CC BY
17
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧНИЙ
УДК:616.311.2+616.314.17+616.314.19)-002+616.71-007.234)-092.4/.9-08-074/-076 О.1. Годована
Г1СТОХ1М1ЧНЕ ДОСЛ1ДЖЕННЯ ГЛ1КОЗАМ1НОГЛ1КАН1В АЛЬВЕОЛЯРНОГО В1ДРОСТКА НИЖНЬО1 ЩЕЛЕПИ НА ТЛ1 ФАРМАКОЛОГ1ЧНО1 КОРЕКЦИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОПОРОЗУ I ПАРОДОНТИТУ
Львiвський нацiональний медичний уыверситет iMeHi Данила Галицького
Актуальнiсть.
За останн десятилiття зросла кiлькiсть науко-вих праць, автори яких обфунтовують iмовiрний кореляцiйний зв'язок мiж низкою показниш, якi характеризують первинний системний остеопо-роз/остеопенiю i резорбцiю кютково' тканини альвеолярного вiдростка як фундаментально' части-ни пародонтального комплексу [1; 2]. Проте, не-зважаючи на зусилля практичних лiкарiв-стоматолопв i науковцiв, поширенiсть та штенсив-нiсть генералiзованого пародонтиту продовжуе зростати [3; 4].
Установлено, що структуру тканин пародонта пщтримують гпкозамшогпкани (ГАГ) екстрацелю-лярного матриксу. Завдяки сво'м фiзико-хiмiчним властивостям, зокрема здатностi утворювати про-теоглiкановi агрегати, глiкозамiноглiкани здатн за-безпечувати численнi функци сполучно'' тканини: 1) трофiчну - активний обмш речовин мiж кров'ю i тканинами; 2) бар'ерну - захист вщ зовнiшнiх подраз-нимв (модулювання функцiонального стану фаго-цт1в та iмунокомпетентних клiтин); 3) пластичну -регенера^я i замiщення дефекпв (взаeмодiя з рецепторами штинно''' поверхнi та стимуляцiя мiгра-цп фiбробластiв i штинно''' пролiферацN) [5].
У процесi виникнення та переб^у патологiчного процесу в пародонтi ферменти бета-глюку-ронiдаза, гiалуронiдаза, бета-^ацетилгексоза-мшщаза та хондро'тинсульфатаза беруть активну участь у розщепленн кислих глiкозамiноглiканiв i глкопроте'ыв мiжклiтинноТ речовини, мембран кл^ин пародонта, а вiдтак - у руйнуванн циркулярной зв'язки i кютково' тканини пародонта в ць лому. Для оптимiзацil процесiв остеогенезу за-пропоновано низку фармакологiчних препара^в, якi впливають на метаболiзм кютковоТ тканини, пiдвищують функцiональну активнiсть остеоблас-тiв, збiльшують 'хню кiлькiсть, сприяють продуку-ванню колагену, а також шпбують утворення по-
передник1в остеокласпв, а в1дтак - i самих остео-класт1в [6]. Актуальними е пошук шляхiв i розробка лкувальних схем, якi включають фармакологiчнi середники, здатн гальмувати резорбцiйнi процеси кютковоТ тканини i проявляти пародонтопротекто-рну дю
Метою роботи було гютолопчне та гiстохiмiчне вивчення кютковоТ тканини нижньоТ щелепи, хребця хвостового вщдту та стегновоТ кiстки щурiв, у яких попередньо змодельовано системний остеопороз i пародонтит. У порiвняльному аспект вивчали вплив на кiсткову тканину рiзних остеотропних препаратiв, зокрема створених на основi ГАГ.
Матерiал i методи дослiдження.
Експериментальнi дослiдження проводили у вiварiТ ЛНМУ iменi Данила Галицького на 30 бтих статевозртих нелiнiйних щурах-самках, маса яких становила 320-350 г. У 25 тварин моделювання патологiчного процесу (системного остеопорозу i пародонтиту) проводили впродовж 2-х мюя^в шляхом додавання в рацюн Трилону Б (Na2EDTA, Sigma) [7]. Додатково в порожнин рота навколо шийок зубiв гострим екскаватором травмували тканину ясен.
