CC BY
55
УДК: 582.284:547.458:54.053:632.953
ГЛІКАНИ ВИЩОГО БАЗИДІАЛЬНОГО ГРИБА Ganoderma adspersum (Schulzer) Donk: ОТРИМАННЯ ТА АНТИФІТОВІРУСНА АКТИВНІСТЬ
О. Г. Коваленко1 Институт мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного
О. М. Поліщук1 НАН України, Київ
С. П. Вассер2 2Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України, Київ
Е-mail: [email protected]
На прикладі трьох штамів Ganoderma adspersum, виділених у Грузії, Китаї та Ізраїлі, показано здатність вищих грибів продукувати глікани, які є активними інгібіторами фітовірусної інфекції. Активні антивірусні препарати глікану з міцелію гриба можна отримати водною, кислотною та лужною екстракцією. Встановлено здатність глікану G. adspersum активувати захисні механізми рослин і пригнічувати інфекційну та репродуктивну активність вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ). Стійкість тютюну до ВТМ-інфекції під впливом глікану формується de novo за участю транскрипції РНК на матриці клітинної ДНК, чутливої до дії специфічного інгібітору цього процесу актиноміцину Д. Крім того, виявлено здатність полісахариду пригнічувати репродукцію ВТМ за системної вірусної інфекції.
Ключові слова: Basidiomycetes, Ganoderma adspersum, глікани, антивірусна активність,
вірус тютюнової мозаїки, вірусостійкість рослин, актиноміцин Д, Nicotiana tabacum, Datura stramonium.
Вищі гриби порядку Basidiomycota з давніх-давен використовують у народній медицині як лікарські засоби від багатьох захворювань. Особливо широкого вжитку ще за середньовіччя вони набули в народній медицині Сходу. Згадки про цілющі властивості базидіальних грибів у Європі та Північній Америці належать до пізнішої доби, а вивчення їх як потенціальних джерел фармакологічних та медичних препаратів розпочалося лише нещодавно [1]. Вже перші дослідження показали, що базидіальні гриби є невичерпним джерелом речовин, які мають лікувальні властивості щодо численних захворювань [2, 3]. Серед лікарських речовин з грибів Basidiomicetes передусім заслуговують на увагу глікани та комплекси їх з протеїновими компонентами — пептидоглікани та глікопротеїни, які мають різну хімічну будову й різні типи біологічної активності [4-6]. Встановлено, що ці біополімери та інші сполуки не лише здатні захищати хазяїна від дії негативних чинників навколишнього середовища [7, 8], але й можуть позитивно впливати на організми людини і тварин завдяки їхнім імуномодулюваль-ним, антивірусним, антибактеріальним та протипухлинним властивостям, а також
здатності підтримувати загальний гомеостаз організму [9-11].
Хімічна природа і структурні особливості вуглеводвмісних біологічно активних препаратів із вищих грибів залежать від різних чинників, зокрема від виду та штаму продуцента, умов живлення, способів екстракції тощо. Вищі базидіоміцети і, зокрема, гриби роду Ganoderma продукують біологічно активні розгалужені глікани, що містять у головному ланцюзі (1^3)-, а в бокових відгалуженнях — (1^4)- та (1^6)-зв’язані Р^-глюкопірано-зильні одиниці [3-6]. Саме з Р(1^3)-гліко-зидними зв’язками, молекулярною масою та ступенем розгалуженості полісахаридного ланцюга асоціюють протипухлинні та інші біологічні властивості грибних гліканів [12].
З літератури відомо, що глікани, продуковані деякими бактеріями, мікроскопічними грибами та дріжджами, мають антифітові-русну активність [13, 14]. Однак, стосовно активності вуглеводвмісних полімерів вищих грибів щодо вірусів рослин в літературі є лише поодинокі роботи. Зокрема, показано, що глікопротеїн, який має лектино-ву активність, виділений із плодових тіл Agrocybe aegerita, може пригнічувати розвиток вірусної інфекції шляхом порушення
процесу проникнення вірусних часток у клітину [15], а екзоцелюлярний глюкуронокси-ломанан Tremella mesenterica здатен індукувати розвиток вірусостійкості у рослин, активуючи клітинний синтез de novo [16]. Окрім того, відомо, що сумарні полісаха-ридні препарати з культуральної рідини Ganoderma lucidum та G. applanatum також мають помірну антивірусну активність у рослинах тютюну [1Т].
