CC BY
138
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІ
УДК 579.841.11 : 577.114.083 : 578.865.1
ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОB Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
Е.А. Киприанова1 1Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного
Л. Д. Варбанец1 НАН Украины, Киев
B. В. Шепелевич2 2Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко
C. И. Войчук1
Е-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Получено 08.01.2013
Из штаммов Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens УКМ В-111 и УКМ В-306 — компонентов инсектофунгицидного биопрепарата гаупсин — получены липополисахариды и их фракции, исследована их активность в отношении вируса табачной мозаики. Липополисахариды из клеток штаммов В-111 и В-306 оказались высокоактивными противовирусными агентами и угнетали инфекционность ВТМ на модели трех видов растений-индикаторов в концентрации от
0,001 до 10 мг/мл. Первая фракция липополисахаридов (О-специфические боковые цепи) обоих штаммов не ингибировала вирус табачной мозаики, а часто и стимулировала его репродукцию. В то же время олигосахариды кора (вторая и третья фракции липополисахаридов) в различной степени тормозили развитие вирусной инфекции. По данным электронной микроскопии, при непосредст -венном контакте липополисахаридов с вирусом in vitro вирионы «склеивались», образуя «связки», в то время как в контроле наблюдали отдельные свободные вирусные частицы, что свидетельствует
о прямом взаимодействии между липополисахаридами штаммов P. chlororaphis subsp. aureofaciens и вирусом табачной мозаики.
Ключевые слова: липополисахариды Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens, вирус табачной мозаики, снижение инфекционности, электронная микроскопия.
Активный метаболизм, способность к синтезу разнообразных низкомолекулярных соединений и биополимеров позволяют рассматривать обширный род Pseudomonas как один из потенциально наиболее перспективных для использования в биотехнологии, медицине, экологии, сельском хозяйстве. Биопрепараты на основе штаммов P. putida, P. fluorescens и Р. chlororaphis широко представлены на современном рынке продуктов биотехнологии и с успехом применяются в качестве средства биологической защиты растений. К числу последних принадлежит и биопрепарат гаупсин, созданный на основе двух штаммов Р. chloro-raphis subsp. aureofaciens, который защищен патентом Украины [1] и обладает антифун-гальной, антибактериальной и энтомопато-генной активностью.
В последние годы нашими исследованиями был расширен спектр биологической активности гаупсина и показано наличие у него антифитовирусных свойств, связанных с синтезом бактериями термостабиль-
ных экзополимеров [2]. Представляло интерес выяснить, не вносят ли свой вклад в биологическую активность Р. chlororaphis subsp. aureofaciens липополисахариды (ЛПС) этих микроорганизмов, поскольку исследованиями последних лет установлено, что они играют важную роль во взаимоотношениях растений с бактериями рода Pseudomonas — возбудителями заболеваний, с одной стороны, и с ростстимулирующими штаммами псевдомонад — с другой [3].
Целью работы была оценка противовирусных свойств липополисахаридов штаммов Р. chlororaphis subsp. aureofaciens УКМ В-111 и УКМ В-306 — компонентов биопрепарата гаупсин на модели вируса табачной мозаики (ВТМ).
Материалы и методы
Объектом исследования были ЛПС, полученные из клеток Р. chlororaphis виЪвр. aureofaciens УКМ В-111 и УКМ В-306.
Mикроорганизмы выращивали в условиях аэрации на качалках (220 об/мин) на среде Кинг А следующего состава (г/л): пептон — 20, ^SO4 — 20, глицерол — 20, MgCl2 —
7, дистиллированная вода (до 1 л) [4]. Культивирование проводили в течение 72 ч при температуре 27 °С.
ЛПС получали экстракцией из высушенных ацетоном и эфиром клеток 45%-м водным раствором фенола при 65-68 °С. Водные фракции диализовали против водопроводной, а затем дистиллированной воды для удаления фенола с последующим удалением нуклеиновых кислот осаждением трихлор-уксусной кислотой, а также ультрацентрифугированием (104 000 g, 4 ч). Oчищенные от нуклеиновых кислот ЛПС лиофилизовали.
Для выделения отдельных структурных компонентов молекулы ЛПС расщепляли 3%-й уксусной кислотой (100 °С, 6 ч), осадок липида А получали ультрацентрифугированием (25 000 g, 40 мин), а супернатант концентрировали до объема 10 мл и фракционировали на колонке (70x3 см) с сефа-дексом G-50 в 0,025 M пиридинацетатном буфере, рН 4,5. В результате были получены фракции O-специфического полисахарида ^ПС) и олигосахарида кора (Or-кора) [5].