Згщно з розробленою схемою дослiду група №1 включала 5 здорових тварин (контрольна група), група №2 - 5 тварин, яких пюля 2-мюячного моделювання патолопчного процесу виводили з експерименту для вивчення патолопчних змш у ю-стках скелета. Група №3 - 5 тварин, яким пюля моделювання патолопчного процесу для фарма-колопчноТ корекцiТ давали препарат "Остеогенон" («Pierre Fabre Medicament Production», Франтя) -оссеТн-гiдроксиапатитний комплекс з розрахунку 0,126 мг/кг добовоТ дози людини на одну тварину. У груш №4 - 5 тварин отримували препарат "В^-рум® Остеомаг" ("Unipharm Inc.", США) на основi кальцш, вiтамiну D3 та мiнералiв iз розрахунку 0,185 мг/кг на одну тварину. Тварини групи №5
(n=5) отримували препарат "Б1валос®" («Les Laboratoires Servier Industrie», Франц1я) на основ! стронц1ю ранелату з розрахунку 0,125 мг/кг на одну тварину, а в груш №6 — 5 тварин отримували препарат "Терафлекс®" («Contract Pharmacal Corporation», «Bayer Consumer Care AG», США/Швейцар1я) на основ! ГАГ (глюкозамшу гщ-рохлориду та натрш хондро'тину сульфату) з розрахунку 0,094 мг/кг на одну тварину. Дози обраних препарат1в для тварин визначали з урахуванням коефщ1ента видово''' стшкосп, виходячи з добово''' дози для людини [8]. Тривалють експерименту складала 4 м1сяц1 (2 мюяц — моделювання пато-лопчного процесу; наступн1 2 м1сяц1 — л1кування). Заб1р матер1алу (нижня щелепа, хребець хвостового вщдту та стегнова кютка) зд1йснювали п1сля виведення тварин з експерименту збтьшенням дози еф1рного наркозу.
Вилучен1 к1стки (нижня щелепа, хребець, стегно) ф1ксували в розчиы Буена. Декальцинац1ю к1сток проводили у 2% розчиы азотно!' кислоти [9]. Зневод-нення зд1йснювали за допомогою етилового спирту зростаючо' концентраций п1сля чого матер1ал заливали в парафш. Пстозр1зи товщиною 7-10 мкм виго-товляли на санному м1кротом1. Фарбування проводили гематоксилшом Ерл1ха та еозином. Гл1коген та основы ГАГ щентифкували за домогою PAS-реакцiï за Мак-Манусом [10], а кислГ ГАГ - альцiановим си-нiм за Стiдманом [11]. Пстолопчы препарати та фо-тореeстрацiю здшснювали методом свГтлово''' мГкро-скопiï з використанням мiкроскопа «Leica DM-2500» та фотокамери «Leica DFC 450C» (Switzerland) [12]. Середы показники рiвня кислих i основних ГАГ оцГ-нювали за бальною шкалою: мала ктькють - 5-40%, середня (помiрна) ктькють - 41-80%, велика ктькють - 81-100%.
Дослщи з тваринами виконували iз дотриманням мiжнародних норм европейсько''' конвенцГ'' про за-хист хребетних тварин, яких використовують в екс-периментальних та Гнших наукових цтях (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes, Страсбург, 1986) [13] вщповщно до «Загальних ети-чних принциыв експеримеыпв на тваринах», схва-лених I Нацюнальним конгресом Гз бюетики (Ки!'в, 2001). Протокол дослГдження (№7 вщ 24 вересня 2012 року) був схвалений комГаею з питань бюетики ЛНМУ Гм. Данила Галицького.
Результати дослщження та ïx обговорення.
