Гиперметилированные гены микроРНК как потенциальные маркеры светлоклеточного рака почки Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

RUSSIAN CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS. 2017; 62(1) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-1-13-18

ВЮСНЕМ^У

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.61-006.04-07:575.08

Береснева Е.В.1, Логинов В.И.23, Ходырев Д.С.4, Пронина И.В.23, Казубская Т.П.5, Карпухин А.В.3, Брага Э.А.23, Кушлинский Н.Е.5

ГИПЕРМЕТИЛИРОВАННЫЕ ГЕНЫ МИКРОРНК КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ МАРКЕРЫ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОГО РАКА ПОЧКИ

Тосударственный научный центр Российской Федерации ФГУП «Государственный НИИ генетики и селекции

промышленных микроорганизмов», 117545, Москва;

2ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии», 125315, Москва;

3ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», 115478, Москва;

4ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий» ФМБА, 115682, Москва;

5ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478, Москва

Светлоклеточный рак почки (скПКР) характеризуется высокой частотой летальных исходов, и в первый год после постановки диагноза летальность составляет 16%. Отсутствие эффективной диагностики в ранних стадиях (30% случаев скПКР обнаруживается в поздних стадиях при наличии метастазирования) указывает на необходимость поиска новых биомаркеров скПКР. Нарушения в метилировании регуляторных генов микроРНК являются одной из причин развития опухоли. Цель данной работы — выявление гиперметилированных генов микроРНК при скПКР и оценка их диагностических и прогностических характеристик. Определение статуса метилирования генов микроРНК в образцах ДНК из опухоли и неизмененной ткани 50 больных скПКР проводили с помощью бисульфитной конверсии ДНК и последующей метилспецифичной ПЦР. Показано частое гиперметилирование 7 генов микроРНК (miR-9-1/3, miR-124a-l/2/3, miR-34b/c, miR-129-2) в опухолях скПКР. Из 7 исследованных генов микроРНК составлены системы маркеров по 2—4 гена в каждой. Чувствительность систем из 4маркеров по даннымROC-анализа достигает 88%, а специфичность — 94%% (AUC 0,83— 0,84). Кроме того, показано, что гиперметилирование 5 генов микроРНК (miR-9-1/3, miR-34b/c, miR-124a-3, miR-129-2) ассоциируется с параметрами прогрессии скПКР (стадия, размер опухоли, степень дифференцировки и метастазиро-вание в лимфатические узлы или удаленные органы). Из генов, гиперметилирование которых связано с метастазирова-нием (miR-129-2, miR-9-3, miR-124a-3), составлены и охарактеризованы 5 прогностических систем маркеров. Гиперметилирование гена miR-129-2 — новый эффективный маркер предсказания метастазирования (чувствительность 75% и специфичность 79%%, AUC 0,77), который можно сочетать с маркерами, выявленными в других исследованиях.

Ключевые слова: светлоклеточный рак почки; биомаркеры; ROC-анализ; микроРНК; метилирование ДНК. Для цитирования: БересневаЕ.В., Логинов В.И., Ходырев Д.С., ПронинаИ.В., Казубская Т.П., Карпухин А.В., Брага Э.А., Кушлинский Н.Е. Гиперметилированные гены микроРНК как потенциальные маркеры светлоклеточного рака почки. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62(1): 13-18. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-1-13-18

Beresneva E.V.1, Loginov V.I.2-3, Khodyrev D.S.4, Pronina I.V.23, Kazubskaya T.P.5, Karpukhin A.V.3, Braga E.A.23, Kushlinskii N.E.5

the hyper-methylated genes microrna as potential markers of clear-cell carcinoma of kidney

1The state research center of the Russian Federation "The state research institute of genetics and selection of industrial microorganisms', 117545 Moscow, Russia

2The research institute of general pathology and pathophysiology, 125315 Moscow, Russia 3The medical genetic research center, 115478 Moscow, Russia

4The Federal research clinical center of specialized types of medical care and medical technologies of the Federal medical biological agency of Russia, 115682 Moscow, Russia