Антивирусную активность оценивали по влиянию препаратов на вирус табачной мозаики ^TM) (штамм U1). Суспензию ВTM (4 мг/мл), очищенного методом дифференциального центрифугирования, сохраняли при 4 °С в ампулах в 0,01 M фосфатном буфере (рН 7,4) и использовали по мере необходимости. В опытах на растениях-индикаторах по определению антивирусной активности ЛПС использовали ВTM в конечной концентрации 5 мкг/мл; в электронно-микроскопических исследованиях для изучения взаимодействия вируса и ЛПС применяли ВTM в концентрации 2 мг/мл.
Способность ЛПС тормозить развитие вирусной инфекции изучали методом половинок на сверхчувствительных к ВTM растениях дурмана (Datura stramonium L.) и табака (Nicotiana tabacum L., сорт Иммунный 580 и Nicotiana sanderae H.). При этом исследуемые ЛПС в конечных концентрациях 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 мг/мл добавляли к ВTM (5 мкг/мл) за 30 мин до инокуляции растений (в контроле к ВTM добавляли дистиллированную воду). Все препараты, кроме липида А, растворяли в дистиллированной воде. Липид А растворяли в 1%-м диметил-сульфоксиде ^MTO).
Степень угнетения вирусной инфекции (I) рассчитывали по формуле:
І = (1 - О/К)100, %, где О — среднее количество некрозов в опыте, К — среднее количество некрозов в контроле. Полученные результаты обрабатывали статистически с применением метода парных сравнений. Статистические результаты представляли в виде доверительных интервалов либо Хср. ± 8хср.
В электронно-микроскопических исследованиях 0,4 мл смеси ВТМ и ЛПС, содержащей 2 мг/мл ВТМ и 5 мг/мл ЛПС, инкубировали при комнатной температуре в течение
30 мин (контролем служил ВТМ в той же концентрации, разведенный водой), затем готовили препараты для исследований в электронном микроскопе. Использовали медные сеточки (Sigma, США) с пленкой-подложкой из формвара (Serva, Германия), которые помещали на каплю исследуемого материала, выдерживали 1,5 мин и проводили негативное контрастирование 2%-м водным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК). Анализ сеточек осуществляли с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM 1400 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 10 000-30 000.
Результаты и обсуждение
Для выделения отдельных структурных компонентов макромолекулы ЛПС (О-спе-цифический полисахарид — ОПС, олигосахарид кора) использовали мягкий кислотный гидролиз, при котором разрушается кетозидная связь между остатком дезок-сиоктоновой кислоты (КДО), компонентом олигосахарида кора и гидроксильной группой при С6-остатке глюкозамина II, входящего в состав липида А. Выпавший при этом осадок липида А отделяли ультрацентрифугированием. Водорастворимые продукты гидролиза ЛПС разделяли гель-хроматографией на сефадексе G-50. Было показано, что нативные ЛПС представляют собой смесь S- и R-типов молекул, о чем свидетельствует присутствие высокомолекулярной фракции ОПС (фракция I) и низкомолекулярных фракций олигосахарида кора (фракции II и III) (рис. 1).
Для сравнения кроме ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureofaciens УКМ В-111 и УКМ В-306 были также использованы ЛПС, выделенные из других видов бактерий — Rahnella aquatilis и Ralstonia solanacearum.
ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureofaciens В-111 и В-306 оказались высокоактивными противовирусными агентами и неизменно
Номера фракций
Рис. 1. Профиль элюции на сефадексе G-50 деградированных ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureofaciens УКМ В-111 и УКМ В-306:
I — фракции O-специфического полисахарида; II и III — фракции олигосахарида кора
демонстрировали эффект в отношении ВTM на растениях семейства Solanaceae. При концентрации ЛПС 1-10 мг/мл угнетение инфекционности вируса составляло 98-100%, при 0,1 мг/мл — 57-69%, при 0,01 мг/мл — 43-44%. В концентрации 1 мкг/мл снижение инфекционности вируса составляло в различных экспериментах и на различных растениях-индикаторах от 10,2 до 46,0%. Активность обоих ЛПС была приблизительно одинаковой. В табл. 1 приведены результаты одного из экспериментов на растениях дурмана (Datura stramonium L.) и табака (Nicotiana sanderae H., Nicotiana tabacum L.).
