CC BY
81
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 578.833.29:578.5
ЯшинаЛ.Н.1, Зайковская А.В.1, Протопопова Е.В.1, Бабкин И.В.2, Малышев Б.С.1,
Товпинец Н.Н.3, Евстафьев И.Л.3
ХАНТАВИРУС ТУЛА НА ТЕРРИТОРИИ КРЫМА
1ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"», 630559, пос. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области; 2ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, 630090, Новосибирск; 3ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии Республики Крым», 95034, Симферополь
Представлено генетическое доказательство циркуляции вируса Тула (TULV) на территории Крыма. Методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции с последующим сек-венированием генотипированы 4 образца вирусспецифической РНК, выделенных от полевок Microtus obscurus, отловленных в Бахчисарайском районе Республики Крым. Филогенетический анализ последовательностей S-, M-, L-сегментов вирусного генома показал, что исследованные РНК-изоляты образуют новый генетический вариант TULV, названный Россия IV. Новые последовательности наиболее близки варианту Россия I, выявленному ранее от обыкновенных полевок (M. arvalis) из центрально-европейской части России.
Ключевые слова: хантавирус Тула; Крым; Microtus obscurus.
Хантавирусы принадлежат к роду Hantavirus семейства Bunyaviridae. Природным резервуаром хантавирусов являются грызуны, насекомоядные и рукокрылые, причем каждый ханта-вирус ассоциирован с одним или несколькими близкородственными видами [1]. Хантавирусы, циркулирующие в определенной популяции хозяев-носителей, эволюционируют вместе с ними, приобретая набор микроадаптаций, а географическое распределение и генетическое разнообразие хантавирусов отражает распространение и разнообразие грызунов [2, 3].
Род Microtus широко распространен на территории Северной Америки, Европы и Азии, а несколько видов грызунов данного рода являются природными резервуарами хантавирусов. Tula-вирус (TULV) был впервые выявлен в 1994 г от европейской обыкновенной полевки (M. arvalis) и восточно-европейской полевки (M. rossiaemeridionalis) в Тульской области Центральной России, а затем в Чехии и Словакии [4, 5]. Анализ последовательностей S- и M-сегментов генома показал, что TULV представляет новый генотип, так как отличается от наиболее близких вирусов Prospect Hill и Isla Vista на 25-27%. Циркуляция TULV установлена в нескольких странах Центральной и Восточной Европы: в Австрии, Бельгии, Германии, Хорватии, Сербии, Словении, Польше, Венгрии, Франции, Швейцарии, Нидерландах [6]. Поскольку в большинстве случаев сообщалось о присутствии TULV-инфицированных M. arvalis, был сделан вывод, что M. arvalis является природным резервуаром TULV. Однако впоследствии сообщалось о выявлении TULV у пашенной полевки (M. agrestis) в Хорватии и у европейской подземной полевки (M. subterraneus) в Сербии. В Словении TULV был выявлен у трех видов полевок: обыкновенной, пашенной и подземной [7]. Филогенетический анализ последовательностей генома TULV из Словении установил их географическое группирование, независимо от вида носителя. Авторы делают вывод о заражении близкородственных видов полевок, заселяющих общую территорию, от основного носителя, обыкновенной полевки. Однако существует и другое возможное объяснение. Восприимчивыми к TULV являются несколько видов грызунов, и наблюдается независимая циркуляция вируса в близкородственных видах наряду с многочисленными случаями переноса вируса между видами. Этот же вывод поддерживает и географическое группирование штаммов независимо от вида носителя, M. arvalis и M. agrestis, полученное при изучении TULV из Германии [8].
В недавних исследованиях TULV обнаружен на азиатской территории: в Омской области Западной Сибири и в Восточном Казахстане [9, 10]. В Западной Сибири носителями вируса являются узкочерепная полевка (Microtus gregalis) и степная пеструшка (Lagurus lagurus). В отличие от данных из Словении в Сибири наблюдается группирование по виду носителя. Различие нуклеотидных последовательностей S-сегмента двух генетических вариантов составляет 18,1-19,7% и соответствует разнице c представителями TULV из других регионов, 15,6-20,9%.
При филогенетическом анализе S-сегмента показано, что
штаммы TULV формируют 9 ветвей или вариантов, объединенных по географическому или видовому признаку: Russia I (Центральная Россия), Russia II (Омск), Russia III (Омск), Kazakhstan, Germanyl, GermanyII, GermanyIII/Poland, Slovakia I/Serbia, Central Europe/Croatia (Словакия, Чехия, Австрия, Хорватия, Германия IV). Таким образом, TULV отличается от остальных хантавирусов тем, что его природными хозяевами являются 6 различных видов грызунов, включая M. arvalis, M. rossiaemeridionalis, M. agrestis, M. subterraneus, M. gregalis, Lagurus lagurus.
