CC BY
25ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
УДК: 619:616-089.843
ХАРАКТЕР ИЗМЕНЕНИЯ БИОАКТИВНОГО СЛОЯ ИМПЛАНТАТОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА ЕГО НАНЕСЕНИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ IN VITRO)
Н.А.Кононович - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.; А.В.Попков - доктор медицинских наук, профессор, гл.н.с.; Е.Н.Горбач - кандидат биологических наук, вед.н.с.; М.В.Стогов - доктор биологических наук, вед.н.с.; Д.А.Попков - доктор медицинских наук, профессор РАН, руководитель клиники Нейроортопедии.
ФГБУ «Российский научный центр«Восстановительная травматология и ортопедия»
им. акад. Г.А.Илизарова» Минздрава России, г.Курган (640014, Курган, М.Ульяновой, 6, тел.: (352) 241-52-73; e-mail: [email protected]).
Для обеспечения лучшей остеоинтеграции, а соответственно прочности фиксации имплантата с костью, его поверхность должна обладать остеоиндуктивными свойствами. Лучшее сходство с химическим составом костной ткани имеют кальций-фосфатные соединения. Существуют разные способы нанесения таких соединений на металлические имплантаты. В экспериментах in vitro изучали особенности кинетики высвобождения кальция и фосфата из биоактивного слоя, нанесенного на металлическую титансодержащую подложку. Образцы инкубировали в течение 28 сут в растворе электролита. В группе 1 слой наносили методом микродугового оксидирования (МДО), в группе 2 - высокочастотного магнетронного распыления (ВЧМР). В конце эксперимента визуально и методом сканирующей электронной микроскопии изучали состояние кальций-фосфатного слоя. Более высокую адгезионную прочность биоактивного слоя к металлической подложке определили у КФМДО. В группе 1 содержание Ca было уменьшено в 3,1 раза; Р - в 1,13 раза. В группе 2 снижение Ca было в 6,54 раза; Р - в 2,38 раза. Результаты исследования показали, что механизмы остеоиндуктивного действия кальций-фосфатного напыления могут быть связаны с диффузией Са с поверхности имплантатов в окружающие ткани. Степень активности данных процессов может зависеть от способа нанесения биоактивного покрытия. При использовании ВЧМР обеспечивается более кратковременное стимулирующее действие в сравнении с методом МДО. Эти данные необходимо учитывать при лечении повреждений и других патологических состояний костей, с использованием изделий покрытых биоактивным кальций-фосфатным напылением.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эксперимент, кость, имплантат, биоактивное покрытие, диффузия, кальций, фосфор.
В настоящее время, как в клинической медицине, так и в ветеринарии ведется активный поиск безопасных и эффективных материалов и технологий для лечения повреждений и заболеваний скелета, в том числе обширных костных дефектов [4, 7, 11, 12]. Достаточно перспективными в этом плане являются персонифицированные биоактивные имплантаты с развитой поверхностью [1, 9]. К числу последних можно отнести изделия, изготовленные из инертных металлов покрытых биоактивным слоем. Выраженными остеоиндуктивными свойствами обладают кальций-фосфатные соединения, имеющие более близкое по химическому составу сходство с костной тканью. В зависимости от технологии их нанесения на металлические подложки, возможно получить биоактивный слой различной толщины и пористости [5, 6, 10, 14]. Скорость деградации кальция и фосфата с поверхности таких имплантатов может определять степень и продолжительность процессов остеогенной активности, что представляет интерес с прикладной и фундаментальной точки зрения. Выявление подобного рода механизмов возможно при проведении комплекса экспериментальных исследований как in vitro, так и in vivo.
Цель исследования: морфологическими методами изучить особенности кинетики высвобождения кальция и фосфата с поверхности имплантатов, в зависимости от способа нанесения биоактивного слоя.
Материалы и методы. Выполнены две группы экспериментов in vitro. В группе 1 тестированию были подвергнуты стержни из титанового сплава Ti6Al4V с гидроксиапатитным слоем, нанесенным методом микродугового оксидирования (МДО; n=10). В группе 2 биоактивное напыление наносили методом высокочастотного магнетронного распыления (КФВЧМР; n=10). Тестируемые образцы были изготовлены на базе ФГАОУ Во «Национальный исследовательский Томский политехнический университет».
