamegham S., Hu Y. Synergy between L-selectine signalling and chemotactic activation during neutrophil adgesion and transmigration. // J. of Immunology.-1997.-Vol. 159, N9.-P.4565-4577.
поступила в редакцию 17.04.2000 принята к печати 02.06.2000