Оскільки останні види виявляли лише незначну активність щодо продукування інгібіторів вірусів, метою нашої роботи було випробувати інші види грибів роду Ganoderma як продуценти антивірусних гліканів, зокрема G. adspersum. Йдеться про виділення, часткове очищення та дослідження антивірусної активності полісахаридів з міцелію даного виду.
Матеріали і методи
Об’єкти досліджень: три штами G. аd-spersum (ІІ, 844 та 1259, культури Хайфсь-кого університету, Ізраїль), виділені з біоценозів Грузії, Китаю та Ізраїлю, вірус тютюнової мозаїки (ВТМ, штам U1) як тест-вірус, рослини надчутливого до ВТМ сорту тютюну (Nicotiana tabacum L.) Імунний 580 та його сприйнятливого мутанту, який унаслідок культивування і регенерації in vitro втратив N-ген надчутливості, а отже, й здатність до локалізації вірусної інфекції [18]. На перших етапах досліджень як тест-рослини використовували надчутливі рослини дурману (Datura stramonium L.), які слугували також індикаторами інфекційності вірусу під час вивчення впливу глікану на репродукцію ВТМ у тканинах тютюну. Рослини вирощували у вегетаційному будиночку за природних умов освітлення, вологості та температури. У дослід залучали рослини у віці 4-6 справжніх листків.
Отримання препаратів глікану. В роботі було використано міцелій G. adspersum, вирощений за глибинного культивування на синтетичному середовищі такого складу (г/л): глюкоза — 15; пептон — 2,5; дріжджовий екстракт — 3; КН2РО4 — 0,5;
MgSO4 -ТН20 — 0,3; Na2HPO4 — 0,2; рН 5,5.
Принципи методики одержання препаратів глікану були такими, як і при отриманні Р(1^3)-Р(1^6)-глюкану («ганодера-ну») з інших видів Ganoderma sp. [19]. Неочищені полісахаридні препарати одержували з ліофілізованого міцелію гриба водною, лужною та кислотною екстракцією.
Водна екстракція. Для отримання «водного екстракту» глікану спочатку із сировини видаляли низькомолекулярні сполуки. Для цього до сухого міцелію гриба G. adspersum, ретельно подрібненого у фарфоровій ступці в присутності карборунду, додавали 85%-й розчин етанолу (1:5, в/о) і кип’ятили впродовж 3 год. Процедуру екстракції спиртом повторювали тричі. Щоразу осад відокремлювали центрифугуванням (7 000 g, 15-20 хв) та використовували у подальшій роботі. Для отримання «водної» фракції глі-кану до звільненого від низькомолекулярних сполук гомогенату міцелію додавали воду (1:5) і кип’ятили протягом 3 год. Процедуру повторювали 5 разів. Екстракт відділяли від нерозчинних решток центрифугуванням (7 000 g, 15-20 хв) та об’єднували. Отриманий екстракт піддавали діалізу проти проточної та дистильованої води, потім упарювали до мінімального об’єму на роторному випа-рювачі. До концентрату додавали 1/5 об’єму суміші ізоамілового спирту та хлороформу (1:10), суміш інтенсивно струшували протягом 10 хв, центрифугували (7 000 g, 20 хв) для розділення фаз. Стадію депротеїнізації екстракту в такий самий спосіб повторювали ще раз, екстракти об’єднували та висушували в сублімаційній сушарці.
Лужна екстракція. Для отримання «лужної» фракції глікану до 1/2 частини нерозчинного осаду, що залишився після водної екстракції, додавали суміш 5%-го розчину NaOH та 0,05%-го розчину NaBH4 (1:5, в/о) і кип’ятили впродовж 5 год. Процедуру повторювали двічі. Реакцію одержаного екстракту доводили до pH 4,0 додаванням концентрованої HCl. При цьому утворювалась максимальна кількість осаду. Преципітат відділяли центрифугуванням (7 000 g, 30 хв), а центрифугат піддавали діалізу проти проточної та дистильованої води і проводили додаткове очищення від протеїнових домішок, подібно до «водної» фракції. Очищений екстракт упарювали до 1/5 попереднього об’єму, а далі висушували в сублімаційній сушарці.
