CC BY
25
ГОМОЦИСТЕИН - ВАЖНЫЙ ФАКТОР РИСКА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ЛИЦ КАЗАХСКОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ
А.У. Джолдасбекова, Н.Б. Байтасова, А.К. Джусипов НИИ кардиологии и внутренних болезней МЗ РК, Алматы [email protected]
Ключевые слова: артериальная гипертония, ишемический инсульт, гомоцистеин, ген MTHFR.
Сердечно-сосудистые заболевания в настоящее время являются главной причиной смерти. Каждый год они уносят около 15,3 млн жизней. Среди причин смерти преобладают ИБС и инсульт. Несмотря на угрожающую статистику и высокую заболеваемость, следует отметить некоторый прогресс в борьбе с этими болезнями. В значительной степени это связано с выявлением факторов, значительно увеличивающих риск сердечно-сосудистых заболеваний.
Исследование кандидатных генов при изучении заболеваний, имеющих мультифакториаль-ную природу, в том числе артериальной гипертонии (АГ), является актуальным направлением геномной медицины [1]. Одним из генетических маркеров сердечно-сосудистых заболеваний является ген 5, 10 - метилен-тетрагидрофолат-редуктазы (МТНРЯ). Установлена связь наследственного дефицита МТНРЯ с нарушением обмена гомоцистеина [2], но результаты работ, посвященных оценке связи полиморфизма гена с развитием сердечно-сосудистых заболеваний, неоднозначны и противоречивы [2-4].
В связи с этим значительный интерес представляет изучение полиморфизма С677Т гена МТНРЯ у здоровых и больных артериальной гипертонией, проживающих в Казахстане. Кроме того, учитывая значимость гипергомоцисте-инемии в патогенезе атеросклероза и тромбоза, мы проанализировали уровень гомоцистеина (ГЦ) плазмы крови и маркеров повреждения эндотелия сосудов у больных АГ и перенесших ишемический инсульт.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследовано 120 лиц, казахской национальности, поступивших в кардиологическое отделение ННМЦ г. Астаны с диагнозом Артериальная гипертония 2-3 степени, риск 2-4, не состоящие в родстве, 69 больных АГ (57%) перенесли в анамнезе ишемический инсульт. Средний возраст больных составил 47,0±0,7 лет. В исследование не включались пациенты
с ИБС, симптоматической артериальной гипертонией, сахарным диабетом, а также с признаками острых или обострением хронических воспалительных или инфекционных заболеваний.
В контрольную группу были включены 80 практически здоровых лиц без клинических проявлений сердечно-сосудистых заболеваний, без отягощенной наследственности по вышеуказанному заболеванию, с нормальными показателям ЭхоКГ, ЭКГ и нагрузочных проб, средний возраст которых составил 42,5±0,9 года.
В исследуемых группах был произведен забор крови из локтевой вены в объеме 5-10 мл в стерильные пластиковые пробирки, содержащие 100 мкл 0,5М ЭДТА рН 8,0 в качестве антикоагулянта. Собранная таким образом кровь замораживалась и хранилась при -20 °С.
ДНК выделяли из лейкоцитов крови стандартным фенол хлороформным методом [5]. Для амплификации необходимого фрагмента гена MTHFR использовали два праймера [7]:
5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'
5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'.
Определение концентрации гомоцистеина в плазме крови проводилось методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) на аппарате «Anthos-2020». Исследование параметров системы гемостаза проводилось в лаборатории генетики с биохимической и иммунологической диагностикой НИИ кардиологии и внутренних болезней МЗ РК. Измерение показателей плазменного гемостаза (уровень фибриногена (ФГ), фактора Виллебранда (ФВБ), ингибитора активатора плазминогена - 1 (ИАП-1)) проводили на автоматическом анализаторе «Behring Coagulation Timer» (ВСТ), с использованием реактивов, калибраторов, стандартных и контрольных материалов фирмы «Behring», Германия. Количественное определение СРБ проводилось на биохимическом анализаторе «Hitachi-902» реактивами фирмы «Roche». Определение ИЛ-6 и ИЛ-10 проводилось методом ИФА. Определение концентрации молекул клеточной адгезии (Е-селек-
тина, ICAM-1) проведены методом ИФА на аппарате «Anthos-2020».