За результатами дослГдження встановлено, що дГя остеотропних препаратГв рГзного спрямування мае рГзнонаправлену дГю на скелеты кютки (нижня щелепа, хребець хвостового вщдту та стегнова кютка). Розподт кислих та основних ГАГ у рГзних кютках також вГдбувався з певними особливостя-ми. У нормГ (група №1) у кГстках скелета мала кь лькГсть PAS-позитивних речовин вщповщала вщ-сутностГ ознак запального процесу. МалопомГтне вГдкладання основних ГАГ (7,94%) за вщсутносп
кислих ГАГ, iмовiрно, було свiдченням нормального переб^у моделювання кютковоТ тканини. При патолопчному станi — системному остеопорозi та пародонтитi в групi №2 на ™ порушення оргаы-зацп всiх структурних компонентiв кютковоТ тканини, зокрема змш на рiвнi компактно! та губчастоТ речовини, в уах дослiджуваних кiстках рiвень основних ГАГ рiзко зростав (71,74%) та з'являлася невелика ктькють резервних кислих ГАГ (15,49%), як реак^я оргаызму на ушкодження.
При аналiзi кiсток групи №3, тварини якоТ отримували «Остеогенон», найвищий рiвень кислих ГАГ, що брали участь у репараци тканин, ви-явлено в стегнових кютках (67,34%). Натомють найменша Тх кiлькiсть простежувалася в нижнш щелепi (20,27%) (рис. 1).
Рис. 1. Пом1рне в'дкладання кислих ГАГ (1) у дЛянц деструктивних змн кютковоТ тканини нижньоТ щелепи.
Апьц/ановий синй за Стдманом х 1000
На вщмшу вщ групи №3, що отримувала «Остеогенон», уживання тваринами групи №4 препарату «В^рум®Остеомаг» приводило до низькоТ концентрацп кислих ГАГ у стегнових кютках (15,54%), тодi як цей препарат потенцшвав Т'хне суттеве зростання в хребцях хвостового вщдту (69,49%). У щелепних кютках основы ГАГ домшу-вали (64,35%) над малою ктькютю кислих ГАГ (15,85%) (рис. 2).
Рис. 2. Мала к'льшсть кислих ГАГ у внутр1шн1й стнц остеоцитарних лакун (1). Поодинок зерна кислих ГАГ (2) у цитоплазм/' та в!дростках остеоцит1в юстковоГ тканини нижньоГ щелепи. Альц/ановий синй за Стдманом х 1000
У тварин групи №5 при вживаны препарату
'^валос®" у кютковш тканиш хреб^в простежено одночасне збтьшення кiлькостi основних (73,72%) та кислих (58,35%) ГАГ. Стегнова кютка i нижня щелепа продемонстрували малу ктькють кислих ГАГ (15,70%) (рис. 3) на ™ помiрноТ кiлькостi основних ГАГ (60,64%). Через два мюяц лiкування цим препаратом у компактнш кiстцi альвеолярного вщростка нижньо' щелепи проглядалися числены вогнища резорбцп у виглядi овальних новоутво-рених лакун. Кiстковi балки губчасто' кiстки були потоншенi та деформоваш.
Рис. 3. Мала кЛькють зерен кислих ГАГ (1) у дЛянках деструкцп кютковоТ тканини нижньоТ щелепи.
Альц1ановий син1й за Ст/дманом х 1000
У груш №6, тварини яко' отримували "Тераф-лекс®", у кютковш тканиш хреб^в простежувався найвищий рiвень кислих ГАГ (75,47%), у той час як у стегновш кютц — 51,26%. На вщмшу вщ попе-реднiх шдгруп у щелепних кiстках групи № 6 вияв-лено найвищий рiвень кислих ГАГ (59,76%) (рис. 4) на ™ прискореного перебiгу регенерацшних процесiв (рис. 5), що свщчило про доцiльнiсть i високу ефективнють застосування препарату "Те-рафлекс" у тварин зi змодельованим пародонти-том та системним остеопорозом.
Рис. 4. Нагромадження кислих ГАГ у внутр1шн1й стнц ос-теоцитарних лакун (1), у цитоплазмi остеоцит1в (2) та у вiдростках остеоцитiв (3) у длянках репаративно'Т ре-генерацТТ альвеолярного в(дростка нижньоТ щелепи. Аль^ановий синй за Ст/'дманом х 1000
Рис. 5. Велика шькють активних остеобла^в ( 1) на пове-
рхнi кютковоТ тканини нижньоТ щелепи (2). Новоутворенi остеоцити (3) в остеоцитарних лакунах (4).
