Гипотетическая модель избыточного метаболизма дрожжей, утилизирующих жидкие h-алканы Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

УДК 582.28/663.14

П.Г. Ганин, В.А. Галынкин

ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ИЗБЫТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА ДРОЖЖЕЙ, УТИЛИЗИРУЮЩИХ ЖИДКИЕ Н- АЛ КАНЫ

Рост и метаболизм микроорганизмов с использованием жидких я-алканов нефти в качестве единственных источников углерода и энергии представляют интерес для решения экологических задач (деструкция компонентов нефти), а также для промышленного производства ряда соединений (цитохром Р-450, жирные кислоты и спирты и другие). В процессе физиологической адаптации микроорганизмов к жидким я-алканам происходят характерные адаптационные преобразования физиологического состояния клеток и компонентного состава культуральной среды: синтез индуцибельных ферментов, морфологические изменения, интенсивное накопление поверхностно-активных веществ (ПАВ) в культуральной среде (жирные кислоты, спирты и др.), диспергирование и солюбилизация гидрофобного субстрата [1-6].

Жидкие я-алканы практически нерастворимы в воде, их транспорт в клетки микроорганизмов может происходить по трем основным механизмам [1, 3]: контактному, диффузионному и опосредованному. Первый предполагает адсорбцию капля — клетка; второй — транспорт растворенных я-алканов через водную фазу; третий (солюбилизированного субстрата) — растворение я-алканов в водной среде, внедрение в мицеллы, адсорбцию мицелл на клетках с последующей диффузией субстрата в них. Наиболее вероятно, что основной поток я-алканов в клетки происходит посредством второго и (при накоплении ПАВ) третьего механизмов.

Начиная с 60-х годов прошлого столетия опубликовано большое количество работ по исследованию развития микроорганизмов на я-ал-канах. Некоторые экспериментальные данные не находят исчерпывающего теоретического обоснования на основе традиционных моделей транспорта гидрофобного субстрата в клетки, роста и метаболизма микроорганизмов.

Цель работы — анализ зависимости роста и метаболизма дрожжей от концентрации жидких я-алканов и создание гипотетической биохимической схемы метаболизма дрожжей при избыточном поступлении субстрата в клетки.

Краткий анализ экспериментальных данных

Ряд экспериментальных данных, по нашему мнению, прямо или косвенно свидетельствует о превышении в некоторых случаях скорости транспорта жидких я-алканов в клетки дрожжей и начальных стадий катаболизма субстрата над ростовыми потребностями. Приведем основные из них:

1. Добавление смеси я-алканов (16 г/л) в период интенсивного роста дрожжей (периодическое культивирование Candida maltosa) приводит к замедлению или остановке роста популяции на несколько часов [6]. При этом дыхание не лимитировано я-алканами, однако, после добавления субстрата наблюдается развивающееся во времени увеличение удельных скоростей их потребления, потребления кислорода, выделения жирных кислот и спиртов; процесс сопровождается ростом стехиометрического коэффициента я-алканы/кислород. Период задержки роста сопровождается интенсификацией диссипации энергии.

2. С увеличением начальной концентрации смеси я-алканов (50) от 3 до 21 г/л (периодическое культивирование дрожжей С. maltosa) происходит увеличение длительности лаг-фазы, при этом возрастает концентрация жирных кислот в культуральной жидкости и удельная скорость (усредненная за период задержки роста) потребления субстрата [7—9].

3. Повышение начальной концентрации я-гексадекана (периодическое культивирование) приводит к увеличению количества липид-ных включений в клетках, наибольшее содержание которых наблюдается в лаг-фазе [10].

4. Зависимость удельной скорости роста дрожжей от концентрации //-алканов (непрерывное культивирование) удовлетворительно описывается уравнением Моно — Иерусалимского. При этом предполагается, что пропорционально количеству потребленных «-алканов А^образу-ется некий неидентифицированный продукт метаболизма Л ингибирующий рост клеток:

А

5. Периодическое культивирование дрожжей С. maltosa с добавлением компонентов питания при поддержании низкой концентрации смеси жидких//-алканов (5) существенно благоприятнее для роста, чем при высокой концентрации субстрата: при S— 1,7—16 г/л конечная концентрация биомассы составляла Хк = 32 ± 2 г/л [8], а при S = 0,1 — 1,0 г/л достигала величины XK = i06 ± 5 г/л (абсолютно сухой вес) [6, 8, 12].

