CC BY
46
Гомология 168 рДНК у изолятов Тау1оге11а equigenitalis, выделенных в разных регионах
М. Матсуда3, А. Тазуми3, С. Кагава3, Т. Секизука3, О. Марьяма3, Дж.Е. Мур1, Б.К. Миллар1,2
1 Городской госпиталь Белфаста (Северная Ирландия, Великобритания)
2 Ульстерский университет (Северная Ирландия, Великобритания)
3 Университет Азабу (Япония)
Ключевые слова: бактерии, лошадь, метрит
Сокращения: КМК — контагиозный метрит кобыл; пн — пары нуклеотидов
Введение
КМК впервые диагностировали у кобылы английской чистокровной породы в 1977 г. в Великобритании [5]. Это инфекционное венерическое заболевание лошадей, вызываемое бактерией Taylorella equigenitalis, обычно ведет к потере кобылами плодовитости. В настоящее время КМК описали во многих странах у разных пород лошадей (13, 16]. КМК диагностируют на основании изоляции Т. equigenitalis — неподвижной грамотрицателыюй негативной коккобацнллы, для культивирования которой пользуются обычными селективными бактериологическими методами.
H.M.K. Блюминк и соавт. при анализе 16S рДНК установили идентичность трех штаммов Т. equigenitalis (NCTC11184х, N480/82 и N610/88; GenBank № Х68645) и впервые на основании филогенетического родства отнесли агент к ß-протеобактериям [1]. С.С. Джанг и соавт., определяя филогенетическое положение Т. asinigenitalis — нового
1. Использованные изоляты Т. equigenitalis
вида из рода Taylorella, изолированного от дикого осла (Equus asinus) в США в 1997 г.1 [11 ], отметили полную идентичность по 16S рДНК пятнадцати имевшихся в их распоряжении штаммов T. equigenitalis (11 американских, 2 датских, 1 английского и 1 японского).
Наша исследовательская группа определила последовательность 16S рДНК еще трех штаммов Т. equigenitalis — английского (NCTC11184T), американского прототипного (Kentucky 188) и японского (EQ59), — а также установила различия в нескольких сайтах 16S рДНК 6 штаммов агента, включая 3 референтных (табл. 1) [ 10].
Очень важно знать последовательность 16S рДНК как можно большего числа штаммов агента, выделенных в других странах, с тем чтобы иметь представление о степени их гетерогенности. Поэтому авторы поставили перед собой цель полностью расшифровать структуру 16S рДНК большого числа штаммов Т. equigenitalis, изолированных в Японии, Австралии и Франции, а также сравнить полученные результаты с ранее опубликованными данными по этому вопросу.
Методы
Штаммы Т. equigenitalis. В таблице 1 перечислены использованные в работе штаммы Т. equigenitalis в т.ч. изоли-
Название Порода Пол Где Когда № DDBJ/EMBL/ Источник
изолята лошадей изолирован изолирован GenBank) информации
NCTC11184Т Английская чистокровная Кобыла Великобритания 1977 AF408197 10
Kentucky 188 НД -»- США 1978 АВ069660 10
EQ59 Английская чистокровная —»— Япония 1980 АВ066372 10
EQ70 -»- -»- 1980 АВ200402 ДР
НН139 —»— -»- -»- 1980 АВ200397 -»-
SS28 —»— —»— 1980 АВ200403 -»-
СЕМ012 —»— -»- —»— 1996 АВ200404 -»-
СЕМ013 -»- -»- —»— 1996 АВ200405 -»-
СЕМ014 -»- —»— —»— 1996 АВ200406 -»-
Aus1 НД НД Австралия НД АВ200407 -»-
Aus2 —»— -»- —»— —»- АВ200408 -»-
Aus3 —»— -»- -»- -»- АВ200409
Aus4 -»- —»— —»— -»- АВ200410
Aus5 —»— —»— —»— -»- АВ200411
Aus6 —>>— —»— —»— -»- АВ200412
Aus7 -»- —»— —»— -»- АВ200413 -»-
Fr-1 -»- —»— Франция -»- АВ200398 -»-
Fr-2 —>>— —»— —»— -»- АВ200399 —»—
Fr-9 Французский рысак Жеребец —»— -»- АВ200400 —»—
Fr-10 —»— Кобыла —»— —»— АВ200401 -»-
3 изолята НД НД НД -»- Х68645 1
10783 -»- —»— Нидерланды -»- AF29712 8
96-178 —»— —»— США —»— AF29713 8
Обозначения. ДР — данная работа; НД — нет данных.
1Эта грамотрицательная неподвижная коккобацилла отличается от Т. equigenitalis по фенотипу.