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета статистических программ SPSS 11.0. Наблюдаемое распределение генотипов проверяли на соответствие равновесия Харди-Вайнберга. Достоверность анализа частотного распределения аллелей и генотипов полиморфизма гена MTHFR оценивали с помощью критерия %2. Достоверность различий сравниваемых величин оценивали критериями Стьюдента и достоверными считали различия при p<0,05.
Таблица 1
Генотипы и аллели гена MTHFR у больных АГ и здоровых лиц казахской национальности
Больные АГ Здоровые Р Гено--
тип п=120 час™ та' п=80 час™ та'
СС 78 65 48 60 /=0,09
Р=0,77
СТ 34 28,3 26 32,5
ТТ 8 6,7 6 7,5 Аллели
С 190 79,2 122 76,3 х2=0,07
Т 50 20,8 38 23,7 Р=0,79
РЕЗУЛЬТАТЫ
В табл. 1 отражены данные сравнительного анализа распределения частоты аллелей и генотипов гена MTHFR у больных и здоровых жителей Казахстана. Достоверность анализа частотного распределения аллелей и генотипов полиморфизма С677Т гена MTHFR оценивали с помощью критерия %2. Как и ожидалось, большинство обследованных были носителями СС генотипа, у оставшихся определены СТ и ТТ генотипы. Лица с генотипом ТТ встречались редко, у всех обследованных превалировал С аллель. У казахов, больных АГ, частота генотипа СС встречалась в 2,3 раза чаще, чем частота генотипа СТ, и в 9,7 раз чаще, чем частота генотипа ТТ (65,0; 28,3 и 6,7%, соответственно). Аллель С (79,2%) встречался в 3,8 раза чаще, чем аллель Т (20,8%).
Среди практически здоровых казахов прослеживается аналогичное частотное распределение генотипов - СС почти в 1,8 раза чаще встречался СТ и в 8 раз чаще ТТ (60,0; 32,5 и 7,5%, соответственно). Аллель С (76,3%) обнаружен в 3,2 раза чаще, чем аллель Т (23,7%). Сравнивали частотное распределение генотипов и аллелей гена MTHFR у больных АГ и практически здоровых казахов (табл. 1). Различия статистически не значимые (%2=0,09, р=0,77 и %2=0,07, р=0,79, соответственно).
Изучение полиморфизма С677Т гена MTHFR у лиц казахской национальности установило отсутствие взаимосвязи данного гена с развитием заболевания. Так, в работе Rodrigues Esparragon F. с соавт. генотип изучался у 223 здоровых доноров и 235 пациентов с артериальной гипертонией [6]. Обнаружена достоверная связь ТТ-генотипа с АГ у мужчин (р=0,022). В то же время в австралийском исследовании S. Heux с соавт., где генотип изучали у 250 больных АГ и у 250 пациентов контрольной
группы, более часто выявлен мутантный аллель Т при АГ (40%), чем в контрольной группе (34%), однако данные различия недостоверны (р=0,07) [4]. Генотип ТТ в данном исследовании также чаще отмечался при АГ, чем в контроле (14 и 10%, соответственно), однако различия недостоверны (р=0,17). Обнаружено, что С677Т мутация MTHFR обеспечивает умеренное повышение риска АГ на фоне ожирения (р=0,03). В китайской популяции при обследовании 127 больных АГ и 170 пациентов контрольной группы связи генотипа с АГ не обнаружено [7].
Таким образом, полученные нами данные согласуются с теми данными литературы, где указывается на недостоверную связь мутации С677Т гена МТ^ с АГ.
Механизмы влияния гомоцистеина на процесс развития сердечно-сосудистых заболеваний осуществляются по нескольким биохимическим каналам и в значительной степени связаны с эндотелиальной дисфункцией [8]. В связи с этим мы провели анализ средних значений показателей эндотелиального повреждения с различными генотипами (СС, СТ, ТТ) гена MTHFR у лиц казахской национальности (табл. 2).