Установлено, что ЛПС, полученные из микроорганизмов, принадлежащих к другим родам и видам (Rahnella aquatilis и Ralstonia solanacearum), не были активны в отношении ВTM, а иногда даже стимулировали образование некрозов (табл. 2).
Известно, что ЛПС фитопатогенных видов псевдомонад принадлежат к особой группе молекулярных структур, так называемых РАМР (Pathogen-Associated Molecular Patterns), подавляющих защитный ответ растения на бактериальную инфекцию [6]. В то же время имеются сообщения о том, что ЛПС ростстимулирующих штаммов бактерий рода Pseudomonas (т. е. штаммов, используемых для биоконтроля) действуют противоположным образом: инициируют синтез растениями антимикробных агентов, этилена, гиперчувствительную реакцию, т. е. системную экспрессию защитных механизмов растения [3, 6]. В этой связи представляют интерес данные о защищенном патентом Японии штамме бактерий рода Pseudomonas, ЛПС которого является индуктором устойчивости однодольных растений Monocotyledonae к заболеваниям, действуя на общие механизмы устойчивости растений к патогенам [7].
В доступной нам литературе мы не встретили данных о противовирусном действии ЛПС бактерий рода Pseudomonas, однако исходя из приведенных выше данных можно предположить, что обнаруженная нами активность штаммов Р. chlororaphis subsp. aureofaciens может быть связана с неспецифической стимуляцией защитных сил растений, инфицированных ВТМ. Выясняя, какой структурный компонент молекулы ЛПС (липид А, олигосахарид кора или О-специфический полисахарид)
Таблица 1. Угнетение ВТМ-инфекции препаратами липополисахаридов из штаммов Р. chlororaphis subsp. aureofaciens В-111 и В-306 на растениях Datura stramonium L., Nicotiana tabacum и Nicotiana sanderae H.
Штамм ЛПС, мг/мл Datura stramonium L. N. tabacum Nicotiana sanderae H.
Количество некрозов I, % Количество некрозов I, % Количество некрозов I, %
опыт контроль опыт контроль опыт контроль
В-111 10 0,0 9,6 100b - - - 0 68,8 100b
1 0,5 3,0 83b 0,6 11,8 95b 1,8 54,6 97b
0,1 2,3 11,2 79b - - - 13,2 33,6 61b
0,01 7,0 8,8 21a 12,4 31,6 61a 12,0 21,0 43a
0,001 9,4 15a 5,0 9,2 46a 19,0 22,0 14a
В-306 10 0,0 4,6 100b 0,0 12,3 100b 0,2 41,4 100b
1 1,4 15,8 91b 4,6 21,3 78b 0,85 13,57 94b
0,1 1,8 7,8 77b 7,2 16,6 57b 6,0 10,4 43b
0,01 3,4 7,2 53a 29,4 35,4 17a 3,5 6,0 42a
0,001 5,4 7,6 29a 28,8 28,2 10,2a 11,0 9,6 11,4a
I, % — снижение инфекционности bTM; a — 0,1% < Р < 1%, b — Р < 0,1%; - результат отсутствует.
Таблица 2. Влияние ЛПС Rahnella aquatilis и Ralstonia solanacearum в концентрации 10 мг/мл на ВТМ-инфекцию
Микроорганизм Снижение инфекционности ВТМ (I, %) на растениях
Datura stramonium L. Nicotiana sanderae H.
Rahnella aquatilis 3a 30a
Ralstonia solanacearum Стимуляция 74%a Стимуляция 11%a
проявляет максимальную противовирусную активность, установили, что О-специфиче-ские полисахариды обоих штаммов не ингибировали ВТМ, а иногда и стимулировали его развитие на 10-26% на всех испытанных моделях растений-индикаторов. В то же время фракции олигосахаридов кора (фракции II и III, рис. 2 и 3) в различной степени тормозили развитие вирусной инфекции. Исследовать противовирусную активность липида А нам не удалось. Эта фракция оказалась токсичной для растений-индикаторов и вызывала увядание листьев табака и дурмана. Вместе с тем, согласно данным литературы [3], защитный эффект ЛПС обусловлен частью молекулы, содержащей как липид А, так и связанный с ним олигосахарид кора. Возможно, это объясняет и более низкую по сравнению с нативной молекулой ЛПС активность отдельных фракций олигосахарида кора. В то же время наши данные о влиянии фракций олигосахаридов кора на ВТМ в целом укладываются в представления о том, что во взаимоотношениях ЛПС с растениями именно олигосахарид кора является активным компонентом, а его роль сводится к угнетению или активации защитных реакций растений.