Кислотна екстракція. Для отримання «кислотної» фракції глікану до 1/2 частини нерозчинного осаду, що утворювався за водної екстракції, додавали 0,01М H2SO4 і кип’ятили протягом 4 год. Процедуру повторювали двічі. Екстракти збирали після центрифугування (7 000 g, 20 хв) і піддавали діалізу проти проточної та дистильованої води; подальшу обробку препарату проводили в той самий спосіб, що й у разі отримання лужного екстракту.
Вихід препаратів визначали ваговим методом.
Для перевірки антивірусної активності отриманих препаратів їхні водні розчини у різних концентраціях (1-2 000 мкг/мл) додавали до суспензії ВТМ (4 мкг/мл), інку-бували 30 хв та інокулювали ліві половинки листків, а праві — інфікували вірусом у тій самій концентрації без полісахариду.
Ступінь пригнічення вірусної інфекції визначали, враховуючи кількість некрозів на дослідній і контрольній половинках листків, за формулою:
І = (1 - Д/К)х100%,
де І — відсоток інгібування некротичних уражень (некрозів);
Д — середнє значення кількості некрозів у досліді;
К — те ж саме в контролі.
Дослідження противірусних властивостей глікану проводили на рослинах тютюну сорту Імунний 580 за методами, описаними нами раніше [9]. Водні розчини глікану в концентрації 500 мкг/мл вводили суб-епідермально за допомогою інсулінового шприца в ліві половинки листків, а через 1,
3, 5 та 7 діб інфікували ВТМ. У праві половинки, які були контролем, вводили воду. Ступінь захисту або індукованої вірусо-стійкості (ІВС) вираховували за формулою, наведеною вище.
Для вивчення механізму індукованої глі-каном стійкості застосовували антибіотик актиноміцин Д (АМД) як специфічний інгібітор ДНК-залежної РНК-полімерази. АМД (10 мкг/мл) вводили в міжклітинний простір одночасно з полісахаридом або через 2 доби після цього.
Для вивчення впливу глікану на репродукцію ВТМ використовували ізольовані листові диски або листя мутанту тютюну N. tabacum) сорту Імунний 580, дефіцитного за Ы-геном надчутливості [18]. Препарат вводили субепідермально до та після інокуляції вірусом з інтервалом 30 і 60 хв. Листові диски або відокремлені від рослин листки інкубували у вологій камері 48 год при 25 °С для накопичення вірусу. Інфекційність вірусу перевіряли на рослинах-індикаторах.
Результати підрахунку некрозів піддавали статистичній обробці за параметричними критеріями різницевим методом [20]. Значущість різниць (відношень) середніх даних (р) у таблицях виражали символами:
+++: р < 0,1%; ++: 0,1% < р < 1 %; +: 1 % < р < 5 %; о : р> 5 %.
Результати та обговорення
Білий гнильний гриб G. adspersum спричиняє серцевинну гниль буків, беріз та інших листових порід і поширений переважно у тропічній та субтропічній ґрунтово-кліматичних зонах світу (рис. 1).
Рис. 1. Плодові тіла та спорангій гриба G. adspersum, що росте на березі [http://www.floralimages.co.uk]
Цей гриб можна культивувати на штучних живильних середовищах з утворенням міцелію, який легко сепарують та використовують як сировинний матеріал для отримання біологічно активних гліканів [5]. Від хімічної будови біополімерів залежить їхня біологічна, у тому числі й антивірусна, активність. Ці властивості глікополімерів зумовлені також штамовими особливостями продуцентів та умовами їх культивування. Для виявлення найбільш активних продуцентів антифітовірусних речовин у популяції G. adspersum нами спочатку було проведено дослідження трьох штамів цього виду гриба, виділених із різних біоценозів (Грузії, Китаю та Ізраїлю). Критеріями відбору продуцентів слугували вихід препаратів глікану та здатність їх пригнічувати розвиток ВТМ-інфекції у надчутливих рослинах.