Каждый исследуемый образец помещали в отдельную измерительную ячейку, заполненную изотоническим 0,9%-ным раствором хлорида натрия. Объем электролита составлял 1 мл на 1 см2 поверхности стержня. Далее выполняли инкубирование при температуре 370С в течение 28 суток. После окончания инкубации осуществляли оценку поверхности каждого образца визуально макроскопически, а так же методами сканирующей электронной микроскопии и рентгеновского электронно-зондового микро-
анализа (определяли содержание кальция и фосфора; (W) в вес.%) с помощью СЭМ «PhenomProX» на базе ООО «Мелитэк», г.Москва.
За контроль принимали результаты, полученные с этих же образцов перед началом экспериментов.
Полученные количественные данные подвергали статистической обработке с использованием программы Atte Stat 13.1 (Россия). Для каждого анализируемого параметра определяли средние значения (М) и стандартное отклонение (SD). Достоверность различий оценивали с помощью W-критерия Вилкоксо-на. Различия показателей считали достоверными при р<0,05. Исследования выполнены с учетом рекомендаций ГОСТ ISO 10993-15-2011 «Межгосударственный стандарт. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 15. Идентификация и количественное определение продуктов деградации изделий из металлов и сплавов».
Результаты исследований. Выполненные исследования показали, что при использовании метода МДО для нанесения биоактивного покрытия на металлическую основу была сформирована матовая шероховатая пористая поверхность (рис. 1а, 2а). Методом рентгеновского электро-зондового микроанализа определили, что содержание кальция и фосфора на поверхности имплантатов составляло 6,94±0,47 и 16,3±0,4 вес.% соответственно, а соотношение Са/Р-0,42±0,02.
После инкубации тестовых образцов группы 1 в растворе электролита в течение 28 сут при макроскопической оценке видимых различий их поверхности в сравнение с контролем не обнаружили (рис. 1Ь). Микроскопически целостность биоактивного слоя была сохранена, трещин и повреждений другого характера не выявляли (рис. 3а). При этом в сравнении с контрольными значениями регистрировали достоверное уменьшение содержания Са в 3,1 раза (р=0,0003), Р -в 1,13 раза (р=0,007). Соответственно отношение Са/Р также было снижено в 2,8 раза (р=0,0003).
При визуальной оценке и СЭМ образцов группы 2 (КФВЧМР) перед началом инкубации биоактивный слой имел глянцевую гладкую структуру без наличия пор (рис. 1с, 2Ь). Содержание Са составляло 10,47±0,3 вес.%, Р - 3,85±0,17 вес.%, соотношение Са/Р было 2,72.
В этой группе опытов после окончания инкубации у всех образцов как визуально макроскопически, так и методом СЭМ определяли нарушение целостности кальций-фосфатного слоя. Поверхность имплантатов состояла из мозаично расположенных участков биоактивного покрытия. Остальную площадь занимали участки, на которых покрытие отсутствовало, либо происходило его слущивание (рис. 3Ь). В сравнении с исходными значениями содержание Са уменьшалось в 6,54 раза (р=0,0001), Р - в 2,38 раза (р=0,0001), а соотношение Са/Р было понижено в 1,98 раза.
Рис. 1. Внешний вид тестируемых образцов: а - КФМДО перед началом эксперимента, Ь-КФМДО через 28 сут после инкубации в растворе электролита, с - КФВЧМР перед началом эксперимента, й - КФВЧМР через 28 сут после инкубации в растворе электролита.
Выполненное исследование было посвящено изучению in vitro характеристики поверхности металлических имплантатов с кальций-фосфатным покрытием, нанесенным двумя разными технологиями, после инкубации в растворе электролита в течение 28 суток.