5The N.N. Blokhin Russian oncologic research center of Minzdrav of Russia, 115478 Moscow, Russia

The clear-cell carcinoma of kidney is characterized by high rate of lethal outcomes. The lethality makes up to 16%% in the first year after disease was diagnosed. The absence of efficient diagnostic at early stages (30% of all cases of clear-cell carcinoma of kidney are found out at late stages if there is metastatic disease) indicates the necessity of.searching new biomarkers of clear-cell carcinoma of kidney. The disorders in methylation of regulatory genes of micro-RNA are one the causes of development of tumor. The purpose of the present study is to discover hyper-methylated genes of micro-RNA under clear-cell carcinoma of kidney and to evaluate their diagnostic and prognostic characteristics. The establishment of status of methylation of genes of micro-RNA in samples of DNA from tumor and unaltered tissue of 50 patients with clear-cell carcinoma of kidney was implemented using bisulfite conversion of DNA and subsequent methyl-specific polymerase chain reaction. The frequent hyper-methylation of seven genes ofmicro-RNA (miR-9-1/3, miR-124a-1/2/3, miR-34b/c, miR-129-2) in tumors of clear-cell carcinoma of kidney. Out of 7 analyzed genes of micro-RNA the systems of markers on 2-4 genes in each one were compiled. According ROC-analysis, the sensitivity of 4 markers systems reaches 88%, specificity - 94%% (AUC 0.83-0.84). Furthermore, it is demonstrated that hyper-methylation of 5 genes of micro-RNA (miR-9-1/3, miR-124a-1/2/3, miR-34b/c, miR-129-2) is associated with parameters ofprogression of clear-cell carcinoma of kidney (stage, size of tumor, degree of differentiation, metastasis in lymph nodes on remote organs). Out of genes which hyper-methylation is associated with metastasis disease (miR-9-1/3, miR-124a-1/2/3, miR-34b/c, miR-129-2) 5 prognostic systems of markers were compiled and characterized. The hyper-methylation of gene miR-129-2 is a new efficient marker of prognosis of metastasis disease (sensitivity 75% and specificity 79%, AUC 0.77) that can be combined with markers discovered in other studies.

Keywords: clear-cell carcinoma of kidney; biomarkers; ROC-analysis; micro-RNA; DNA methylation.

Для корреспонденции: Брага Элеонора Александровна, д-р биол. наук, проф., зав. лаб. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, e-mail: [email protected]

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2017; 62(1) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-1-13-18

БИОХИМИЯ

For citation: BeresnevaE.V., Loginov V.I., KhodyrevD.S., ProninaI.V., Kazubskaya T.P., KarpukhinA.V., BragaE.A., Kushlinskii N.E. The hyper-methylated genes microRNA as potential markers of clear-cell carcinoma of kidney. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (1): 13-18. (in Russ.). DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0869-2084-2017-62-1-13-18

For correspondence: Braga E.A., doctor of biological sciences, professor, head of the laboratory. e-mail: eleonora10_45@ mail.ru

Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.

Acknowledgment. The study was implemented within the framework of .state research theme of the research institute of general pathology and pathophysiology (0520-2014-0030) and funded by the Federal Agency of Scientific Organizations

Received 18.07.2016 Accepted 01.08.2016

Введение. Почечно-клеточный рак (ПКР) является третьим по распространенности урологическим заболеванием и составляет 2—3% всех некожных злокачественных новообразований у взрослых обоих полов [1]. ПКР включает группу гистологически различных видов рака, таких как светло-клеточный, папиллярный и хромофобный рак почки. При этом светлоклеточный рак почки (скПКР) является самым распространенным из всех видов ПКР [2]. СкПКР в ранних стадиях не имеет клинических проявлений, поэтому обнаружение этого заболевания происходит случайно визуальным методом, а на этапе диагностики 30% всех случаев скПКР уже имеют метастазирование [3]. В 2015 г. в России доля случаев скПКР с летальным исходом в течение года после постановки диагноза составила 16% [4]. При этом в качестве терапии локализованного заболевания скПКР в настоящее время остаются частичная или тотальная нефрэктомия [5]. Отсутствие эффективной диагностики в ранних стадиях заболевания и высокая частота летальных исходов указывают на необходимость поиска новых биомаркеров скПКР.