У результаті проведених досліджень було встановлено, що всі штами G. adspersum майже однаковою мірою здатні продукувати полісахариди, що можуть активно інгібувати інфекційність ВТМ in vitro (таблиця). Серед вилучених препаратів найактивнішим щодо ВТМ виявився препарат, отриманий водною екстракцією. Здатність пригнічувати вірусну інфекцію на 50% і більше у нього спостерігається, як правило, вже у концентрації 1 мкг/мл, а на 90% і вище — у концентрації 10-100 мкг/мл та дещо збільшуєть-
ся з її підвищенням. Інші препарати також мали високий рівень інгібувальної активності, проте він був нижчим порівняно з препаратами, отриманими водною фракцією. Особливо це стосується «лужного» препара-
ту. Можливо, у процесі лужної та кислотної обробки полісахариду порушується його структура або ж водою із сировинного матеріалу вилучаються компоненти, більш активні щодо ВТМ.
Активність штамів Ganoderma adspersum як продуцентів гліканів, здатних пригнічувати інфекційність ВТМ на листках D. stramonium
Штам гриба Препарат Концентрація, Кількість некрозів / лист Пригнічення, %
мкг/мл Дослід Контроль
1 2 3 4 5 6
1 2,5 5,2 51+++
10 2,1 6,3 6Т+++
Водний 100 2,3 10,4 Т8+++
500 0,4 9,8 96+++
1000 0,3 9,0 9Т+++
2000 0 9,2 100+++
1 1Т,8 32,6 45+++
10 1Т,4 34,6 50+
ІІ Кислотний 100 13,8 44,8 69+++
500 2,8 38,1 93+++
1000 4,0 3Т,4 89+++
2000 3,0 34,Т 91+++
1 23,6 38,6 39+
10 3,4 8,6 55++
Лужний 100 3,3 11,6 Т2+++
500 2,2 8,0 Т2+++
1000 1,6 14,9 89+++
2000 2,2 13,0 83+++
1 8,3 26,0 68+++
10 8,3 1Т,9 54+++
Водний 100 0,9 26,1 96+++
500 0,8 22,Т 96+++
1000 0,9 24,9 96+++
2000 0,3 28,Т 99+++
1 13,1 29,6 56+++
10 9,1 24,0 62+++
844 Кислотний 100 5,6 21,9 Т4+++
500 2,0 38,5 95+++
1000 0,8 25,5 9Т+++
2000 0,2 Т,3 9Т+++
1 26,8 66,3 60+++
10 1Т,9 46,5 61+++
Лужний 100 1Т,0 35,3 52+++
500 11,3 34,8 68+++
1000 3,8 30,Т 88+++
2000 3,3 1Т,3 81+++
Продовження таблиці
Штам гриба Препарат Концентрація, Кількість некрозів / лист Пригнічення, %
мкг/мл Дослід Kонтpоль
1 2 3 4 5 6
1 9,6 36,8 74+++
10 5,7 31,9 82+++
Водний 100 0,3 27,3 99+++
500 2,5 61,6 96+++
1000 4,1 54,5 92+++
2000 1,4 37,3 96+++
1 17,1 23,8 2 00 о
10 22,4 33,6 33+
1259 Кислотний 100 7,3 27,5 74+++
500 6,7 26,3 75+++
1000 4,8 31,1 85+++
2000 1,4 37,5 96+++
1 26,0 27,8 60
10 36,2 53,7 330
Лужний 100 11,9 33,1 64+++
500 17,0 31,3 46+++
1000 15,3 30,2 50++
2000 10,6 57,0 81+++
Примітка: +++: p < 0,1%; ++: 0.1% < p < 1 %; +: 1 % < p < 5 %; о : p > 5 %.
Що стосується виходу препаратів, то він у різних штамів-продуцентів був майже однаковим і становив 8,0-8,5; 11,0-11,5 і 4,04,5% за водної, лужної та кислотної екстракції, відповідно.