Можно предположить, что и в наших исследованиях олигосахарид кора стимулировал защитные механизмы растений-индикаторов и препятствовал развитию вирусной инфекции.
специфического полисахарида (фракция I) и олигосахаридов кора (фракции II и III) ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureofaciens В-111 в концентрации 1 мг/мл на растениях Nicotiana tabacum (1), Nicotiana sanderae (2) и Datura stramonium (3)
С другой стороны, нас интересовало, влияют ли исследуемые ЛПС на ВТМ при их непосредственном контакте in vitro в отсутствие растения. Электронно-микроскопические исследования показали, что под влиянием ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureofaciens В-111 и В-306 свободно расположенные вирионы «склеиваются», образуя плотные скопления, комплексы, «связки» вируса (рис. 4, Б, В), в то время как в контроле наблюдаются отдельные свободные вирусные частицы (рис. 4, А). Эти данные свидетельствуют о прямом взаимодействии липо-полисахаридов псевдомонад с ВТМ.
Проведенные нами электронно-микроскопические исследования показали высокую интенсивность образования комплексов ВТМ под влиянием ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureofaciens.
Аналогичные эффекты наблюдала Е. Н. Полищук при изучении взаимодействия глюкана Ganoderma adspersum с ВТМ [8]. Полученные результаты позволили сделать вывод, что глюкан образовывал комплексы с вирионами. Это взаимодействие существенно не влияло на структуру вирио-на, поскольку образуемый комплекс диссоциировал при разведении смеси, и инфекционная активность ВТМ при этом сохранялась. Автор рассматривает образование комплекса полисахарида с вирусом как один из возможных механизмов антивирусного действия и высказывает предположение,
Рис. 3. Противовирусная активность O-специфического полисахарида (фракция I) и олигосахаридов кора (фракции II и III) ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureofaciens В-306 в концентрации 1 мг/мл на растениях Nicotiana tabacum (1) и Nicotiana sanderae (2)
Рис. 4. Электронная микроскопия вируса табачной мозаики, контрастированного фосфорно-вольфрамовой кислотой:
А — вирус разведен водой в конечной концентрации 2 мг/мл (контроль);
Б — смесь bTM (2 мг/мл) и ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureofaciens В-306 (5 мг/мл) после их совместного инкубирования в течение 30 мин; В — смесь bTM (2 мг/мл) и ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureofaciens В-111 (5 мг/мл) после их совместного инкубирования в течение 30 мин. Шкала на А — 200 нм, Б и В — 100 нм
что в процессе образования комплексов имело место ионное взаимодействие in vitro между карбоксильными группами остатков глюкуроновой кислоты полисахарида и NH^-группами капсидного протеина оболочки ВTM. Возможно, нечто подобное происходит и при действии на вирус ЛПС исследованных нами псевдомонад, хотя механизмы наблюдаемого эффекта требуют специальных исследований.
Tаким образом, установлена высокая активность ЛПС Р. chlororaphis subsp. aureo-faciens в отношении ВTM в традиционных опытах на растениях-индикаторах; показана связь этой активности с полисахаридами кора. Электронно-микроскопическими исследованиями продемонстрировано взаимодействие между ЛПС и ВTM при непосредственном контакте in vitro. Полученные данные позволяют предположить, что существуют по крайней мере два пути воздействия липополисахаридов Р. chlororaphis subsp. aureofaciens на инфекцию, вызванную ВTM: прямое влияние исследованных ЛПС на вирус при контакте и влияние их на процессы клеточного метаболизма в целом, состоящее в активации защитных механизмов растения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пат. 73682 UA, АО 1N 63/00, C 12 N 1/20. Інсектофунгіцидний препарат гаупсин для боротьби із шкідниками і хворобами сільськогосподарських культур / O. А. Кіпріа-нова, С. В. Гораль. — Заявл. 10.03.2004; Oпубл. 15.08.2005, Бюл. № 8.
2. Балко О. I., Кіпріанова О. А., Коваленко О. Г. та ін. Антифітовірусна активність біопрепарату гаупсин // Miкробiол. біотехнол. — 2010. — № 2. — С. 51-57.