При выборе сроков эксперимента руководствовались результатами, полученными ранее, когда in vivo была показана зависимость биологического ответа
тканей от способа нанесения биоактивного слоя. Было определено, что через 4 недели вокруг внутрикостно расположенного имплантата с покрытием КФМДО образуется костная муфта плотного трабекулярного строения. При тестировании КФВЧМР к этому же сроку формировался рыхлый соединительнотканный футляр с более редкой трабекулярной сетью грубоволокни-стой костной ткани. Полученные результаты напрямую
Рис. 2. Увеличенная поверхность тестируемых образцов перед началом эксперимента, СЭМ. Увеличение 400х.: а - КФМДО, Ь- КФВЧМР.
Рис. 3. Увеличенная поверхность тестируемых образцов через 28 сут после инкубации в растворе электролита, СЭМ. Увеличение 330х.: а - КФМДО, Ь- КФВЧМР.
зависили от архитектоники поверхности тестируемых образцов. В том и другом случаях определяли усиление остеогенной активности в сравнении с имплантата-ми без биоактивного слоя [3]. В работах ряда авторов также отмечается, что кальций-фосфатные покрытия с определенными характеристиками шероховатости поверхности индуцировали образование гидроксиа-патита [15, 16]. По всей видимости, одним из важных факторов активизации остеогенеза являлось усиление кровообращения в окружающих тканях как следствие умеренного повышения тонуса артерий. Было выдвинуто предположение, что подобного рода эффект может быть связан с повышенной концентрацией ионов Са, которые освобождались с поверхности имплантов и тем самым оказывали воздействие на сосудистую стенку [2, 8, 13]. Однако в данных экспериментах не определяли концентрацию остеотропных элементов на поверхности используемых имплантов перед началом и остаточное их количество по окончании опыта. Это регламентировало необходимость проведения соответствующих исследований в условиях in vitro.
Результаты выполненных испытаний показали, что после инкубации в 0,9%-ном растворе хлорида натрия в течение 28 сут более низкую адгезионную прочность к титансодержащей основе отмечали у образцов с по-
крытием КФВЧМР. По окончании опыта на их поверхности как при визуальной макроскопической оценке, так и методом СЭМ выявляли участки повреждения кальций-фосфатного слоя различного характера.
В созданных условиях при тестировании образцов с покрытием, нанесенным методом МДО, по окончании эксперимента целостность и архитектоника биоактивного слоя была сохранена, что свидетельствовало о его высокой адгезионной прочности к металлической подложке.
В обеих группах регистрировали снижение концентрации остеотропных элементов на поверхности образцов (значительнее ионов кальция, чем фосфора), что косвенно свидетельствует о их диффузии в раствор электролита. При этом в группе с напылением МДО изменение содержания этих элементов было выражено в несколько меньшей степени. Соответственно при данном способе нанесения кальций-фосфатного слоя можно рассчитывать на более длительный (пролонгированный) остеостимулирующий эффект, который необходим в случаях предполагаемого лечения в течение не менее 1,5-2 месяцев. К таким заболеваниям можно отнести на пример переломы костей, сопровождающиеся значительным повреждением остеогенных тканей (со смещением по ширине и дли-
не, оскольчатые, фрагментарные), обширные костные дефекты различной этиологии и другие состояния. Покрытие КФВЧМР обладает кратковременным стимулирующим действием, соответственно изделия с данным напылением целесообразнее использовать при переломах костей без смещения костных отломков в большей степени у пациентов молодого возраста.
Заключение. Результаты выполненных исследований и известные литературные данные свидетельствуют о том, что при использовании кальций-фосфатных покрытий на металлической основе индукция остеогенеза происходит в результате диффузии, в частности ионов Ca с поверхности имплантатов в окружающие ткани. Адгезионная прочность таких биоак-
Литература
тивных покрытий к подложке может влиять на степень активности и продолжительность стимуляции косте-образования в области имплантации. Полученные результаты необходимо учитывать как в клинической медицине, так и в ветеринарной практике при лечении повреждений и других патологических состояний костей, с использованием изделий покрытых биоактивным кальций-фосфатным напылением.
Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований, в рамках программы НИР Государственного задания на 2018-2020 гг: «Разработка и экспериментальное обоснование биоактивного касто-мизированного остеосинтеза».
1. Баева, Л.С. Современные технологии аддитивного изготовления объектов / Л.С.Баева, А.А.Маринин // Вестник МГТУ. -2014. - Т. 17. (1). - С. 7-12.