Гематоксилн-еозин х 1000
Серед шших особливостей проведено!' фарма-колопчноТ' корекцп патолопчного процесу встано-влено, що в дослщжуваних зразках тварин, як1 отримували "Остеогенон", "В1трум®Остеомаг" та "Б1валос®", простежувалася поява невеликих м1к-ротр1щин у кютковш тканиш нижньоТ щелепи, стегновш кютц та хребцях (рис. 6), тод1 як препарат "Б1валос®" спричиняв розвиток глибоких м1кро-тр1щин саме в стегнових кютках тварин.
Рис. 6. Нагромадження PAS-позитивних речовин (1) у длянках мкротрщин (2). Неоднорiдне нагромадження основних ГАГ у цементних лЫях (3). PAS-реак^я за Мак-Манусом х 1000
Це явище отримало свое пщтвердження в л1-тературних джерелах, де клш1чш роботи демон-стрували появу незвичайних та низькоенергетич-них, з атиповою локал1зац1ею (пщвертлюжш та д1-аф1зарн1) перелом1в стегновоТ кютки в пац1ент1в, як1 вживали р1зш остеотропш препарати, в тому числ1 й бюфосфонати, упродовж 5-10 рок1в. Серед цих пац1ент1в були й так1, в яких не визначався остеопороз за денситометричними критер1ями [14]. 1мов1рно, що основна ппотеза про патоф1з1о-лопю атипових перелом1в стегновоТ к1стки вказуе на те, що жорстке i тривале пригшчення резорбцп кютковоТ' тканини може призводити до накопичен-ня в кютках мiкроушкоджень i розвитку "неспро-можностГ кiстковоï тканини в мюцях максимального навантаження, зокрема в пщвертлюжних або дiафiзарних вщдтах стегна [15]. Можна припусти-ти, що поява таких мiкротрiщин у щелепних кют-
ках пщгруп №3, №4 i №5 свщчить про Т'х належ-нють до групи кiсток, якi теж сприймають пщвище-не навантаження. Слщ зауважити, що у тварин групи №6, як вживали препарат на основi ГАГ «Терафлекс®», подiбних мiкротрiщин у дослщжу-ваних кiстках не виявлено.
Висновок.
Таким чином, експериментальн дан дозволили встановити, що на ™ патологiчного процесу використання препарату «Терафлекс®» продемо-нструвало найвиразшшу позитивну динамiку в уах кiсткових структурах. Зокрема, в зразках кютки альвеолярного вiдростка нижньоТ щелепи дтянки руйнування були вiдсутнiми, а рiвень кислих ГАГ був найвищим.
Перспективи подальших дослiджень.
Отриманi данi дозволяють рекомендувати «Терафлекс®» для включення в схему комплексного лкування пацiентiв iз пародонтитом рiзних ступе-нiв тяжкост на тлi системного остеопоро-зу/остеопени.
Лiтература
Дмитриева Л.А. Состояние тканей пародонта у пациентов с системным остеопорозом / Л.А. Дмитриева, В.Г. Атрушкевич, У.А. Пихлак // Стоматология.
- 2006. - №5. - С. 17-19.
Мазур 1.П. Порушення кюткового метабол1зму у хворих на генерал1зований пародонтит (Кгмшко-експериментальне дослщження. Частина 3) / 1.П. Мазур // 1мплантолог1я Пародонтолопя Остеолог1я.
- 2012. - №2(26). - С.70-74.
Белоклицкая Г.Ф. Пародонтологический статус людей пожилого и старческого возраста / Г.Ф. Белоклицкая, Э.М. Павленко // Современная стоматология. - 2013. - №2. - С. 117-119. Кулыгина В.Н. Результаты исследования распрос-таненности и структуры заболеваний пародонта у лиц молодого возраста / В.Н. Кулыгина, Мохаммад Аль Мохаммад, Л.Л. Козлова // УкраТнський стоматолопчний альманах. - 2013. - №5. - С. 29-31.
6.
8.
1.
10. 11. 12.
13.
3.
4.
14.
15.
Ларионов Е.В. Роль сульфатированных гликоза-миногликанов (сГАГ) в физиологии и патофизиологии тканей пародонта / Е.В. Ларионов, Т.А. Глыбина // Стоматология сегодня. - 2007. - № 2(62). -С. 52-53.