2. Полиморфные сайты в 16S рДНК штаммов T. equigenitalis
Штаммы Нуклеиновые кислоты в полиморфных сайтах*
138 139 146" 173 239 369 400 494 501 907 1486 1492
NCTC11184 Г ц — Г А Т ц т А Ц г г
Kentuckyl 88 Г ц — Г А ц ц г А Ц г А
EQ59 Г ц — г А ц ц т А Ц г А
EQ70 Г ц — г А ц ц т А Ц — —
SS28 г ц — г А ц ц т А Ц — —
НН139 г ц — г А ц ц т А ц — —
СЕМ012 г ц — г А ц ц т А ц — —
СЕМ013 г ц — г А ц ц т А ц — —
СЕМ014 г ц — г А ц ц т А ц — —
Aus1 г ц А А — ц ц т А ц — —
Aus2 г ц А А — ц ц т А ц — —
Aus3 г ц А А — ц ц т А ц — —
Aus4 г ц А А — ц ц т А ц — —
Aus5 г ц А А — ц ц т А U — —
Aus6 г ц А А — ц ц т А ц — —
Aus7 г M А А — ц ц т А u — —
Fr-1 — — А Г А ц ц т А — — —
Fr-2 — — А Г А ц ц т А — — —
Fr-9 — — А г А M ц т А — — —
Fr-10 — — А г А ц ц т А — — —
X68645 г U — г А т г г Г ц г Г
AF297172 г ц — г А M ц т А ц А —
AF297173 г ц — г А M ц т А ц А —
Обозначения. * — в сравнении со штаммом NCTC11184 Т. equigenitalis; ** — в сравнении со штаммом Aus1 Т. equigenitalis; А — аденин; Г — гуанин; Т — тимин; Ц — цитозин.
рованные в Японии (7), Австралии (7); США (2); Нидерландах (1); Великобритании (1) и Франции (4). Все японские и австралийские изоляты, а также 2 французских штамма были получены от кобыл, но источник изоляции остальных двух французских изолятов (Fr-1 и Fr-2) не известен. Поскольку жеребцы могут быть носителями возбудителя КМК, в настоящей работе мы также исследовали изолят, полученный от бессимптомно инфицированного жеребца французской рысистой породы (табл. 1, штамм Fr-9).
Культивирование бактерии и приготовление препаратов ДНК. Условия культивирования этих штаммов и приготовления препаратов их ДНК описаны ранее [9, 141.
Амплификация, клонирование и секвенирование. Амплификацию, клонирование и секвенирование почти полного 16S фрагмента рДНК проводили описанными ранее методами [15|. Для амплификации 16S рДНК штаммов Т. equigenitalis пользовались парой праймеров fDl (5'-GAATTTGATCCTGGCTCAG-3') и rTel (5'-GGCTA|CCTT-GTTACGACTT-3'). Первый из них содержал на З'-конце 19 пн оригинального праймера fDl [211. Праймер rTel сконструировали на основе данных о нуклеотидной последовательности З'-конца оперона rrnB (DDBJ/EMBL/GenBank № J01695) 16S рДНК кишечной палочки.
Секвенс-анализ нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность почти полной 16S рДНК Т. equigenitalis анализировали с помощью 9-й версии GENETYX-MAC (GENETYX Со, Япония). Полученные данные, а также аналогичная информация о 6 референтных штаммах доступны в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank.
Нуклеотидные последовательности, соответствующие праймерам fDl и rTel, предназначенным для амплификации почти полной 16S рДНК 17 штаммов Т. equigenitalis, при анализе сходства не использовали. Первая нуклеотидная позиция (А) данных секвенирования, представленных DDBJ/EMBL/ GenBank, соответствует 28-й пн гена 16S рРНК цистрона rrnB кишечной палочки [2, 3]. Также, как было описано ранее [10], мы выявили у штаммов NCTC11184 , Kentucky 188 и EQ59 высоко консервативный участок ССТССТ (1513...1518 пн), расположенный рядом с З'-концом 16S рДНК и комплементарный последовательности Shine-Dalgarno мРНК [17,19, 20].
Результаты
Как видно из таблицы 2, у 17 штаммов Т. equigenitalis, изолированных в Японии, Австралии и Франции выявлены различия нуклеотидной последовательности (АВ200397... АВ200413, табл. 1) 6 локусов 16S рДНК (1469 пн). Более того, в 23 секвенированных участках 16S рДНК имеется 12 полиморфных сайтов (сюда отнесены данные 6 референтных секвенированных участков, табл. 2). Интересно, что штаммы агента, изолированные в каждой из трех стран (Японии, Австралии и Франции) дали идентичные результаты секвенирования. Выделенные в разных странах мира штаммы Т. equigenitalis, 16S рДНК которых изучали, обладают неодинаковым генотипом 1131. Кроме того, секвенс-анализ выявил различия в ряде участков 16S рДНК у двух американских штаммов — Kentucky 188 и 96-178 (AF 297173), использованных в качестве референтных при проведении настоящего исследования.