2. Власов, Т.Д. Механизмы гуморальной регуляции сосудистого тонуса / Т.Д.Власов // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2002. - № 4. - С. 68-73.
3. Возможности остеогенной активности интрамедуллярных имплантатов в зависимости от технологии нанесения кальций-фосфатного покрытия (экспериментальное исследование) / А.В.Попков [и др.] // Успехи современного естествознания. - 2015. - №5. - С. 142-145.
4. Замещение обширных диафизарных дефектов длинных костей / А.П.Барабаш, Л.А.Кесов, Ю.А.Барабаш, С.П.Шпиняк // Травматология и ортопедия России. - 2014. - № 2 (72). - С. 93-99.
5. Кальций фосфатные покрытия, созданные методом вч-магнетронного распыления гидроксиапатита: осте-огенный потенциал invitro и invivo / М.А.Сурменева, Р.А.Сурменев, И.А.Хлусов [и др.] // Известия Том.политех. ун-та. - 2010. - Том 317(2). - С. 101-106.
6. Нанопористая структура покрытий, сформированных газотермическим напылением электрокорунда и последующим микродуговым оксидированием на имплантатах из титанового сплава ВТ6 / В.А.Кашуро, М.А.Фомина, И.В.Родионов, А.А.Фомин // Медицинская техника. - 2016. - № 1. - С. 38-41.
7. Полянский, Р.К. Оценка эффективности использования межпозвонковых имплантатов из углеситалла у собак в шейном отделе позвоночного столба / Р.К.Полянский, Н.А.Козлов // Рос.ветеринар. журнал. Мелкие домашние и дикие животные. - 2013. - № 4. - С. 11-13.
8. Реакция тканей при использовании имплантатов с биоактивным покрытием / Н.А.Кононович, А.В.Попков А.Л.Шастов, Д.А.Попков. // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. - 2017. - Том 103(12). -С. 1361-1369.
9. Тестирование аддитивных материалов на культурах клеток фибробластов человека / Г.П.Котельников, А.В.Колсанов, А.Н.Николаенко [и др.] // Клин.и эксперимент. хирургия. Журн. им. акад. Б.В.Петровского. - 2018. - Т. 6(№ 2). - С. 67-73.
10. Функциональные покрытия для имплантационных материалов / С.В.Гнеденков, Ю.П.Шаркеев, С.Л.Сине-брюхов [и др.] // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2012. - №1. - С. 12-19.
11. Экспериментальное исследование эффективности применения имплантатов с покрытиями на основе сверхтвердых соединений / Ж.К.Манирамбона, Ф.В.Шакирова, И.Ф.Ахтямов, Э.Б.Гатина // Ученые записки казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2013. - Т. 215. - С. 218-221.
12. Экспериментальное применения биокомпозитных материалов в ветеринарной травматологии / Ю.В.Пичу-гин, А.В.Сапожников, В.А.Ермолаев, С.Н.Золотухин // Вестн. Ульянов. гос. с.-х. академии. - 2011. - № 3. - С. 78- 80.
13. Enhanced osteogenesis and angiogenesis by mesoporous hydroxyapatite microspheres-derived simvastatin sustained release system for superior bone regeneration / Yu Wei-Lin [et al] // Sci Rep. - 2017. - Vol. 7 - Р. 44129.
14. Hu, C.J. Preparation of hydroxyapatite-containing coatings on pure titanium by linearly increasing the voltage in the pulsed bipolar microarc oxidation process / C.J.Hu, JR.Lu // Int J Electrochem Sci. - 2015. - № 10. - P. 749-758.
15. Ryu, H.S. Biomimetic apatite induction of P-containing titania formed by microarc oxidation before and after hydrothermal treatment / H.S.Ryu, W.H.Song, S.H.Hong // Surface and Coating Tehnology. - 2008. - Vol. 202. -P.1853-1858.
16. Biomimetic apatite deposited on microarcanatase-based ceramic coatings / D.Wei [et al.] // Ceramic International. - 2008. - Vol. 34. - P. 1139-1144.