6. Микроскопирование культуральной жидкости позволяет выявить различное взаимодействие клеток с субстратом: адсорбированные и не контактирующие с каплями клетки. Принимая во внимание, что в литературе доминирует представление о контактном механизме транспорта //-алканов в клетки дрожжей [3], такая выраженная гетерогенность культуральной среды позволяет предположить различную обеспеченность субстратом и возможность избыточного метаболизма для части клеток.

7. Концентрация жирных кислот и спиртов в культуральной среде (периодическое культивирование дрожжей на //- алканах) достигает максимальной величины в конце лаг-фазы, тогда как в экспоненциальной фазе их концентрация понижается [5, 8,13].

Поскольку жирные кислоты и спирты являются промежуточными продуктами катаболизма //-алканов, такая динамика их содержания свидетельствует о превышении скорости транспорта субстрата в клетки и начальных стадий катаболизма субстрата над ростовыми потребностями клеток. Действительно, катаболизм «-алканов включает этап р-окисления [1], при этом константа диссоциации ацилкарнетинов Ктс« 1 [ 14], что указывает на их легкую диссоциацию. Накопление в культуральной среде жирных кислот, очевидно, связано с диссоциацией ацилкарнетинов, что может быть вызвано превышением скорости р-окисления над скоростью функционирования цикла Кребса. Поскольку водородный показатель рН в клетке

близок к нейтральному значению, а в среде поддерживается на уровне рН « 4, очевидно, что содержание жирных кислот в клетке весьма велико.

Оценим концентрацию жирных кислот в клетках при периодическом культивировании дрожжей С. maltosa в аппарате с интенсивным перемешиванием (1240 об/мин) при начальной концентрации смеси //-алканов 16 г/л, рН = = 4,0 - 4,2 и температуре 32-34 "С. При периодическом культивировании наиболее точную оценку можно получить для момента достижения концентрацией жирных кислот экстремального (максимального) значения, когда можно принять существование динамического равновесия концентрации жирных кислот в среде и внутри клеток. Наибольшее значение концентрации жирных кислот (конец лаг-фазы) составляло 50 + 5 мг/л, при этом водородный показатель внутри клетки рН//г = 6,8 + 2,0 [8]. Затем учитываем, что константа диссоциации жирных кислотрК'а « 5,6 и полагаем, что отношения активностей диссоциированной и недиссоцииро-ванной форм жирных кислот внутри клетки и в среде равны; также предполагаем равенство концентраций недиссоциированной формы жирных кислот внутри клетки и в среде. На основе проведенного анализа и уравнения Гендерсона — Гассельбаха в итоге можно показать, что концентрация жирных кислот в клетке в 38,5 раз больше, чем в среде. При значении концентрации жирных кислот в среде 50 мг/л их концентрация в клетках составит 1,9 г/л.

8. Зависимость удельной скорости роста ц микроорганизмов от концентрации //-алканов S у других величин удовлетворительно описывается эмпирическим выражением [15—17]:

(s/d,

К,+

((

(1)

где

dn

.0,6

Í г0'4 (ео) •

(2)

Здесь цтах — максимальная удельная скорость роста; Кц— константа насыщения; don — средний объемно-поверхностный диаметр капель полидисперсной эмульсии; К— числовой коэффициент; е0= ЛуИр — средняя величина диссипации энергии в аппарате в расчете на единицу

массы жидкости; N — вводимая мощность механического перемешивания; V— объем среды; р, ф — плотность и объемная доля жидкой дисперсной фазы («-алканов); а^ — межфазное натяжение жидкость-жидкость; //-алканы — куль-туральная среда.

Отметим, что величина S/don пропорциональна удельной (на единицу объема среды) площади поверхности раздела фаз субстрат — среда, а в уравнение (1) входит величина S / d*n- Это

обстоятельство интерпретируется как доминирующая роль мелкодисперсной фракции капель полидисперсной эмульсии в кинетике роста популяции [3, 15—17].