Оно показало наличие высокого уровня гомологии (99,5 % или более) 16S рДНК при наличии 9 полиморфных сайтов между 138 и 501 пн, суммарно включавших 12 замен и делеций. Таким образом, у 17 штаммов между 502 и 1469 пн выявили единственный полиморфный сайт, в то время как между 1 и 501 пн их было 9, что указывает на значительную гомологию 2/3 16S рДНК Т. equigenitalis.
Обсуждение
С.С. Джанг и соавт. показали, что 16S рДНК Т. equigenitalis и "I", asinigenitalis гомологичны на 97,6% [8|. В свете современных руководств по молекулярной биологии критерием принадлежности штаммов бактерий к разным видам следует считать 3%-й уровень вариабельности 16S рДНК |4, 6, 12, 18|. Однако недавно установили более низкий уровень различий 16S рДНК у некоторых видов кампилобактерий (7). Бактерии рода Taylorella также относятся к микроорганизмам с низким уровнем межвидовой вариабельности 16S рДНК.
Заключение
Установили высокий уровень (99,5 % и выше) гомологии, но не идентичность 16S рДНК 23 штаммов Т. equigenitalis. Бактерии рода Taylorella проявляют низкий уровень вариабельности нуклеотидной последовательности 16S рДНК.
РВЖ СХЖ №4-2006
15
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Bleumink-Pluym N.M.C., van Dijk L., van Vliet A.H.M. et al. Phylogenetic position of Taylorella equigenitalis determined by analysis of amplified 16S ribosomal DNA sequences. Int J Syst Bacter, 1993, 43, 618—621.
2. Brosius J., Palmer M., Kennedy P.J., Noller H.F. Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA, 1978, 75, 4801—4805.
3. Brosius J., Dull T.J., Sleeter D.D., Noller H.F. Gene organization andprimary structure of a ribosomal RNA operon from Escherichia coli. J Mol Biol, 1981,148, 107—127.
4. Clayton R.A., Sutton G., Hinkle P.S.Jr. et al. Intraspecific variation in small-subunit rRNA sequences in GenBank: why single sequences may not adequately represent prokaryotic taxa. Int J Syst Beater, 1995, 45, 595—599.
5. Crowhurst R.C. Genital infection in mares. Vet Ree, 1977, 100, 476.
6. Fox G.E., Wisotzkey J.D., Jurtshuk P.Jr. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity. Int J Syst Bacter, 1992, 42, 166—170.
7. Gorkiewicz G., Feierl G., Schober С. et al. Species-specific identification of Campylobacters by partial 16S rRNA gene sequencing. J Clin Microb, 2003, 41, 2537—2546.
8. Jang S.S., Donahue J.M.. Arata A.B. et al. Taylorella asinigenitalis sp. nov. a bacterium isolated from the genital tract of male donkeys (Equus asinus). Int J Syst Evol Microb, 2001, 51, 971—976.
9. Kagawa S., Moore J.E., Murayama O., Mastuda M. Comparison of the value of pulsed-field gel electrophoresis, random amplified polymorphic-field gel electrophoresis, random amplified polymorphic DNA and amplified rDNA restriction analysis for subtyping Taylorella equigenitalis. Vet Res Commun 2001, 25, 261—269.
10. Kagawa S., Nagano Y„ Tazumi A. et al. Nucleotide sequencing and analysis of 16S rDNA and 16S-23S rDNA internal spacer region (ISR) of Taylorella equigenitalis. Vet Res Commun, 2006, 30, 4, 343—355.
11. Katz J.В.. Evans L.E., Hutto D.L. et al. Clinical, bacteriologic serologic, and pathologic features of infections with atypical Taylorella equigenitalis in mares. JAVMA, 2000, 216, 1945—1948.
12. Kolbert С.P., Persing D.H. Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens. Curr Microb, 1999, 2, 229—305.
13. Matsuda M., Moore J.E. Recent advances in molecular epidemiology and detection of Taylorella equigenitalis associated with contagious equine metritis (СЕМ). Vet Microb, 2003, 97,111—122.
14. Miyazawa Т., Mastuda M, Isayama Y. et al. Genotyping of strains of Taylotrlla equignitalis from thoroughbed brood mares in Japan. Vet Res Commun, 1995, 19, 265—271.
15. Miyajima M., Matsuda M.. Haga S. et al. Cloning and sequenceing of 16S rDNA and 16S-23 S rDNA internal spacer region (ISR) from urease-positive thermophilic Campylobacter (UPTC). Lett Appl Microb, 2002, 34, 287—289.
16. Ter Laak E.A., Fennema G., Jaartsveld F.H.J. Contagious equine metritis in the Netherlands. Tijdschr Dierg, 1989, 114, 189—201.