Анализ маркеров воспаления и эндотели-ального повреждения у больных АГ, казахов, по генотипам в группах (СС, СТ, ТТ) гена MTHFR (табл. 2) показало, что уровень гомоцистеина с высокой достоверностью различался в сравниваемых группах, причем наибольшим был при генотипе ТТ, что почти в 2 раза выше, чем при генотипе СС, и в 1,5 раза выше гетерозиготного генотипа СТ (14,8±0,55, 19,9±0,9 и 27,8±2,2 мкмоль/л, соответственно, р<0,001). У больных с генотипом, содержащих Т аллель (СТ и ТТ), уровни ИАПГ-1,ФВБ, 1САМ были значительно выше в сравнении с пациентами генотипом СС и данное различие статистически значимо (Р<0,05). Показатели Е-селектина при геноти-
Таблица 2
Связь генотипа гена MTHFR с маркерами воспаления и эндотелиального повреждения
среди больных АГ
сс ст тт
Показатель п=?8 (1) П=34 (2) п=8 (3) Р2-3 Р1-3
Гомоцистеин, мкмоль/л 12,8±0,55 19,9±0,9 27,8±2,2 <0,001 <0,001 <0,001
ИАПГ-1, ммоль/л 5,12±0,41 7,30±0,62 8,15±0,95 <0,05 >0,05 <0,05
ФВБ, % 145,5±4,5 165,4±9,3 194,4±6,7 <0,05 >0,05 <0,05
1САМ, нг/мл 350,8±4,8 368,8±11,2 383,4±5,7 <0,05 >0,05 <0,05
Е-селектин, нг/мл 57,5±3,4 63,2±4,29 71,2±8,8 >0,05 >0,05 <0,05
ИЛ-6, пг/мл 51,8±2,5 65,3±6,7 67,6±10,2 <0,05 >0,05 <0,05
ИЛ-10, пг/мл 100,5±5,9 53,6±7,8 41,4±5,9 <0,05 >0,05 <0,001
вчСРБ, мг/дл 13,2±1,6 15,7±1,5 14,2±1,1 >0,05 >0,05 >0,05
Фибриноген, г/л 3,40±0,16 4,05±0,19 5,23±0,14 <0,05 <0,05 <0,001
Р12 - достоверность различий маркеров воспаления и эндотелиального повреждения у больных с генотипами СС и СТ, Р2 3 - достоверность различий маркеров воспаления и эндотелиального повреждения у больных с генотипами СТ и ТТ, Р13 - достоверность различий маркеров воспаления и эндотелиального повреждения у больных с генотипами СС и ТТ
пе ТТ значительно больше в сравнении с генотипами СС и СТ (57,5±3,4, 63,2±4,29 и 71,2±8,8 нг/мл соответственно, р<0,05).
При сопоставлении маркеров воспаления больных АГ в зависимости от полиморфизма гена MTHFR установлено, что у казахов с генотипом ТТ показатели ИЛ-6 были достоверно повышены по сравнению с гомозиготами СС (51,8±2,5 пг/мл) и гетерозиготами СТ (65,3±6,7 пг/мл) и составляли 67,6±10,2 пг/мл, р<0,05. Аналогичная закономерность обнаружена и для фибриногена: наибольшие показатели обнаружены при генотипе ТТ (5,23±0,14 г/л), наименьшие - при СС (3,40±0,16 г/л) и средние - при СТ генотипе (4,05±0,19 г/л). Уровень противовоспалительного маркера ИЛ-10 был наибольшим при гомозиготном генотипе по С аллели (СС - 100,5±5,9 пг/мл), средняя - СТ генотипе (53,6±7,8 пг/мл) и наименьшая при ТТ генотипе (41,4±5,9 пг/мл, р<0,001). В отношении уровней вчСРБ у казахов генотипы, содержащие Т аллели (СТ, ТТ), имели тенденцию к более высоким уровням в сравнении с гомозиготами по С аллели (СС), но различия статистически незначимы.