Для подальших досліджень антифітові-русної активності глікану та вивчення механізмів пригнічення розвитку ВТМ-інфекції на інших моделях нами було обрано препарат, отриманий із міцелію штаму ІІ G. ad-spersum за водної екстракції. Цей препарат мав найвищу активність щодо ВТМ.
Антивірусна дія гліканових препаратів, вилучених з міцелію G. adspersum, подібно до інших полісахаридів [12-15], може ґрунтуватись, принаймні на двох імовірних механізмах: 1) активація захисних реакцій рослин, зумовлених генотипом рослини-ха-зяїна; 2) безпосереднє зниження репродукції чи інфекційної активності вірусу in vivo. Для того, щоб перевірити здатність глікану пригнічувати ВТМ-інфекцію за рахунок впливу на природні механізми стійкості, залежні від генотипу рослини [13], нами було досліджено його антивірусну активність на N. sanderae та N. tabacum. Ці види рослин за реакцією щодо інфекції ВТМ різняться тим, що у першого відсутній N-ген
і, отже, механізм локалізації вірусної
інфекції (ЛВІ), хоча первинні некрози на інокульованих рослинах за звичайних умов вирощування рослин утворюються й індукована вірусостійкість (ІВС) розвивається [18].
Нашими дослідами було встановлено, що глікан, доданий до вірусного інокулюма в концентрації 500 та 1000 мкг/мл, пригнічував утворення локальних некрозів на 90-98% як у N. tabacum, так і в N. sanderae (рис. 2). Причому активність препарату суттєво не залежала від його дози.
Отже, ступінь пригнічення інфекційнос-ті ВТМ гліканом суттєво не залежить від генотипу хазяїна і, зокрема, від наявності в геномі К-гена, що детермінує механізм ЛВІ, тобто, останній під впливом даного полісахариду не порушується. Проте на підставі отриманих даних не можна було виключати можливого впливу його на інші захисні механізми рослин, зокрема на формування ІВС, експресія якої не завжди корелює з наявністю механізму ЛВІ [13]. Відсутність такої кореляції показано й у використаних у наших дослідах рослинах N. sanderae [21]. Крім того, не можна було виключити можливість безпосереднього пригнічення гліка-ном процесу репродукції ВТМ у тканинах, завдяки чому первинні некротичні ураження, спричинювані ВТМ, на інокульованих
Ен
PQ
A b О •і—і № зК •і—і И
и
(В
в
И
100
80
60
40
20
0
N. tabacum N. sanderae Кошель
500
1000
Kонцентpацiя глікану, мкг/мл
Рис. 2. Активність глікану G. adspersum щодо інфекційності ВТМ на рослинах
N. sanderae та N. tabacum
листках не з’являються зовсім. Виходячи із цих мipкувань, ми випpобували глікан G. adspersum як можливий iндуктоp pезисте-нтності у «квазінадчутливих» (N. sanderae)
і надчутливих (N. tabacum, соpт Імунний 580) до ВТМ piзновидiв тютюну.
Для дослідження iндуктоpних властивостей глікану G. adspersum викоpистовували piзнi концентpацп (50, 100, 500 мкг/мл) пpепаpату, екстpагованого з міцелію водою, оскільки цей пpепаpат мав найвищий piвень антивipусно'Ї активності in vitro (див. табл.). У pезультатi було встановлено, що оптимальна концен^ація даного пpепаpату, яка, за нашими попеpеднiми спостеpеженнями, також не відзначалась помітною токсичною дією щодо pослинних тканин і мала високу антивipусну активність, становила 500 мкг/мл. У такій концентpацiї полiсахаpид індукував 65% стійкості тютюну до наступної інокуляції ВТМ вже чеpез одну добу після введення його в міжклітинний пpостip листків. Зі збільшенням iнтеpвалу між введен-
ням препарату та інокуляцією індукторна активність дещо знижувалась і на 5-ту добу становила 50%, а на 7-му — 37% (рис. 3).
