CC BY
19
Список литературы
1. Болоцкий, И.А. Вопросы эпизоотологии и терапии псев-домоноза свиней / И.А. Болоцкий, В.И. Семенцов, С.В. Пруца-ков, Н.Н. Кружнов // Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии и фармации : сборник материалов Межрегиональной научно-практической конференции.- 2012. - С. 107-110.
2. Гафаров, Х.З. Моно- и смешанные инфекционные диареи новорожденных телят и поросят / Х.З. Гафаров, А.В. Иванов, Е.А. Непоклонов, А.З. Равилов. - Казань, 2002. - 590 с.
3. Заволока, А. Желудочно-кишечные заболевания поросят/ А. Заволока, А. Руденко, В. Смолянинов // Свиноводство, 1999. - № 3. - С. 19-20.
4. Кружнов, Н.Н. Ассоциативные желудочно-кишечные и респираторные заболевания свиней в Краснодарском крае / Н.Н. Кружнов, С.В. Пруцаков, И.А. Болоцкий, В.И.Семенцов, Е.В. Иванасова // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2015. - № 2. - С. 53-54.
DOI: 10.34617/pd9x-rc40 УДК 579.6:639.512:619:639.3.09
ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА КРЕВЕТКИ NEOCARIDINA HETEROPODA GRAM-NEGATIVE INTESTINAL MICROFLORA IN NEOCARIDINA HETEROPODA SHRIMPS
Шорохова Анна Павловна1, канд. биол. наук,
Никулин Никита Алексеевич1,
Присяжная Наталья Викторовна1,
Зимин Андрей Антонович1, канд. биол. наук,
Осепчук Денис Васильевич2, д-р с.-х. наук
1Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.
Скрябина РАН - обособленное подразделение ФГБУН ФИЦ
«Пущинский научный центр биологических исследований
РАН», Российская Федерация, г. Пущино,
2 Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии,
г. Краснодар, Российская Федерация,
Shorokhova Anna Pavlovna1, Ph. D. Biol. Sci.,
Nikulin Nikita Alekseevich1,
Prisyazhnaya Natalya Viktorovna1,
Zimin Andrey Antonovich1, Ph. D. Biol. Sci.,
Osepchuk Denis Vasilyevich2, Dr. Agr. Sci.
1G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of
Microorganisms of the Russian Academy of Sciences, Pushchino,
Russian Federation,
2 Krasnodar Research Centre for Animal Husbandry and Veterinary Medicine, К-asnodar, Russian Federation.
Аннотация: работа посвящена выделению быстрорастущих бактерий кишечника креветки N. heteropoda. Было выделено около 40 штаммов бактерий. Определение бактерий было проведено с помощью масс-спектромерии на приборе MALDI TOF. Было показано с высокой достоверностью среди изолятов наличие грамотрицательных бактерий трех родов: Pseudomonas, Shewanella и Aeromonas.
Ключевые слова: аквакультура; бактерии кишечника; креветки; Neocaridina heteropoda.
Abstract: the study is devoted to the selection of fast-growing intestinal bacteria of N. heteropoda in the shrimp. About 40 strains of bacteria were isolated. The determination of bacteria was carried out using mass spectrometry on a MALDI TOF instrument. The presence of gram-negative bacteria of three genera: Pseudomonas, Shewanella and Aeromonas, was shown with high confidence among isolates.
Key words: aquaculture; intestinal bacteria; shrimp; Neocari-dina heteropoda.
Продукты аквакультуры имеют большое значение для человека из-за их питательной ценности и явной пользы для здоровья. Хотя эти продукты питательны, но они часто загрязнены патогенными бактериями, которые естественным образом встречаются в водной среде, что может привести к заболеваемости и смертности людей во всем мире.
Например, аэромонады выделяют из широкого спектра источников, включая продукты аквакультуры. Эти бактериальные
контаминации вызывают существенные экономические потери в аквакультуре во всем мире. Хотя эти бактерии являются патогенными микроорганизмами, одновременно они являются частью нормальной кишечной микрофлоры здоровой рыбы [1]. Многие исследования аквакультуры можно было бы проводить с использованием мелких гидробионтов эволюционно близких объектам производства.
Исследование на такой модели роли микрофлоры кишечника креветки в продуктивности и поддержании здоровья животного существенно для контроля численности бактерий в промышленном производстве с целью получения качественной и здоровой пищи.
Задача работы. Креветка Neocaridina heteropoda (Crustacea, Malacostraca) является мелким гидробионтом до 4 см в длину [2]. Она легко размножается в аквариумной культуре с мультипликацией до 50 раз за 6-8 месяцев. То есть, это удобный лабораторный объект исследования различных микробиологических параметров производственных креветок, включая опыты по фаговой терапии.
Неокаридины также используются в токсикологических тестах. Данное исследование было предпринято для микробиологической характеристики российской популяции неокаридин, поиска бактерий-хозяев бактериофагов и штаммов бактерий для получения пробиотиков для профилактики и лечения бактериозов креветок.
Методика.Среды для бактерий. Питательные среды:
а) триптон-соевая агаризованная среда ИБФМ РАН (5/5);
б) триптон-соевая агаризованная среда ИБФМ РАН (5/5), разведённая в 10 раз;
в) агаризованная среда LB;
г) питательная среда с аквариумной водой (ПИСАВ) (г/л): дрожжевой экстракт - 1, пептон - 1, агар - 15.