В нашем исследовании наибольшие значения гомоцистеина наблюдались у больных с ТТ генотипом гена MTHFR, наименьший уровень гомоцистеина, находившийся в пределах нормы, был определен у лиц с генотипом СС, ге-терозиготы (СТ) занимали промежуточное по-
ложение. Такая взаимосвязь между генотипом гена MTHFR и уровнем гомоцистеина объясняется снижением активности фермента при мутации - замене цитозина и тимина в положении 677 - приводит к нарушению термолабильности фермента, нарушению метаболизма гомоцис-теина, в результате чего он накапливается в плазме [2]. Данная закономерность проявляется в различных европейских популяциях [10]. Взаимосвязь между повышением уровня гомоцистеина и гена MTHFR с АГ изучено в ряде исследований [4, 6, 7, 9]. Группой ученых из Японии было показано, что у пациентов из японской популяции с повторными инфарктами миокарда частота мутантного аллеля Т (0,56) была значительно связана с заболеванием, и генотип ТТ коррелировал с повышенным уровнем гомоцистеина в плазме [2,13]. Нами был проведен однофакторный анализ связи гена MTHFR с перенесенным в анамнезе ишемичес-ким инсультом (табл. 3).
У пациентов с отсутствием связи с ОНМК чаще встречается генотип СС и аллель С677. Мутантный генотип ТТ встречается исключительно у пациентов с перенесенным ОНМК и соответственно мутантная аллель 677Т в 2,5 раза чаще встречается в данной группе, различия статистически значимые (%2=7,01, р=0,03 и х2=8,8, р=0,003 соответственно).
У больных АГ казахской национальности носительство мутантной аллели 677Т и генотипа
ТТ ведет к риску развития инсульта. Аналогичные данные получены О.В. Сироткиной (2003), у мужчин русской популяции развитие ишеми-ческого инсульта возрастает при носительстве аллели 677Т гена MTHFR [15]. У жителей Китая получены данные о взаимосвязи С677Т гена MTHFR с риском инсульта [7]. А вот и. Nowak-Gottl с соавт. отмечают высокую частоту ТТ генотипа гена MTHFR в случае спонтанного ишемического инсульта у детей [12].
Мы показали статистически значимое накопление частоты Т677 аллели гена MTHFR у больных АГ, перенесших инсульт по сравнению с лицами без инсульта. J.C. ^етЬеге с соавт. (2000) показали, что даже небольшое увеличение гомоцистеина, в пределах нормальных физиологических колебаний, индуцирует дисфункцию эндотелия сосудов [11]. В артериальном тромбозе роль пускового фактора играет повреждение эндотелия. Одним из агентов, индуцирующих повреждение стенки сосуда, является гомоцистеин [3, 7, 13]. Показано, что умеренная гипергомоцистеинемия является независимым фактором риска развития церебрального инфаркта и церебрального атеросклероза [14].
Доказано, что возникновение мутации происходит в разных популяциях и аллельном окружении неоднократно, что приводит к повышенной предрасположенности к развитию заболевания [13, 15]. Также проведено сравнительное изучение распределения генотипов и аллелей гена MTHFR у казахов в зависимости от отягощенной наследственности по АГ (табл. 4). При этом обнаружено, что при отягощенной наследственности частота встречаемости генотипа СС в 1,5 раза реже в сравнении с неотягощенной наследственностью. Генотип ТТ встречается исключительно у больных с отягощенной наследственностью. Разница статистически достоверна (%2=8,03, р=0,018). При этом мутантный аллель 677Т в 3,5 раза чаще встречается среди больных с отягощенной наследственностью в сравнении с неотягощенной (26,9 и 7,5%, соответственно), различия статистически значимые (х2=9,5, Р=0,002).
Полученные данные свидетельствуют о том, что полиморфизм гена MTHFR ассоциируется с отягощенной наследственностью по артериальной гипертонии у казахов. Это откроет широкие перспективы в выявлении генетической предрасположенности к АГ и даст возможность обоснованно и целенаправленно подходить к профилактике заболевания.
Таблица 3
Однофакторный анализ связи гена MTHFR с ишемическим инсультом
Генотипы Нет связи с ОНМК Есть связь с ОНМК о.