У процесі випробування індукторних властивостей глікану у рослинах N. sanderae було встановлено, що полісахарид в зазначеній концентрації не вливав на формування ІВС у цих рослинах (дані не наведено), хоча, як показано у попередніх дослідах, пригнічував розвиток локальних уражень, спричинених первинною інфекцією ВТМ (рис. 2). Отже, пригнічення вірусної інфекції у даного виду має інший характер.
Застосування інгібітора транскрипції РНК на матриці ДНК — актиноміцину Д (10 мкг/мл) на рослинах тютюну, оброблених гліканом (500 мкг/мл), за одночасного або нарізного (через 2 доби після введення індуктора) введення показало, що індукована полісахаридом стійкість повністю пригнічувалась цим антибіотиком незалежно від часу і способу його використання (рис. 4).
А Ен О •І—І Я
к
ч
Ен
К
И
«
к
ft
в
о
Глікан
Kонтpоль
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1 3 5 Час між введенням глікану
та інокуляцією ВТМ, доба
Рис. 3. Вплив глікану G.adspersum (500 мкг/мл) на сприйнятливість рослин тютюну
сорту Імунний 580 щодо ВТМ
Kонтpоль
АМД
глікан + АМД ^paa 1 добу)
глікан + АМД (одночасне введення)
Глікан
0
20
40
60
80
100 120 140 Спpийнятливiсть, %
Рис. 4. Вплив АМД на розвиток стійкості рослин тютюну Імунний 580 до ВТМ, індукованої гліканом G. adspersum
Отже, одним з механізмів антивірусної дії глікану G. adspersum є активація клітинного генома, зокрема процесу транскрипції інформаційної РНК та активації синтезу нових протеїнів у клітині, необхідних для розвитку стійкості рослин до вірусної інфекції [13]. Водночас, пригнічення інфекційної активності ВТМ у чутливому виді N. sanderae (рис. 2) могло свідчити про інгібування репродукції вірусу в присутності полісахариду.
Дійсно, дослідження впливу глікану на репродукцію ВТМ у чутливому мутанті тютюну, що реагує на інокуляцію цим вірусом системною інфекцією, оскільки захисні механізми, контрольовані геном N тут відсутні [18], показало, що даний полісахарид пригнічував вірусну інфекцію у разі введення в листя як до, так і після інокуляції ВТМ (рис. 5). Іншими словами, глікан справляє, очевидно, як профілактичну, так і терапевтичну дію на вірусну інфекцію. Однак слід
120
зазначити, що активність пpепаpату була дещо вищою пpи введенні його в pослиннi тканини до інокуляції, хоча piвень інгібування вipусу в усіх ваpiантах piзнився неістотно.
Із цих спостеpежень випливає, що даний полiсахаpид може поpушувати пpинаймнi pаннi етапи вipусного інфекційного пpоцесу, які не залежать від надчутливої pеакцiї та пов’язаних з нею захисних механізмів.
Таким чином, нашими дослідженнями встановлено здатність глікану G. adspersum активувати захисні механізми надчутливих pослин та пpигнiчувати pозвиток ВТМ-інфекції в тканинах чутливого хазяїна. Тобто він має шиpокий спектp антивipусної активності, яка pеалiзується, з одного боку, безпосеpеднiм або опосеpедкованим пpигнi-ченням інфекційності та pепpодукцiЇ вipусу in vivo, а з іншого — індукцією захисних pеакцiй надчутливих pослин de novo. Здатність пpигнiчувати pепpодукцiю та інфекційність
100
А Ен О •І—І И эК •і—і и и
(В
в
И
80
60
40
20
30 хв до інокуляції
30 хв після інокуляції
і І
60 хв до інокуляції
60 хв після інокуляції
Kонтpоль
Рис 5. Вплив глікану G. adspersum на репродукцію ВТМ у рослинах мутанту тютюну (сорт Імунний 580), чутливих до цього вірусу
0
ВТМ може бути зумовлена впливом полісахариду як на процес інфікування чутливих клітин, так і на ранні етапи репродукції вірусу, а саме: на депротеїнізацію вірусної РНК та/ або початкові стадії реалізації вірусного генома в клітині хазяїна.