Мащенко И.С. Научно-практическое обоснование различных видов остеотропной терапии, используемой в комплексном лечении генерализованного пародонтита / И.С. Мащенко, А.А. Гударьян // Современная стоматология. - 2005. - №2. - С. 64-67. Пат. 2070031 С1 Россия А61К6/02 Способ лечения генерализованного пародонтита / Вишняк Г.Н., Григоров Ю.Г., Поворознюк В.В. [и др.] (РФ). -№93035895/14; заявл. 12.07.93; опубл. 10.12.96; ФИПС - 1996.
Стефанов О.В. Докл1н1чн1 дослщження лкарських засоб1в : метод. реком. ; за ред. член-кор. АМН УкраТни О.В. Стефанова. - К.: Видавничий д1м «Авщена», 2001 - 528 с.
Волкова О.В. Основы гистологии с гистологической техникой. - 2-е изд., перераб. и доп. / О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий. - М.: Медицина, 1982. - 304 с. Лупа Х. Основы гистохимии ; пер. с нем. под ред. Н.Т. Райхлина. - М.: Мир, 1980. - 342 с. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А. Меркулов. - Л.: Медицина, 1969. - 422 с. Саркисов Д.С. Микроскопическая техника: руководство / Д.С. Саркисов, Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 542 с.
Свропейська конвенц1я про захист хребетних тварин, що використовуються для дослщних та шших наукових цтей. Страсбург, 18 кв1тня 1996 року: офщшний переклад [Електронний ресурс] Верховна Рада УкраТни. - Офщ. веб-сайт. -(м1жнародний документ Ради Свропи). - Режим доступу до документа: http://zakon.rada.gov.ua/cgi-bin/laws/main.cgi?nreg=994_137). Girgis C.M. Bisphosphonate use and femoral fractures in older women / C.M. Girgis, M.J. Seibel // JAMA. — 2011. — Vol. 305. — P. 2068-2074. Schilcher J. Incidence of stress fractures of the femoral shaft in woman treated with bisphosphonate / J. Schilcher, P. Aspenberg // Acta Orthop. - 2009. -Vol.80(4). - P. 413-415.
Стаття надшшла 18.02.2016 р.
Резюме
Обговорюються результати гiстохiмiчного дослщження глкозамшоглкаыв кюток експериментальних тварин (альвеолярного вщростка нижньоТ щелепи, хребця хвостового вщдту, стегновоТ кютки) в норм^ пюля мо-делювання системного остеопорозу i пародонтиту та пюля Тх фармаколопчноТ корекци препаратами загальноТ дм "Остеогенон", "Вггрум®Остеомаг", ^валос®" та "Терафлекс®". Установлено, що дiя остеотропних препара-^в рiзного спрямування мае рiзнонаправлену дш на скелеты кютки. Разом з тим, у щелепних кютках тварин, яким давали «Терафлекс®», виявлено найвищий рiвень кислих глкозамшогыкаыв на ™ прискореного переб^ гу регенерацшних процеав, що свщчило про доцтьнють i високу ефективнють застосування препарату «Терафлекс®» у тварин зi змодельованим пародонтитом i системним остеопорозом.
Ключовi слова: глкозамшоглкани, експеримент, щури, кюткова тканина, остеопороз, пародонтит.
Резюме
Целью исследования являлась гистохимическая оценка гликозаминогликанов костей эсперименталь-ных животных (альвеолярного отростка нижней челюсти, позвонка хвостового отдела, бедренной кости) в норме, после моделирования системного остеопороза и пародонтита, а также после их фармакологической коррекции препаратами общего действия "Остеогенон", "Витрум®Остеомаг", "Бивалос®" и "Терафлекс®". Результаты исследования засвидетельствовали разнонаправленное воздействие данных остео-тропных препаратов на костную ткань скелета. В костной ткани альвеолярного отростка нижней челюсти животных, принимающих "Терафлекс®", определяли самый високий уровень кислых гликозаминогликанов на фоне ускоренного течения регенерационных процессов, что было доказательством эффективности применения препарата "Терафлекс®" после моделирования пародонтита и системного остеопороза.