PATTERN OF CHANGING IMPLANT BIOACTIVE LAYER DEPENDING ON THE TECHNIQUE OF ITS APPLYING (AN EXPERIMENTAL STUDY IN VITRO)
Kononovich N.A. - Candidate of Veterinary Sciences; Popkov A.V. - Doctor of Medical Sciences,
professor; Gorbach E.N. - Candidate of Biological Sciences; Stogov M.V. - Doctor of Biological Sciences;
Popkov D.A. - Doctor of Medical Sciences, professor of the Russian Academy of Sciences.
FSBI Russian Ilizarov Center "Restorative Traumatology and Orthopaedics" of the RF Ministry of Health,
Kurgan (e-mail: [email protected]).
The implant surface should have osteoinductive properties in order to provide the best osteointegration and, accordingly, the strength of implant-bone fixation. Calcium-phosphate compounds resemble bone tissue chemical composition best of all. There are various techniques of applying such compounds to implants. The specific characteristics of the kinetics of calcium and phosphate releasing from the bioactive layer applied to a metallic titanium-containing substrate were studied in experiments in vitro. Samples were incubated in electrolyte solution for 28 days. In Group 1 the layer was applied by microarc oxidizing method (MAO), in Group 2 - by the method of high-frequency magnetron spraying (HFMS). At the end of the experiment the calcium-phosphate layer condition was studied visually and by scanning electron microscopy technique. The higher adhesion strength of the bioactive layer to the metal substrate was determined in MAO. In Group 1 the Ca content was 3.1-fold reduced; P content - 1.13-fold reduced. In Group 2 the Ca was 6.54-fold decreased; P - 2.38-fold decreased. The study results had demonstrated that the mechanisms of osteoinductive action of the calcium-phosphate spraying might be related to the Ca diffusion from the implant surface into surrounding tissues. The degree of activity of these processes may depend on the technique of bioactive coating applying. In case of HFMS using the stimulating action is more short-term comparing with MAO method. These data should be taken into consideration when treating injuries and other pathological conditions of bones with using products coated with bioactive calcium-phosphate spraying.
KEYWORDS: experiment, bone, implant, bioactive coating, diffusion, calcium, phosphorus.
References
1. Baeva, L.S. Sovremennye tekhnologii additivnogo izgotovleniya obyektov [Modern technologies of additive manufacturing of objects] / L.S. Baeva, A.A. Marinin // Vestnik MGTU. - 2014. - Vol. 17(1). - P. 7-12.
2. Vlasov, T.D. Mexanizmy gumoralnoy regulyatsii sosudistogo tonusa [Mechanisms of humoral regulation of vascular tone] / T.D. Vlasov // Regionarnoe krovoobraschenie i mikrotsirkulyatsiya. - 2002. - Vol. 4. - P. 68-73.
3. Vozmozhnosti osteogennoy aktivnosti intramedullyarnykh implantatov v zavisimosti ot tekhnologii naneseniya kalciy-fosfatnogo pokrytiya (eksperimentalnoe issledovanie) [Features of osteogenic activity of intramedullary implants depending on technique of applying calcium-phosphate coating (experimental study)] / A.V.Popkov [et al.] // Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya. - 2015. - № 5. - P. 142-145.
4. Zameschenie obshirnykh diafizarnykh defektov dlinnykh kostey [Building of extensive diaphysis defects in long bones] / A.P.Barabash, L.A.Kesov, Yu.A.Barabash, S.P.Shpinyak // Travmatologiya i ortopediya Rossii. - 2014. - Vol.2 (72). - P. 93-99.
5. Kalciyfosfatnye pokrytiya, sozdannye metodom vch-magnetronnogo raspyleniya gidroksiapatita: osteogenny potentsial in vitro i in vivo [Calcium phosphate coatings created by the HF magnetron sputtering method of hydroxyapatite: osteogenic potential] / M.A.Surmeneva, R.A.Surmenev, I.A.Xlusov [et al.] // Izvestiya Tomskogo politekhnicheskogo. universiteta. - 2010. - Vol. 317(2). - P. 101-106.