17. Ofengand J., Denman R., Negro D. et al. Structural and functional relationships at the decoding site of the E. coli ribosome. In structure and expression from proteins to ribosomes. In: Benjamin L. Genes VII. Oxford Univ Press Inc. NY, 2000, 209—228.
18. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int J Syst Bacter, 1994, 44, 864—849.
19. Steitz J.A. Genetic signals and nucleotide sequence in messenger RNA. In: Goldberg R.F. (Ed.). Biological regulation and development I, gene expression. Plenum Publ Co, NY, 1979, 349—389.
20. Stiege W., Stade К., Schuler D., Brimacombe R. Covalent cross-linking of poly (A) to Escherichia coli ribosomes, and localization of the cross-link site within 16S RNA. Nucleic Acids Res, 1988, 16, 2369—2388.
21. Weisburg W.G.. Barns S.M.. Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacter, 1991, 173, 697—703.
SUMMARY
M. Matsuda, A. Tazumi, S. Kagawa, T. Sekizuka, O. Murayama, J.E. Moore, B.C. Millar. Homogeneity of the 16S rDNA sequence among geographically disparate isolates of Taylorella equigenitalis. BMC Vet Res, 2006, 2,1.
At present, six accessible sequences of 16S rDNA from Taylorella equigenitalis (T. equigenitalis) are available, whose sequence differences occur at a few nucleotide positions. Here, we clone and sequence the approximate full-length 16S rDNA from 17 strains of T. equigenitalis isolated in Japan, Australia and France, nucleotide sequence differences were demonstrated at the six loci in the 1,469 nucleotide sequence. Moreover, 12 polymorphic sites occurred among 23 sequences of the 16S rDNA, including the six reference sequences. High sequence similarity (99.5 % or more) was observed throughout, except from nucleotide positions 138 to 501 where substitutions and deletions were noted.
a in л УДК 619:616-021.3:631.1
лШЛ
СПРАВКА т^ ^
Возбудитель контагиозного метрита кобыл
Ключевые слова: бактерии, лошадь, метрит Сокращения: Кл — кобыла
Впервые Т. equigenitalis изолировали 30 лет тому назад [3]. За это время инфекцию неоднократно диагностировали не только в Великобритании, где произошла ее первая описанная в литературе вспышка, но и во многих других странах мира, в т.ч. в США, Канаде, Франции, Германии, Италии, Росии, Словении и Японии.
У Кл инфекция клинически проявляется слизисто-гной-ными истечениями из влагалища, обусловленными эндометритом, цервицитом и вагинитом, и ведет к временному бесплодию. Однако многие ее случаи у Кл протекают субклини-чески. Обычно подозрение на такую форму инфекционного метрита возникает после того, как у Кл возобновляется течка после осеменения. Переболевшие Кл в течение нескольких месяцев остаются бессимптомными носителями, заражая при половом контакте жеребцов, а те, в свою очередь, новых Кл [5]. Жеребята, рожденные инфицированными Кл, нередко становятся носителями Т. equigenitalis.
У жеребцов инфекция всегда протекает бессимптомно [6].
У Кл возбудитель локализуется преимущественно в клиторе (после клинического выздоровления его редко обнаруживают в матке), а у жеребцов — в уретре и препуции [5].
Таксономическое положение этой бактерии можно представить следующим образом: тип Proteobacteria, класс p-Proteobacteria, пор. Burkholderiales, сем. Alcaligenaceae, род Taylorella. Филогенетически она родственна возбудителю мелиоидоза.
Т. equigenitalis — весьма привередливый микроорганизм, ее трудно культивировать на питательных средах. Поэтому обычно для констатации отсутствия инфекции у лошади для бактериологического исследования берут патологический материал (выделения и смывы из уретры и половых органов, эякулят) двукратно (с интервалом в 1 нед). В случаях, когда' проводили лечение, патологический материал берут не ранее чем через 1 нед после применения антимикробных препаратов.
Доставлять в лабораторию патологический материал следует в транспортных средах с активированным углем (например, в среде Amies) [8] в условиях пониженной температуры и в максимально короткие сроки после взятия (не позднее 48 ч).
Пригодность питательных сред для культивирования Т. equigenitalis во многом определяется качеством пептонной агаровой основы и отсутствием в них ферментируемых углеводов. Чаще всего для культивирования Т. equigenitalis пользуются селективной средой Тимони. Она представляет собой шоколадный агар, содержащий 5 % крови, прогретой в течение 12 мин при температре 70...80°С, триметоприм (1мкг/мл), клиндамицин (5 мкг/мл) и амфотерицин В (5 мкг/мл). Перечисленные антибиотики надежно ингиби-руют рост контаминирующей микрофлоры, обычно присутствующей в половых органах лошадей. Вместо этих антибио-