Ключевые слова: гликозаминогликаны, эксперимент, крысы, костная ткань, остеопороз, пародонтит.
5
7
9
UDC: 616.311.2+616.314.17+616.314.19)-002+616.71-007.234)-092.4/.9-08-074/-076
HISTOCHEMICAL INVESTIGATION OF GLYCOSAMINOGLYCANS
OF THE MANDIBULAR ALVEOLAR PROCESS IN PHARMACOLOGICAL CORRECTION
OF EXPERIMENTAL OSTEOPOROSIS AND PERIODONTITIS
Hodovana O.I.
Danylo Galician Lviv National Medical University
Summary
The current issueof this study is to search for the ways and elaboration of treatment schemes, which include pharmacological means, capable of inhibiting processes of bone tissue resorption, and which show periodontium -protective action.
The aim of the research was histological and histochemical investigation of the mandibular bone tissue, caudal vertebra and femur of rats with prior modeling of systemic osteoporosis and periodontitis. Influence of osteotropic medications, "Osteogenon" "Vitrum®Osteomag", "Bivalos®" and "Teraflex " on bone tissue was studied in comparative aspect. Glycogen and basic glycosaminoglycans (GAGs) were identified by means of PAS-reaction after MacManus, and acid GAGs - by alcian blue after Stidman.
It has been established that the action of different osteotropic medicines has various influences on skeletal bones. In the norm (group №1) low level of PAS-positive substances in skeletal bones showed absence of signs of the inflammatory process. Slight deposit of basic GAGs (7.94%) with the absence of acid GAGs, most likely, was the evidence of a normal course of bone tissue modeling. In pathological process - systemic osteoporosis and periodontitis in group №2 in impairment of organization of all structural components of bone tissue, particularly modifications of compact and spongy substance, the level of basic GAGs drastically increased (71.74%) and slight amount of reserved acid GAGs (15.49%) appeared in all examined bones as a body's reaction to damage.
Having analyzed bones of group №3, animals of which received "Osteogenon", the highest level of acid GAGs, involved in tissue reparation, was detected in femurs (67.34%). At the same time, the lowest level was observed in mandibular bone (20.27%).
Unlike group №3, which received "Osteogenon", use of medication "Vitrum®Osteomag" by animals of group №4 resulted in low concentration of acid GAGs in femurs (15.54%), while this medication potentiated their significant growth in caudal vertebrae (69.49%). In jawbones basic GAGs dominated (64.35%) over low amount of acid GAGs (15.85%).
In animals from group №5, which used medication "Bivalos®", simultaneous increase in amount of basic (73.72%) and acid (58.35%) GAGs was observed in bone tissue of the vertebrae. Femur and mandible showed low amount of acid GAGs (15.70%) and moderate amount of basic GAGs (60.64%). In 2 months' treatment with this medication, numerous foci of resorption in the form of oval newly formed lacunae were seen in compact bone of the alveolar process in the mandible.
Trabeculae of spongy bone were thin and deformed.
In group №6, animals of which received "Teraflex®" (glucosamine hydrochloride and sodium chondroitin sulfate), the highest level of acid GAGs (75.47%) was observed in bone tissue of vertebrae, while in femur it was 51.26%. Unlike previous subgroups, the highest level of acid GAGs (59.76%) was revealed in jawbones of group №6 in accelerated course of regeneration processes, which proved the expediency and high efficacy of medication "Teraflex®", used for animals with modeled periodontitis and systemic osteoporosis.
Among other peculiarities of conducted pharmacological correction of pathological process, it was established that appearance of micro fissures in bone tissue of the mandible, femur and vertebrae was observed in examined samples of animals, which received "Osteogenon" "Vitrum®Osteomag", "Bivalos®" and "Teraflex®".
Thus, the obtained data enable to recommend medication on the basis of GAG "Teraflex®" for inclusion to scheme of complex treatment of patients with periodontitis with various degrees of severity in systemic osteopo-rosis/osteopenia.
Key words: glycosaminoglycans, experiment, rats, bone tissue, osteoporosis, periodontitis.