Операция по извлечению кишечника и выделение бактерий из N. heteropoda. Реконструкция пищеварительной системы была проведена ранее методом компьютерной микротомографии [3]. Креветку отмывали в 70 % этиловом спирте. Скальпелем разрезали хитиновый экзоскелет, энтомологической булавкой
извлекали необходимую область кишечника. Шпателем растирали кишку до получения однородной взвеси в 0,1 мл 0,9 % NaCl.
Доводили данный раствор до 1 мл и 0,1 мл суспензии высевали твердые питательные среды. Инкубировали культуры при 25оС 24 часа. Из полученных накопительных культур выделяли отдельные колонии на среде LB.
Результаты исследований и их обсуждение. Численность популяции быстрорастущих бактерий кишечника креветки не превышала концентрации 104 КОЕ/мл.
Количество быстрорастущих бактерий из кишечника креветки N. heteropoda варьировало не сильно: на LB вырастало 9,1±0,8 х 104, на 5/5 - 7,7±0,9 х 104, на 5/5, разведённой в 10 раз
- 8,2±0,4 х 104, на ППСАВ - 7,8±0,9 х 104. Было выделено примерно 40 штаммов бактерий. Все штаммы были очищены микробиологически, путем пересева отдельных колоний.
Таксономическая идентификация изолятов была определена с помощью масс-спектрометрии пептидов длиной 2 -20 КДа на приборе MALDI TOF Bruker Daltonik (США). Ряд изолятов были достоверно определены согласно базе данных Bruker Daltonik MALDI Biotyper и базе данных Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН.
Достоверным результатом считались значения более 1.7. Штаммы рода Aeromonas были определены со следующей достоверностью: Aeromonas media - 2.056, Aeromonas veronii -2.384, 2.367, Aeromonas hydrophila - 1.986. Aeromonas hydrophila
- это гетеротрофная грамотрицательная палочковидная бактерия, обитающая в водоемах стран с тёплым климатом. Её можно найти как в пресной, так и в солёной воде. А. hydrophila является одним из основных патогенов рыб и амфибий, может вызывать токсические инфекции и у человека (Microbewiki).
Ряд видов рода Aeromonas, в первую очередь А. hydrophila вызывают инфекции у креветок [6].
Aeromonas media - это бактерия, выделенная из поверхностной хьюстонской черной почвы. Интересно, что штамм Aeromonas media WS, используется как биоинсектицид (Microbewiki).
Aeromonas veronii - это грамотрицательная палочковидная бактерия, обнаруживаемая в пресной воде и у различных гидро-бионтов. Она может вызывать раневые инфекции и диареи у пациентов с ослабленным иммунитетом [4].
Было выделено несколько изолятов бактерии вида Pseudomonas alcaligenes. Они имели более высокую достоверность определения 2.129, 2.12, 2.129, 2.12.
С меньшей, но достаточной достоверностью были определены бактерии вида Shewanella putrefaciens - 1.91, 2.224, 1.781. Shewanella putrefaciens является грамотрицательной плеоморф-ной бактерией, которая впервые была выделена из морской воды, а также из морского анаэробного песчаника в Нью-Мексико. S. putrefaciens также является факультативным анаэробом, способным метаболизировать железо и марганец [5]. Хотя очень редко, но отмечались случаи инфекций с бактериемией у человека.
Выводы: 1. Мажорными грамотрицательными аэробными культивируемыми компонентами бактериального сообщества кишечника креветки N. heteropoda являются представители родов: Pseudomonas, Shewanella и Aeromonas.
2. Присутствие данных видов говорит о необходимости предпринимать стандартные меры санитарии при проведении экспериментов с данным гидробионтом.
Список литературы
1. Trust, M.B. et al. Obligate anaerobic bacteria in the gastrointestinal microflora of the grass carp (Ctenopharyngodon idella), goldfish (Carassius auratus) and rainbow trout (Salmo gairdneri)// J. Fish. Res. Board. Can. - 1974. - 36:1174-1179.
2. Klotz, W. Gattung Neocaridina Kubo. SuBwassergarnelen aus aller Welt (3rd ed.) / W. Klotz, A. Karge // Daehne Verlag -2013. - pp.131-6.
3. Moriarty, D.J.W. The role of microorganisms in aquaculture ponds / D.J.W. Moriarty // Aquaculture. 1997 - 151(1-4): 333-349.
4. Hickman-Brenner, F. W. Aeromonas veronii, a new orni-thine decarboxylase-positive species that may cause diarrhea / F. W.
Hickman-Brenner, K. L. MacDonald, A. G. Steigerwalt, G. R. Fanning D. J. et al. // J. Clin. Microb. - 1988. - 25 (5): 900-906.
5. Fredrickson, J.K. et al. Biogenic iron mineralization accompanying the dissimilatory reduction of hydrous ferric oxide by a groundwater bacterium / J.K. Fredrickson et al. // Geochim. Cosmo-chim. Acta. - 1998. - 62 (19-20): 3239-3257. doi:10.1016/S0016-7037(98)00243-9.
6. Hänninen, M.L. Aeromonas species in fish, fish-eggs, shrimp and freshwater / M.L. Hänninen, P. Oivanen, V. Hirvelä-Koski // Int. J. Food. Microbiol. - 1997. - 34(1): 17-26.