6. Nanoporistaya struktura pokrytiy, sformirovannykh gazotermicheskim napyleniem elektrokorunda i posleduyuschim mikrodugovym oksidirovaniem na implantatakh iz titanovogo splava VT6 [Nanoporous Structure of Coatings Formed by Thermal Spraying of Aluminum Oxide with Further Microarc Oxidation on Titanium Alloy VT6 Implants] / V.A.Kashuro, M.A.Fomina, I.V.Rodionov, A.A.Fomin // Medicinskaya texnika. - 2016. - Vol.1. - P. 38-41.
7. Polyanskiy R.K. Ocenka effektivnosti ispolzovaniya mezhpozvonkovykh implantatov iz uglesitalla u sobak v sheynom otdele pozvonochnogo stolba [Evaluation of the Effectiveness of the Intervertebral Uglesitall Implants Usage in the Cervical Spine in Dogs] / R.K. Polyanskij, N.A. Kozlov // Ros. veterinar. zhurnal. Melkie domashnie i dikie zhivotny'e. - 2013. - Vol.4. - P. 11-13.
8. Reakciya tkaney pri ispolzovanii implantatov s bioaktivnym pokrytiem [Tissue response when using implants with bioactive coating] / Kononovich N.A., Popkov A.V., Shastov A.L., Popkov D.A. // Rossiyskiy fiziologicheskiy zhurnal im. I.M. Sechenova. - 2017. - Vol.103(12). - P. 1361-1369.
9. Testirovanie additivnykh materialov na kulturakh kletok fibroblastov cheloveka [Testing of additive materials in human fibroblast cell cultures] / G.P. Kotelnikov, A.V. Kolsanov, A.N. Nikolaenko [et al.] // Klinicheskaya. i eksperimentalnaya. khirurgiya. Zhurnal. imeni akad. B.V. Petrovskogo. - 2018. - Vol. 6 (№ 2). - P. 67-73.
10. Funkcionalnye pokrytiya dlya implantacionnykh materialov [Functional coatings for implants] / S.V.Gnedenkov, Yu.P.Sharkeev, S.L.Sinebryuxov [et al.] // Tikhookeanskiy medicinskiy zhurnal. - 2012. - Vol.1. - P. 12-19.
11. Eksperimentalnoe issledovanie effektivnosti primeneniya implantatov s pokrytiyami na osnove sverkhtverdykh soedineniy [Experimental study of the effectiveness of the use of implant coatings based on superhard compounds] / Zh.K.Manirambona, F.V.Shakirova, I.F.Axtyamov, E .B.Gatina // Uchenye zapiski Kazanskoy gosudarstvennoy akademii veterinarnoy mediciny im. N.E.Baumana. - 2013. - Vol. 215. - P. 218-221.
12. Eksperimentalnoe primenenie biokompozitnykh materialov v veterinarnoy travmatologii [Studying the possibility of applying biocomposite materials in veterinary travmatology] / Yu.V.Pichugin, A.V.Sapozhnikov, V.A.Ermolaev, S.N. Zolotuxin // Vestnnik Ulyanovskoy gosudarstvennoy. selskokhozyaystvennoy akademii. - 2011. - Vol. 3. - P. 78-80.
13. Enhanced osteogenesis and angiogenesis by mesoporous hydroxyapatite microspheres-derived simvastatin sustained release system for superior bone regeneration / Yu Wei-Lin [et al] // Sci Rep. - 2017. - Vol. 7 - P. 44129.
14. Hu, C.J. Preparation of hydroxyapatite-containing coatings on pure titanium by linearly increasing the voltage in the pulsed bipolar microarc oxidation process / C.J. Hu., JR. Lu // Int J Electrochem Sci. -2015. - №10. - P. 749-758.
15. Ryu, H.S. Biomimetic apatite induction of P-containing titania formed by microarc oxidation before and after hydrothermal treatment / H.S.Ryu., W.H.Song, S.H.Hong // Surface and Coating Tehnology. - 2008. - Vol. 202. -P.1853-1858.
16. Biomimetic apatite deposited on microarc anatase-based ceramic coatings / D.Wei [et al.] // Ceramic International. - 2008. - Vol. 34. - P. 1139-1144.