п % п %
СС ст ТТ 40 12 0 54,1% 35,3% 0 34 22 8 45,9% 64,7% 100% Х2=7,01 Р=0,03
Аллели
С 92 88,5% 90 70,3% Х2=8,8
т 12 11,5% 38 29,7% Р=0,003
Таблица 4
Генотипы и аллели гена MTHFR у казахов в зависимости от отягощенной наследственности по АГ
Наследственность ^
Гено- отягощена не отягощена
типы п=80 частота, % п=40 частота, %
СС Ст 45 27 56,2 33,8 34 6 85 15 Х2=8,03 Р=0,018
тт 8 10 0 0
Аллели
С 117 73,1 74 92,5 Х2=9,5
т 43 26,9 6 7,5 Р=0,002
У больных АГ казахской национальности носительство мутантной аллели Т677 и гомозиготного генотипа ТТ гена MTHFR ассоциирует с отягощенной наследственностью по АГ и высокими показателями гомоцистеина в плазме крови. Гипергомоцистеинемия приводит к изменению синтеза окиси азота, повышению атеро-генных липидов, нарушению вазоконстрикции и повреждению эндотелия, повышению факторов воспаления и снижению противовоспалительных факторов.
ВЫВОДЫ
1. Распределение генотипов и аллелей полиморфного маркера С(-677)Т гена MTHFR достоверно не отличаются у больных артериальной гипертонией и практически здоровых лиц казахской национальности и совпадают с таковыми в популяции.
2. Мутация С(-677)Т гена MTHFR у больных АГ казахов не увеличивает риск развития артериальной гипертонии, но ассоциируется с отягощенной наследственностью по АГ и гипергомоцисте-инемией и повышением маркеров повреждения эндотелия сосудов.
3. Полиморфизм С(-677)Т гена MTHFR у больных АГ является генетическим маркером риска развития ишемического инсульта у лиц с отягощенной наследственностью казахской национальности.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Beaudet A. // Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 64. P. 1-13.
2. Frosst P., Blom H.J., Milos R. et al. //Nat. Genet. 1995. V. 10. P. 111-113.
3. Gasparovic J., Raslova K., Basistova Z. et al. // Physiol. Res. 2004. V. 53. Xs 2. P. 215-218.
4. Heux S., Morin F, Lea R.A. et al. // Hyper. Res. 2004. V. 27. № 9. P. 663-667.
5. Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. С. 480.
6. Rodriguez-Esparragon P., Hernandez-Perem O., Rodriguez-Perez J.C. et al. // Clin. Exp. Hyper. 2003. V. 25. № 4. P. 209-220.
7. Li Z-, Sun L., Zhang H. et al. // Stroke. 2003. V. 34. P. 2085.
8. Спиридонов М.Г., Степанов B.A., Пузырев В.П. // Клин. мед. 2001. № 2. С. 10-16.
9. Zhan S., Gao Y, Yin X. et al. //Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2000. V. 21. № 3. P. 194-197.
10. Gudnason V., Stansbie D., Scott J. et al. // Atherosclerosis. 1998. V. 136. P. 347-354.
11. Chambers J.C, Obeid O.A., Kooner J.S. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000. V. 20. P. 185-188.
12. Nowak-Gottl U., Strater R., Heinecke A et al. // Blood. 1999. V. 94. P. 3678-3682.
13. Morita H., Kurihara H., Tsubaki S. et al. // Arterioscleros. Thrombos. Vase. Biol. 1998. V. 18. P. 1465-1469.
14. Yoo J.-Chang C.-S., Kang S.-S. // Stroke. 1998. V. 29. P. 2478-2483.
15. Сироткина O.B., Черкас Ю.В., Меркулова A.B. и др. // Мед. академ. журн. 2004. Т. 4. № 4. С. 23-27.
HOMOCYSTEINE - AN IMPORTANT RISK FACTOR OF CARDIOVASCULAR COMPLICATIONS IN KAZAKH ETHNICITY
A.U. Dzholdasbekova, N.B. Baitassova, A.K. Dzhusipov This study focused on allel and genotype distribution of MTHFR gene in healthy and arterial hypertension (AHT) patients of Kazakh ethnicity has revealed no significant differences. Some data obtained indicate a statistically significant increase in the occurrence of T677 allel of MTHFR gene associated with the increase in homocysteine and markers of endothelium damage in AHT patients, as well as in those with tainted heredity. The results of this study demonstrate that genetic disorder, which increases the homocysteine level and endothelium damage markers, is a risk factor for development of ischemic stroke in Kazakh people.