Нарушения в метилировании регуляторных генов являются одной из причин развития опухоли [6]. Так, при раке легкого наблюдали повышенное метилирование промоторов двух генов (О6-метилгуанин-ДНК метилтрансферазы и белка-супрессора p16) за 3 года до постановки диагноза рака легкого [7]. Гены микроРНК подвержены метилированию в несколько раз чаще, чем кодирующие белок гены [8]. Из литературы известно о связи степени метилирования генов ми-кроРНК с их экспрессией при различных видах рака. Например, гиперметилирование miR-34b/c вызывало подавление экспрессии этого гена при раке ротовой полости, кишечника, яичников и лейкозе [9], а гиперметилирование гена miR-9 понижало его экспрессию при скПКР [10].

Нами ранее выявлено гиперметилирование ряда генов микроРНК при раке легкого и почки [11, 12]. Цель настоящего исследования — оценка диагностических и прогностических характеристик гиперметилированных генов микроРНК при скПКР.

Материал и методы. Образцы опухолей скПКР собраны и клинически охарактеризованы в НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина». Анализировали парные образцы опухоли и гистологически неизмененной ткани почки, полученные от 50 больных скПКР. Отбор образцов проводили, как было описано ранее [12]. Высокомолекулярную ДНК выделяли из ткани по стандартной методике.

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан», получено разрешение этического комитета РОНЦ им. Н.Н. Блохина, а также информированное согласие больных.

Бисульфитную конверсию ДНК и метилспецифичную ПЦР (МС-ПЦР) проводили, как описано ранее [12].

Статистический анализ выполняли с применением точного критерия Фишера в программе Attestat. Изменения считали значимыми при p < 0,05.

Оптимальные системы маркеров выбирали на основании критерия Йодена по результатам ГОС-анализа, проведенного с помощью ресурса http://www.biosoft.hacettepe.edu.tr/ easyROC/, который позволил вычислить диагностические параметры: площадь под ГОС-кривой (АиС), оптимальный критерий отсечения, чувствительность, специфичность, положительное и отрицательное предсказательные значения. Для системы из одного гена-маркера чувствительность определяли как долю образцов из опухоли, в которых данный ген метилирован, а специфичность — как долю неметилирован-ных образцов из нормальной ткани (табл. 1).

Результаты. Профиль гиперметилирования генов микроРНК при скПКР и системы маркеров для диагностики скПКР. В данном исследовании представлены результаты анализа метилирования генов 7 микроРНК miR-9-1, 9-3, 34Ь/с, 124а-1,124а-2, 124а-3 и 129-2 при скПКР при помощи МС-ПЦР. В табл. 1 показан статус метилирования этих генов в образцах опухолевой и гистологически неизмененной (условно-нормальной) ткани почки от 50 пациентов.

Частота гиперметилирования этих генов в образцах опухолей составила 40—60% (табл. 2). Отмечена высокая достоверность различий частот гиперметилирования в опухолевой и гистологически неизмененной ткани пациентов (р составляло 10-3—10-5). Как видно из табл. 2, все изученные нами гены имеют высокую частоту гиперметилирования в опухолевой ткани и полное отсутствие метилирования в ткани «доноров» (за исключением miR-124a-2 — 1 случай на 5 доноров).

На основании полученных результатов гиперметилирования 7 генов микроРНК при скПКР нами составлены потенциальные диагностические системы маркеров для выявления скПКР (табл. 3). Из всевозможных наборов генов самые высокие значения суммы чувствительности и специфичности соответствовали системам, в которые вошли гены miR 9-1, 124а-3 и 129-2 (см. табл. 3). Примечательно, что для первых двух генов наблюдали 7-кратное, а для miR 129-2 — 19-кратное увеличение частоты метилирования в опухоли по сравнению с условно-нормальной тканью; при этом полностью отсутствовало гиперметилирование этих генов в образцах ДНК «доноров» (см. табл. 2).