Отримання та виявлення антифітовірус-них властивостей глікану, що продукується Ganoderma adspersum, є важливим для подальшого вивчення цього полісахариду. Автори мають на меті провести хроматографічне очищення, визначити молекуляр-
ЛІТЕРАТУРА
1. Lindequist U., Niedermeyer T. H. J., Julich W. The pharmacological potential of mushrooms // eCAM. — 2005. -N 2. — P. 285-299.
2. Даниляк М. І., Решетніков С. В. Лiкаpськi ^иби. Медичне застосування та пpоблеми біотехнології. — К., 1996. — 64 с.
3. Ooi V. E. C. Medicinally important fungi // Science and Cultivation of Edible Fungi. — Balkema Publishers, Rotterdam. — 2000. — V. 1. — P. 41-51.
4. Mizuno T. The extraction and development of antitumor-active polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan (Review) // Int. J. Med. Mushrooms. — І999. — V. І. — P. 9-29.
5. Wasser S. P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and imunomodulating polysaccharides // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2002. — V. 60. — P. 258-274.
6. Поліщук О. М., Коваленко О. Г. Біологічна активність глiкополiмеpiв базидіальних ^ибів // Бiополiмеpи і клітина. — 2009. — Т. 25, № 3. — С. І8І-І93.
7. Harris B. Growing wild mushrooms a complete guide to cultivating edible and hallucinogenic mushrooms. — Oakland: Roning publishing, 2003. — 96 p.
8. Андриянова Д. А., Мейчик Н. Р., Николаева Ю. И. и др. Изучение состава функциональных ^упп клеточной стенки мицелиальных ^и-бов // Иммунопатол., аллеpгол., инфек-тол. — 20І0. — № І. — С. 14-15.
9. Mizuno T., Saito H., Nishitoba T., Kawagashi H. Antitumor-active substances from mushrooms // Food. Rev. Int. — 1995. — V. ІІ. — P. 23-6І.
10. Wasser S. P., Weis A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives // Int. J. Med. Mushrooms. — І999. — V. І. — P. 3І-62.
11. Wasser S. P., Didukh M. Y. Mushroom polysaccharides in human health care // Biodiversity of fungi. Their role in human life. — 2005. — Eds. S. K. Deshmukh, M. K. Rai. — P. 289-328.
12. Bohn J. B,, BeMiller J. N. (1>3)-P-D-Glucans as biological response modifiers: a review of
но-масові характеристики і моносахаридний склад виділених препаратів, а також дослідити взаємозв’язок між хімічною будовою та противірусною активністю гліканів. Отримані дані загалом можуть мати важливе значення для розроблення біологічно активних препаратів нового покоління для боротьби з інфекційними захворюваннями рослин, тварин та людини різної етіології.
Роботу виконано за фінансової підтримки УНТЦ (проект 4973).
structure — functional activity relationships // Carbohydr. Polymers. — 1995. — V. 28. — P. 3-14.
13. Дьяков Ю. Т., Коваленко А. Г. Механизмы устойчивости pастений к виpусам и ^и-бам. — М.: ВИНИТИ, І983. — І67 с.
14. Kovalenko A. G., Grabina T. D., Kolesnik L. V. et al. Virus resistance induced with mannan sulfates in hypersensitive host plants // J. Phytopath. — І993. — V. І37, N 2. — P. І33-І47.
15. Hui Sun, Chen Guang Zhao, Xin Tong, Peng Qi. A lectin with mycelia differentiation and antiphytovirus activities from edible mushroom Agrocybe aegerita // Biochem. Mol. Biol. — 2003 — V. 36, N 2. — P. 2І4-222.
16. Kovalenko O. G., Polishchuk O. M., Wasser S. P. Virus resistance induced by glucuronoxy-lomannan isolated from submerged cultivated yeast-like cell biomass of medicinal yellow brain mushroom Tremella mesenterica Ritz.:Fr. (Heterobasidiomycetes) in the hypersensitive host plants // Int. J. Med. Mushrooms. — 2009. — V. ІІ, N 2. — P. 199-205.