Как следует из уравнений (1), (2), увеличение вводимой мощности механического перемешивания и уменьшение поверхностного натяжения среды увеличивает удельную площадь поверхности раздела фаз субстрат — среда и удельную скорость роста микроорганизмов. Однако выраженное, стимулирующее рост влияние вводимой мощности механического перемешивания и добавления жирных кислот (приводящее к сниже-а

ствлять только с увеличением доступности гидрофобного субстрата для клеток или с увеличением массообмена газов, хотя они и увеличивают поверхность раздела фаз субстрат — среда или газ — среда. Оба фактора могут существенным образом препятствовать взаимодействию капель с клетками (следовательно, уменьшать транспорт субстрата в клетки). Первый — увеличение вводимой мощности перемешивания — способствует механическому дроблению адсорбированных частиц типа капля-клетка [18, 19, 20]. Второй — добавление жирных кислот — препятствует их адсорбции, поскольку ^-потенциалы капель (формируется жирными кислотами) и клеток способствуют их коагуляционной устойчивости [21].

Гипотетическая модель

Представленные данные (п.п. 1—8) дают основание для поиска модели метаболизма дрожжей при избыточном поступлении жидких //-алканов в клетки. На основе известной гипотетической биохимической схемы взаимодействия и регуляции процессов утилизации //-алканов дрожжами Candida lipolytica (Р-окисление жирных кислот локализовано в пероксисомах)

[1] (рис. 1) и с учетом влияния продуктов катаболизма //-алканов на кинетику ферментативных реакций [14,22], на проницаемость цитоплазма-тической и митохондриальной мембран [23—25] можно сделать следующие предположения относительно внутриклеточных событий при избыточном метаболизме субстрата.

1. Будучи гидрофобными соединениями, //-алканы обладают высоким сорбционным сродством к внутриклеточным мембранным структурам, что отрицательно скажется на метаболизме клеток.

2. Накопление //-алканов (немодифициро-ванных) в клетке приведет к повышению осмотического давления.

3. Накопление в клетке жирных кислот (константа диссоциации рК'а ~ 5,6) приведет к понижению значения водородного показателя в цитоплазме клеток рН//г и в митохондриях, что отрицательно скажется на метаболизме клеток (ввиду зависимости активности ферментов от водородного показателя).

4. //-Алканы и продукты их катаболизма (жирные кислоты и спирты) являются индукторами специфических ферментов [1]. Процессы физиологической адаптации микроорганизмов являются одной из причин задержки роста [26]. Следовательно, происходящий в фазе С| клеточного цикла синтез индуцибельных ферментов приведет к задержке пролиферации клеток, а следовательно, и задержке роста популяции.

5. Превышение скорости транспорта субстратов в клетки над ростовыми потребностями могут являться причиной задержки роста популяции [26].

6. Жирные кислоты обладают выраженным регуляторным действием на внутриклеточные процессы, в частности, воздействуют на направленность и интенсивность гликолиза (фосфо-глюкоизомераза, пируваткиназа ингибируются жирными кислотами) [14, 22], направленность которого тесно связана с цикличностью клеточного развития (эндогенная модель деления клеток предполагает необходимость образования пула резервных полисахаридов [27]).

7. Продукты катаболизма //-алканов — жирные кислоты и спирты; супероксидные анионы

О*" а также Н202, ОН- и свободные радикалы [ 1, 2, 28—31] способны повреждать биологические

Рис. 1. Предположительная схема взаимодействия и регуляции процессов утилизации //-алканов дрожами С. Иро1угка, предложенная Фукуи и Танака [1].