3. Miller S. H., Mark G. L., Franks A., O’Gara F. Pseudomonas-Plant Interactions in: Bernd H.A Rehm Ed. Pseudomonas. Model Organism, Pathogen, Cell Factory. — Darmstadt: Wiley-VCH Verlag GmbH, 2008. — P. 331-369.
4. King E. O., Ward M. K., Raney D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin //J. Lab. Clin. Med. — 1954. — V. 44. — P. 301-307.
5. Варбанец Л. Д., Здоровенко Г. М., Книрель Ю. А. Moisei исследования эндотоксинов. — К.: Наук. думка, 2006. — 236 с.
6. Dow M., Newman M. A., Roepenak E. The induction and modulation of plant defense responses by bacterial lipopolysaccharides // Ann. Rev. Phytopathol. — 2000. — V. 38 — P.241-261.
7. JPN2007077065 (A),AO1N63/00,AO1N63/02. Resistance-inducing agent for disease of monocotyledonae / Shibuya Naoto, Kaku Hanae, Desaki Yoshitake. — 2007-03-29.
8. Полищук Е., Коваленко А., Антипов И., Оверченко В. Ингибирование инфекционно-сти вируса табачной мозаики в присутствии глюкана Ganoderma adspersum (Schular Donk) в изолированных протопластах табака // Вісн. КНУ, Серія «Біологія». — 2012. — Вип. 62. — С. 69-72.
ПРОТИВІРУСНА АКТИВНІСТЬ ЛІПОПОЛІСАХАРИДІВ
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
О. А. Кіпріанова1 Л. Д. Варбанець1 В. В. Шепелевич2
С. I. Войчук1
1Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ
2Київський національний університет імені Tараса Шевченка
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Зі штамів Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens УКM В-111 і В-306 — компонентів інсектофунгіцидного біопрепарату гаупсин — одержано ліпополісахариди та їхні фракції і досліджено їхню активність щодо вірусу тютюнової мозаїки. Ліпополісахариди із клітин штамів В-111 і В-306 виявились високоактивними противірусними агентами і пригнічували інфекційність вірусу тютюнової мозаїки на трьох видах рослин-індикаторів у концентрації від 0,001 до 10 мг/мл. Перша фракція ліпополісахаридів (O-специфічні бічні ланцюги) обох штамів не пригнічувала вірус тютюнової мозаїки, а часто й стимулювала його репродукцію. Водночас олігосахариди кору (друга і третя фракції ліпополісахаридів) різною мірою гальмували розвиток вірусної інфекції. За даними електронної мікроскопії, за безпосереднього контакту ліпополісахари-дів із вірусом in vitro віріони «склеювалися», утворюючи «зв’язки», тимчасом як у контролі спостерігали окремі вільні вірусні частинки, що свідчить про пряму взаємодію між ліпопо-лісахаридами штамів P. chlororaphis subsp. aureofaciens та вірусом тютюнової мозаїки.
Ключові слова: ліпополісахариди Pseudo mo -nas chlororaphis subsp. aureofaciens, вірус тютюнової мозаїки, зниження інфекційності, електронна мікроскопія.
ANTIVIRAL ACTIVITY OF LIPOPOLYSACCHARIDES OF Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
Е. А. Kiprianova1 L. D. Varbanets1 V. V. Shepelevich2
S. I. Voichuk1
1Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
2Taras Shevchenko Kyiv National University
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Lipopolysaccharides and their fractions were obtained from strains Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens UCM В-111 and UCM В-306 — components of insectofungicidal gaupsin biopreparation; their activity against tobacco mosaic virus has been studied. Lipopolysaccharides of strains В-111 and В-306 proved to be highly active antiviral agents and inhibited tobacco mosaic virus infectivity for three species of indicating plants in concentrations 0,001-10 mg/ml. First lipopolysaccharides fraction (O-specific side chains) did not inhibit and often stimulated the virus reproduction. At the same time the core oligosaccharides (the second and the third lipopolysaccharides fractions) decreased to different extent the virus infection development. According to electron microscopy data the virions sticked together forming the sneafs at the direct lipopolysaccharides-virus contact in vitro whereas the single free virus particles were observed in the control. Evidence of direct interaction between lipopolysaccharides of P. chloro-raphis subsp. aureofaciens strains and tobacco mosaic virus is provided.
Key words: Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens lipopolysaccharides, tobacco mosaic virus, infectivity inhibition, electron microscopy.