17. Kovalenko O. G., Polishchuk O. M., Krupodo-rova T. A. et al. Screening of metabolites produced by strains of Ganoderma lucidum [Curt.:Fr] P.Karst and Ganoderma applanatum [Pirs.:Waller] Pat. for their activity against tobacco mosaic virus // Вісн. КНУ імені Та-pаса Шевченка. Біологія. — 2008. — Т. 51. — С. 32-34.
18. Щербатенко І. С., Олещенко Л. Т. Сомакло-нальна мінливість pеакцiї надчутливості до ВТМ у пpотоклонiв тютюну // Мі^обіол. жуpн. — І994. — Т. 56, № 6. — С. 35-40.
19. Path. 4769363 US, A61K/70; C07H 15/04. Beta-glucan / Musaki A., Sone Y., Yoshida M., Takeuchi K. / Заявл. 04.03.1985; Опубл. 06.09.1988.
20. Молостов А. С. Элементы ваpиационной статистики. — К.: Уpожай, 1965. — І80 с.
21. Коваленко О. Г., Кириченко А. М. Локалізація ВТМ-інфекції і pозвиток індукованої стійкості у Nicotiana sanderae Hort., Datura stramoniun L. та D. metel L. // Мі^обіол. жуpн. — 2004. — Т. 66, № 4. — С. 43-47.
ГЛИКАНЫ ВЫСШЕГО БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Ganoderma adspersum (Schulzer) Donk: ПОЛУЧЕНИЕ И АНТИФИТОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ
А. Г. Коваленко1 О. Н. Полищук1 С. П. Вассер2
1Институт ми^обиологии и виpусологии им. Д. К.Заболотного НАН Укpаины, Киев
2Институт ботаники им. Н. Г. Холодного НАН У^аины, Киев
E-mail: [email protected]
На пpимеpе тpех штаммов G. adspersum, выделенных в ^узии, Китае и Изpаиле, показана возможность высших ^ибов пpодуциpо-вать гликаны, являющиеся активными инги-битоpами фитовиpусной инфекции. Активные антивиpусные пpепаpаты из мицелия гpиба можно получить с помощью водной, кислотной и щелочной экстpакции. Установлена способность полисахаpидных пpепаpатов из мицелия G. adspersum активиpовать защитные механизмы pастений и ингибиpовать инфекционную и pепpодуктивную функцию виpуса табачной мозаики (ВТМ). Устойчивость табака к ВТМ-инфекции под влиянием гликана фоp-миpуется de novo пpи участии тpанскpипции РНК на матpице клеточной ДНК, чувствительной к действию специфического ингибитоpа этого пpоцесса — актиномицина Д. Kpоме того, выявлена способность полисахаpида подавлять pепpодукцию ВТМ в pастениях табака пpи системной виpусной инфекции.
Ключевые слова: Basidiomycetes, Ganoderma adspersum, гликаны, антивиpусная активность, виpус табачной мозаики, виpусоустой-чивость pастений, актиномицин Д, Nicotiana tabacum, Datura stramonium.
GLYCANS OF HIGHER BASISDIOMYCETES MUSHROOM Ganoderma adspersum (Schulzer) Donk : ISOLATION AND ANTYPHYTOVIRAL ACTIVITY
О. G. Kovalenko1 E. N. Polishchuk1
S. P. Wasser2
1Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
2Kholodny Institute of Botany of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
High fungi ability to produce glycans which are active inhibitors of plant virus infection has been shown in three strains of G. adspersum isolated in Georgia, China and Israel. The antiviral preparations may be obtained using water, acid or alkaline extraction. Ability of G. adspersum glycan to activate the plants protective mechanisms and to inhibit the infectious and reproductive functions of tobacco mosaic virus (TMV) has been determined. Resistance of tobacco to TMV infection under glycan influence is formed de novo by participation of the mechanism of RNA transcription on the cellular DNA matrix which are sensitive to influence of specific inhibitor actinomycin D. At the same time, ability of polysaccharide to suppress reproduction of TMV in plants with systemic viral infection has been found.
Key words: Basidiomycetes, Ganoderma adsper-sum, glycans, antiviral activity, tobacco mosaic virus, virus resistance of plants, actinomycin D, Nicotiana tabacum, Datura stramonium.