На территории Крымского полуострова распространены 3 вида полевок: общественная полевка (Microtus socialis nicolajevi Ognev, 1950), обитающая в равнинной части Крыма, алтайская полевка (M obscurus iphigenia Everssmann, 1840), распространенная преимущественно в горной части региона, и восточноевропейская полевка (М. rossiae meridionalis, ранее M. levis Miller, 1908), заселившая к настоящему времени зону рисовых чеков в северозападном Присивашье [11]. Изучение хантавирусной инфекции на территории Крыма впервые проведено С. Я. Маркешиным и соавт. [12]. Были выявлены очаги хантавирусов на территории Крыма и виды их носителей, однако данные о типах циркулирующих на территории хантавирусов до сих пор отсутствуют. Целью настоящей работы были выявление и генотипирование хантавирусов среди мелких млекопитающих, отловленных в Нижнегорском, Джанкойском и Бахчисарайском районах Республики Крым.
Материалы и методы
Отлов мелких млекопитающих и отбор образцов осуществляли в соответствии с протоколом и рекомендациями по безопасной работе [13]. Ткани легких хранили в жидком азоте до проведения анализа на присутствие хантавирусного антигена.
Образцы тканей легких животных были протестированы на присутствие антигена хантавирусов методом ИФА с использованием тест-системы «Хантагност» производства ФГУП ИПВЭ им. М.П. Чумакова (Москва). Положительные образцы использованы для последующего анализа методом обратной транскрипции и двухраундовой полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Выделение суммарной РНК из проб проводили с использованием набора RNeasy (QIAGEN, Германия), согласно инструкции производителя. Полученные препараты суммарной РНК протестированы методом ОТ-ПЦР с использованием ранее описанных наборов праймеров, специфичных к S-, M-, L-сегментам вирусного генома (см. таблицу) [14, 15]. Вирусную кДНК синтезировали с использованием Expand reverse transcriptase («Roche», Германия) и родоспецифического праймера HPS (5,-TAGTAGTAGACTCC). Определение нуклеотидных последовательностей каждой из цепей ампликонов проводили на автоматическом анализаторе 3130XL, используя набор BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Applied Biosystems», США). Таксономическая идентификация хантавирусов и их природных носителей была основана на определении и сравнении с базой данных GenBank нуклеотидных последовательностей вирусных геномов и фрагментов митохондриальной ДНК носителей. Для построения филогенетических деревьев использованы методы объединения ближайших соседей (NJ) и максимального правдоподобия (ML) [16]. Для сравнения использовали последовательности с регистрационными номерами GenBank: Z30941-Z30945, AF442618-AF442621, AF063891-AF063892, AF063896-AF063897, AF289819-AF289821, AF017659, Y13979-Y13980, AF164094, Z48235, Z48574, AJ223600-AJ223601, U19302, Z49098, AM945877-AM945879, EU439951-EU439952, AF164094, AJ005637, JX046485, JX046482, JX028271, EU360901-EU360904, AB712372, AB675452, HQ728448-HQ728452, EU439960, EU439962, AF017658, Z66538, Z69993, X55129, DQ665812-DQ665815, DQ768149, EU439960-EU439962.
Установленные нуклеотидные последовательности изолятов
а
б
гС
TULV
OJ ЧО
Койку5247Ма Moravia5293Ma
L- Койку5276Ма Malacky32 Croatia
- GER/Mag20 97
■ Serbia/Cacak Kosice667/Ma Kosicel44/Ma OmskLL2
П
i
Germany IV Croatia Slovakia Czech Republic
Slovakia I Serbia
■ OmskLL58 I Poland/Lodz-2 1 Poland/Lodz-1 GermD5-98 GcrmD 17-98 GermD63-98 KAZ/Ka rata!340 KAZ/Taldyk343 KAZ/Karatal322 OmskMG23 22
CMar205 05 Sen Mar222 05 Sen юр I Crimea40Ma I Crimea53Ma TULA76Ma/87 Tula249Mr/87 - Tulal75Ma/87
Tula53M a/87 99 L_ Tula23Ma/87
— USA/PH-1
- ISLAV/MCSB47
Russia I
Poland Germany III
Kazakhstan
Russia II Germany II Russia IV
Russia I
TULV
97
100
— Mag137 04
- Mag46 02
I МадЗО 02
99
98
99
1001 Mag41 02 -Mar139 05 Sen Mag551 05 Mar205 05 Sen — Tula 249МГ/87
-Tula 53Ma/87
i Poland/Lodz-1
С
100 80
К
72LoER/39/Marv - Serbia/Msub
100
Moravia5302v
I I Moravia 5286Ma 90l Moravia5286Ma
- USA/PH-1
-SN/USA
0,05
1001 Poland/Lodz-2
(Crimea8Ma 100|Crimea53Ma Crimea18Ma Crimea40Ma
I-GER/83/Marv
GER/Mar125 GER/Mag20 97
Germany I
Germany II
Russia I Poland
Russia IV
Germany IV
Serbia Czech Republic
0.05
Рис 1 Филогенетическое древо, отображающее взаимосвязи штаммов TULV. а - древо построено на основе нуклеотндных последовательной S-сегмента генома длиной 859 и.о. с использованием метода ML; б - древо построено „а основе нуклеотидных последовательностей F • М-сегмента генома длиной 240 н.о. с использованием метода NJ, индексы поддержки рассчитаны для 1000 повторов.