Сокращения: ФАД — флавинадениндинуклеотид; ФАДН2 — восстановленная форма ФАД; НАД — никотинамидадениндинуклеотид; НАД-Н — восстановленная форма НАД; Г-З-Ф — глицерол-3-фосфат; ДОАФ — диоксиацетонфосфат; Ацетил-кар. — ацетил -карнетин; Ацетил-СоА— ацетилкофермент А; Ацил-СоА —ацил-СоА-кофермент. Обозначения: 1 — цитохром Р-450; 2 — НАДН-цитохром Р-450-редуктаза; 3 — алко-гольдегидрогеназа; 4 — альдегид-дегидрогеназа; 5— ацил-СоА-синтетаза; 6 — каталаза; 7— система |3-окисления; 8 — изоцитратлиаза; 9 — малатсинтетаза; 10 — НАДФ-зависи-мая изоцитратдегидрогеназа; 11 — малатдегидрогеназа; 12 — цитратсинтетаза; 13 — ако-нитаза; 14— НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа; 15— карнитинацетилтрансфераза; 16— НАД-зависимая глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; 17— ФАД-зависимая глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; 18— глицерофосфатсинтетаза

мембраны [23—25], что приведет к следующим результатам:

а) при воздействии на митохондриальную мембрану — к разобщению окислительного фос-форилирования;

б) при воздействии на цитоплазматическую мембрану — к нарушению внутриклеточного энан-тиостаза (градиента ионов).

8. Жирные кислоты с числом атомов углерода менее 10—12 способны в неактивированной форме (более 12 — только в форме ацилкарнетинов) посредством диффузии проникать через митохондриальную мембрану [14], следовательно, их транспорт в митохондрию не регулируется.

На рис. 2 приведена гипотетическая модель метаболизма дрожжей (способных утилизиро-

н-Алкан

^.Альдегид Жирная к-та ^ Аиил-СоА ^ Липиды

Н202, От2- 0Н-->Н2О +.1/2 02 ^----^

^ ■_

Пул полисахаридов

АМФ,

Жирная к-та Альдегид ц— Спирт

АМФ 119

Гликолиз

Т Митохондрии

Липиды) <4-

р-Окисление жирных кислот

^ф Ацетил • Кар.

Ацетил* Кар.

Ацетил- С о А

[итрат

Глиоксипат

Мапат

ос^Кетоглутарат

АДФ+Р

Цитоплазма

АДФ+Р

Рис. 2. Предположительная схема взаимодействия и регуляции процессов метаболизма в клетках дрожжей С. Пробка при избыточном поступлении жидких //-алканов. Сокращения: ЖС — жирные спирты; Алд — альдегиды; ЖК — жирные кислоты; 02"~— супероксидный анион; Г-6-Ф — глюкозо-6-фосфат; ФДФ — фруктозо-1,6-дифос-фат; ГФ — 2-глицеральдегидфосфат; ЗФГ — 3-фосфоглицерат; ФЕП — фосфоенолпируват. Обозначения: 19 — фосфоглюкоизомераза; 20 — пируваткиназа; — аллостерические ферменты; ^ и — ингибирование и активация аллостерических ферментов, соответственно. Остальные сокращения и обозначения см. в подписи к рис. 1.

вать жидкие я-алканы) при избыточном поступлении субстрата, превышающем ростовые потребности клетки. Модель иллюстрирует отмеченные выше явления (п.п. 5—8). За основу принята предположительная схема взаимодействия и регуляции процессов утилизации я-алканов дрожжами С. Про/ун'са, предложенная Фукуи и Танака [1]. В предлагаемой модели избыточного метаболизма (см. рис. 2) предполагаются наличие глицеро-фосфатного и малатного челночных механизмов передачи восстановительных эквивалентов через митохондриальную мембрану, как и в модели Фукуи и Танака (см. рис. 1), однако для краткости на схеме рис. 2 они не представлены.

Очевидно, что явления, отмеченные ранее в п.п. 1—8, приведут к задержке роста, в п.п. 7а и 8 — к разобщению процессов окислительного фосфорилирования (АрН — фактор сопряжения), а в п.п. 7, 8 — к повышению затрат субстрата на функции поддержания жизнедеятельности и увеличению диссипации энергии.