Праймеры для двухраундовой ОТ-ПЦР РНК изолятов от полевок рода Microtus
Сегмент генома, Прай- Последовательность (5'-, -3') Этап ОТ-ПЦР, темпе-
ген мер ратура отжига, оС
Универсальный M-сегмент, гли-копротеин G2
S-сегмент, нуклеокапсид N
L-сегмент, РНК-зависимая РНК-полимераза RdRp
HPS TAGTAGTAGACTCC
PP1 ATTTAA(G/A)CAATGGTG(C/T)ACTAC(T/A)AC
PP2 CC(G/A)TAACACATTGC(A/G)GC
PP3 TAGAAAGAAATGTGCATTTGC
PP4 CCTGA(G/A)CCCCATGC(A/T/C)CCATC
P1F TTCTGCAGTAGTAGTAGACTCCTTGAAAAG
U3 G(A/T)GG(A/C/T)CA(G/A)AC(A/T)GCAGA(C/T)TGG
S2 AGCTCAGGATCCATGTCATC
LP1 AGAGAA(G/A)T(T/C)TACTA(C/A)AAATGGAGAAATACA
LP2 TTTAAATT(G/A)AACAT(T/G)GC(T/C)TC(A/T)AGTGC
LP3 GA(C/T)CAGATGATAAA(G/A)CATGA(T/C)TGGTC
LP4 CTGTGTTGA(G/T)AT(A/G)TTTGA(T/G)CCATCAGT Примечание. * - представлена в NoroNet под номером AJ277620_31515_seq_2.
TULV зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами KJ742927-KJ742933.
Результаты и обсуждение
Всего отловлены 123 животных 8 видов, из них 35 в сентябре 2008 г. и 88 в апреле 2009 г Были собраны образцы тканей легких от 81 M. obscurus, 7 M. socialis, 12 Apodemus (Sylvaemus) withebyi, 4 A. flavicollis, 2 A. uralensis, 13 Mus musculus, 2 M. spicilegus, 2 Crocedura suaveolens. Ткани легких грызунов были исследованы методом ИФА на присутствие антигена хантави-русов. Среди 35 мелких млекопитающих, отловленных в Нижнегорском и Джанкойском районах в 2008 г, инфицированных животных не выявлено. Антиген хантавирусов был выявлен у одного из исследованных видов грызунов, полевок M. obscurus, отловленных в окрестностях села Залесное Бахчисарайского района Республики Крым в апреле 2009 г. Всего на этом участке было отловлено 88 животных, из них 81 алтайская полевка (M. obscurus), 4 желтогорлых (A. flavicollis), 2 малых лесных (A. uralensis) и одна степная (A. witherbyi) мыши. Был установлен высокий уровень инфицированности полевок, составляющий 21% (17/81). Ткани легких четырех антиген-положительных M. obscurus были исследованы методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных ко всем 3 сегментам генома.
В результате проведенного ОТ-ПЦР анализа нам удалось выявить вирусную РНК во всех 4 образцах (Crimea8/Ma, Crimea18/ Ma, Crimea40/Ma, Crimea53/Ma). Нуклеотидные последовательности всех образцов вирусспецифической РНК (РНК изолятов) имели высокую гомологию: последовательности М-сегмента генома (позиции 2764-3004) всех образцов были идентичными, S-сегмента (позиции 361-1219) образцов Crimea40/Ma и Crimea53/Ma отличались менее чем на 1%, L-сегмента генома (позиции 181-522) всех образцов отличались менее чем на 1,2%. Для подтверждения вида грызунов-носителей хантавирусов был получен фрагмент гена цитохрома b мтДНК. Анализ последовательностей мтДНК показал, что нуклеотидные последовательности выбранного участка на 99% совпадают с соответствующими последовательностями полевок Microtus arvalis гаплотипов Ukraine B, Russia C, Siberia A и B.
Как показало сравнение с банком данных GenBank, установленные нуклеотидные последовательности представляли новый вариант TULV. Филогенетический анализ последовательностей M- и S-сегментов генома установил формирование новой ветви в кладе TULV, названной нами Россия IV (рис. 1). Установлено, что уровень различия последовательностей S- и M-сегментов генома новых и ранее известных изолятов TULV составляет 11,8-19,2 и 15,7-21%, различие аминокислотных последовательностей - 0,7-4,2 и 2,5-3,8% соответственно. Наиболее близкими к РНК изолятам вируса из Крыма оказались изоляты TULV из европейской части России (Russia I) и Словакии (East Slovakia/ Serbia). При сравнении с банком данных GenBank нуклеотидных и кодируемых аминокислотных последовательностей L-сегмента генома установлено, что уровень различия новых изолятов с ранее опубликованными составил 17,5 и 6,1% соответственно. Необходимо отметить, что для сравнения в банке данных доступна только одна последовательность L-сегмента TULV, вариант Central Europe/Croatia (штамм Moravia/5302v). Уровень различия
ОТ, 42
1-й раунд ПЦР, 38
2-й раунд ПЦР, 41
1-й раунд ПЦР, 44
2-й раунд ПЦР, 46
1-й раунд ПЦР, 46
2-й раунд ПЦР, 48
со следующими по уровню близости штаммами хантавирусов Хабаровск (KHAV), Муджу (MUJV) и Хоккайдо (HOKV) составлял более 21,0/9,7%, 22,7/13,2 и 23,0/14,9% соответственно.
Нами впервые получено генетическое доказательство циркуляции вируса TULV на территории Крыма. Как установлено в настоящем исследовании, вирус циркулирует в популяциях алтайских полевок M. obscurus. Выявленный нами вариант TULV наиболее близок к варианту Россия 1, выделенному от полевки M. arvalis из центральной части России. Гомология нуклеотидных/ аминокислотных последовательностей S-сегмента генома составляет 87,2-88,2/98,6-99,3%. Меньшая гомология последовательностей (82,5-83,8/96,2%) выявлена между новым вариантом TULV и изолятами из Казахстана (вариант Kazakhstan), который циркулирует в том же виде носителя. В Казахстане вирус выявлен среди полевок M. arvalis obscurus. Ранее полевок M. arvalis obscurus относили к одной из хромосомных форм обыкновенной полевки M. arvalis [17], в настоящее время доказана видовая самостоятельность M. obscurus [18]. Учитывая длительную географическую изоляцию полевок на территории Крыма, приведшую к образованию подвида M. obscurus iphigenia, полученные нами данные поддерживают гипотезу географического группирования штаммов TULV и их коэволюции в популяциях носителей вируса.
Роль TULV в патологии человека остается предметом исследований. В настоящее время TULV относят к хантавирусам с низким патогенным потенциалом. В литературе описан случай TULV-ассоциированной инфекции у человека с иммунодефицитным статусом и документировано выявление специфических антител к TULV у людей (лесников), работающих в очаге циркуляции вируса TULV [19, 20]. Низкая частота выявления TULV-инфекции может быть связана как с низким патогенным потенциалом вируса, так и с возможностью ошибочного отнесения случаев TULV к PUUV за счет высокого антигенного сходства двух вирусов, не позволяющего различить их в стандартных тестах НМФА и ИФА. Выявление нового очага циркуляции TULV в Бахчисарайском районе Республики Крым, отсутствие в очаге других инфицированных видов грызунов и других хантавирусов дают потенциальную возможность изучения патогенности вируса для человека. Первым этапом такого исследования могло быть выявление антител к хантавирусам у жителей Бахчисарайского района.
Сведения об авторах:
Автор для переписки - Яшина Людмила Николаевна, зав. лаб. разработки средств ПЦР-диагностики вирусных заболеваний, д-р биол. наук ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»;
Зайковская Анна Владимировна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр., отдел коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»;
Протопопова Елена Викторовна - канд. биол. наук, вед. науч. сотр., отдел молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»;
Бабкин Игорь Викторович - ст. науч. сотр., лаборатория молекулярной микробиологии ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СОРАН, Новосибирск, пр. Лаврентьева 8;
Малышев Борис Сотиволдиевич - мл. науч. сотр., отд. разработки средств ПЦР-диагностики вирусных заболеваний ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»;
Товпинец Николай Николаевич - биолог отдела особо опасных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии Республики Крым»; почтовый адрес: Центр гигиены и эпидемиологии Республики Крым, 95034, Симферополь.