Очевидно, что предполагаемый механизм разобщения окислительного фосфорилирования

жирными кислотами и спиртами подобен процессу, происходящему в митохондриях клеток бурого жира теплокровных животных, впадающих в зимнюю спячку [25]. Если в последнем случае "физиологическая роль" процесса разобщения окислительного фосфорилирования состоит в поддержании тепла животного (диссипация энергии 0), то в случае роста дрожжей с использованием жидких я-алканов — в окислении избытка субстрата и продуктов его катаболизма в клетке:

среде ^ клетке ^..... ^ АР Н + ... >■

^АТФ + ...+ 0.

Таким образом, при избыточном поступлении жидких я-алканов в клетки дрожжей предположительно происходит разобщение окислительного фосфорилирования промежуточными продуктами катаболизма субстрата; это обеспечивает возможность превышения скорости утилизации субстрата и продуктов его катаболизма над ростовыми потребностями клетки в данном физиологическом состоянии и является их защитной реакцией.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Fukui S., Tanaka A. Metabolism of alkanes by veasts // Adv. Biochem. Eng. 1961. Vol. 19, N° 1. P. 217-237.

2. Ipa.ioiia Н.Б., Диканская Э.М., Михалева B.B.

Использование углеводородов дрожжами. М.: ОНТИТЭИмикробиопром, 1971. 120 с.

3. Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев J1.C.

Моделирование биохимических реакторов. М.: Лесная промышленность, 1979. 344 с.

4. Давидова Е.Г., Рачинский В.В. Поглощение «-алканов дрожжевыми клетками: Обзор // Успехи совр. биологии. 1979. Т. 88, № 2. С. 198-209.

5. Pareillux A. Hydrocarbon assimilation by Candida Lipolitica: Formation of biosurfactant // Eur. J. Appl. Microb. Biotechnol. 1979. Vol. 9, № 1. P. 91-100.

6. Ганин П.Г., Миндукшев И.В., Деркачев Э.Ф.

и др. Использование биохимических принципов в управлении ферментацией // Перспективные направления химии и химической технологии: Сб. Л.: Химия, 1991. С. 121-129.

7. Галынкин В.А., Ганин П.Г., Деркачев Э.Ф., Миндукшев И.В. Альтернативность программ роста и индукции дыхательных систем в процессе ферментации на «-алканах // Перспективные направления химии и химической технологии: Сб. Л.: Химия, 1991. С. 113-121.

8. Ганин П.Г. Закономерности развития дрожжей на «-парафинах в периодических условиях культивирования в производстве БВК: Дис.... канд. техн. наук. Л.: Ленинградский технологический ин-т, 1992. 204 с.

9. Ganin P.G., Yakovlev V.I. Batch fermentation using Candida maltosa non-02-limited under different initial concentrations of и-hydrocarbons // Proc. of the 1-st Intern. Scient. Conf. "Modern Problems of Organic Chemistry, Ecology and Biotechnology". Euga, St. Petersburg region, Russia, June 2001. Luga: University of Luga, 2001. P. 140-142.

10. Петрикевич С.Б., Довгун Л.И. Ультраструктура дрожжей С. tropicalis при их выращивании на «-алканах: выявление внутриклеточного парафина // Микробиология. 1980. Т. 49, № 1. С. 78-81.

11. Гарбалинский В.А., Винаров А.Ю., Волх В.Я. Влияние индивидуального состава «-алканов субстрата на основные показатели процесса выращивания дрожжей // Прикл. биохимия и микробиология. 1976. Т. 12, № 6. С. 850-854.

12. Галынкин В.А., Пушкарев А.А., Ганин П.Г. и др. А.С. 1396600 СССР, МКИ С 12 N 1/26. Способ получения биомассы дрожжей. N° 3954693; Заявл. 18.09.85 (ДСП).

13. Ganin P.G., \akovlev V.I. Non-02-limited batch и-hydrocarbon fermentation using Candida maltosa //

Proc. of the 1-st Intern. Scient. Conf. "Modern Problems of Organic Chemistry, Ecology and Biotechnology". Luga, St. Petersburg region, Russia, June 2001. Luga: University of Luga, 2001. P. 137—139.

14. Ленинджер А. Биохимия. M.: Мир, 1974. 958 с.

15. Moo-Young M., Shimizu T. Hydrocarbon fermentation using Candida Lipolitica. 11: A model for cell growth kinetics 11 Biotech. Bioeng. 1971. Vol. 12, № 6. P. 761-778.

16. Кантере B.M., Лалов В.В., Ефремов Ю.В., Ракитин В.Ю. К вопросу о механизме потребления жидких углеводородов микроорганизмами // Микробиологическая промышленность. 1972. № 4. С. 1-8.

17. Yoshida Е., \amane Т. Continuous hydrocarbon fermentation with colloidal emulsion feed. A kinetic model for two-liquid phase culture // Biotech. Bioeng. 1974. Vol. 16, № 5. P. 635-657.

18. Еанин П.Е. Теоретическая оценка устойчивости адсорбционного взаимодействия частиц твердой и жидкой дисперсных фаз в аппарате с перемешиванием // Сорбционные и хроматог-рафические процессы. 2006. Т. 6, N° 3. С. 486-497.

19. Еанин П.Е. Адсорбционное взаимодействие частиц твердой и жидкой дисперсных фаз в аппарате с перемешиванием. Теоретическая оценка вероятности дробления и устойчивости взаимодействия частиц в одном испытании // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т. 7, № 3. С. 444-455.

20. Еанин П.Е. Адсорбционное взаимодействие частиц твердой и жидкой дисперсных фаз в аппарате с перемешиванием. Теоретическая оценка вероятности устойчивости взаимодействия частиц за время их пребывания в зонах аппарата // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т. 7, № 4. С. 618-630.

21. Комаров Е.В., Еанин П.Е. ^-Потенциал капель эмульсии «-алканов и его роль в транспорте субстрата в клетки дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40, N° 3. С. 323-331.

22. Мусил Я., Повакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах. М.: Мир, 1984. 216 с.

23. Кларксон Д. Транспорт ионов и структура растительной клетки. М.: Мир, 1978. 368 с.

24. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекис-ное окисление липидов. М.: Наука, 1972. 252 с.

25. Скулачев В.П. Биоэнергетика. М.: Высшая школа. 1989. 271 с.

26. Карасевич Ю.Н. Экспериментальная адаптация микроорганизмов. М.: Наука, 1975. 178 с.

27. Иванов В.Н., Угодчиков Е.А. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. Киев: Наукова Думка, 1984. 280 с.

28. Ильченко А.П. Сравнительное изучение окисления глюкозы и гексадекана в клетках дрожжей. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Пущино: Ин-т биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, 1982. 16 с.

29. Hiroco N., Katsuoki S., Minoru N. et al. Importance of Fe2+-ATF and the relative uniportance of OH in the metabolism of mitomijcin e-induced lipid peroxidation // Biochem. Biophys. Acta. Lipids and Lipid Metab. 1984. Vol. 796 (L71), № 3. P. 285-293.

30. Панкова Л.Н., Швинка Ю.Э., Бекер M.E., Слава Э.Э. Влияние аэрации на метаболизм Zumo-monas mobilis И Микробиология. 1985. Т. 54, N° 1. С. 140-145.

31. Лозинов А.Б. Влияние концентрации кислорода в среде на рост и окислительный обмен веществ микроорганизмов // Проблемы биохимии и физиологии микроорганизмов. Матер, межд. конф. Пущино: Наука, 1986. С. 13—25.

УДК 537.632.4/577.322

Е.Б. Шадрин, A.B. Ильинский, В.М. Капралова, В.О. Самойлов

МАГНИТНОЕ ВРАЩЕНИЕ ПЛОСКОСТИ ПОЛЯРИЗАЦИИ СВЕТА, РАССЕЯННОГО ВЗВЕСЬЮ ЭРИТРОЦИТОВ

Работа посвящена изучению магнитных свойств взвеси эритроцитов, выделенных из цельной крови путем центрифугирования. Эритроциты имеют форму двояковогнутого диска диаметром 7,5 мкм и толщиной на периферии 2,5 мкм,

в центре — 1,5 мкм. Эритроциты, взвешенные в жидкой плазме, которая представляет собой в основном физиологический раствор, собираются в эритроцитарные агрегаты — сверхструктуры в виде "монетных столбиков" или тороидов. Об-