Наилучшей (по значению критерия Йодена) системой из 1 гена является система на основе гена miR 129-2: она характеризуется очень высоким значением специфичности — 98% (т. е. в 49 образцах условно-нормальной ткани этот ген не-метилирован), однако ее чувствительность оказалась крайне низкой — 38% (т. е. в 19 образцах опухолевой ткани этот ген метилирован); значение АиС составило 0,68. Аналогично этому для наилучшей (по критерию Йодена) системы из 2 генов (miR 9-1 и 124а-3) специфичность составила 90%, чувствительность — 66% (см. табл. 3). При анализе систем из 3 генов мы выделили 2 системы, являющиеся наилучшими по критерию Йодена: систему № 2 (miR 9-1, 9-3, 124а-3) со значениями специфичности 80% и чувствительности 80%, а также систему № 3 (miR 9-1, 124а-3, 129-2), которая харак-

biochemistry

Таблица 1

Метилирование 7 генов микроРНК в образцах ДНК 50 больных скПКР

№ 124a-1 124a-2 124a-3 9-1 9-3 34b/c 129-2 TNM 124a-1 124a-2 124a-3 9-1 9-3 34b/c 129-2

1 + + + + — + — T1N0M0 + — — — — + —

2 — + — — — + — T1N0M0 + — + — — + —

3 + + + + + — — T1N0M0 — — — — — + —

4 — + + — + + — T1N0M0 — — — — — + —

5 — + + — — — — T1N0M0 + — — + — + —

6 + — — + — — — T1N0M0 — + — — — + —

7 — — + — + + — T1N0M0 — + — — — — —

8 + — — — + + — T1N0M0 — — — — — — —

9 + — — — + + — T1N0M0 — — — — — + —

10 — — — — — + — T1N0M0 — — — — + — —

11 — + — — — — — T1N0M0 — — — — + — —

12 — + — — — — — T1N0M0 — + — — — — —

13 — + — + — — — T1N0M0 — — — — — — —

14 — + — + — — — T1N0M0 — — — — — — —

15 + + — — + — + T1N0M0 — — — — — — —

16 + + T2N0M0 + — — — — + —

17 + T2N0M0 — + + — + + —

18 + + — — + + — T2N0M0 — — — — — — —

19 — — — + — — — T2N0M0 + — — — + — —

20 + — + — — + — T2N0M0 — — — — — — —

21 — — — — — + — T2N0M0 — — — — — — —

22 T2N0M0 — — — + + — —

23 + — + + + + + T2N0M0 — — — — — — —

24 T2N0M0 — — — — — — —

25 — + + — — — + T2N0M0 — — — — — — —

26 — + — + — — + T2N0M0 — — — — — — —

27 + — + — — + + T1N1M0 + + — — — — —

28 + — + + + + + T3N1M0 + — — — — — —

29 — + + + + + + T3N1M0 + — — — — — +

30 + — — — + + + T3N1M0 — + — — — — —

31 + — + — — + + T1N1M0 — + — — + + —

32 + + — — + + — T3N0M0 — — — — — — —

33 + + — + — — — T3N0M0 — — — — — — —

34 — + — — — — — T3N1M0 — — — — + — —

35 + + + + + + + T3N1M0 — — — — — — —

36 + + + — — + + T3N0M0 — — — — — — —

37 — + + — — + + T3N0M0 — — — — — — —

38 + + — + — + + T2N1M0 — — — — — — —

39 + + — + — + — T3N0M0 — — — — — — —

40 — + — + — + — T3N0M0 — — — — — — —

41 — — — + + + + T3N0M0 — + — — — — —

42 — + + — + — — T1N1M0 — + — — — — —

43 — + — + + + — T3N1M0 — — — — — — —

44 + — + + — — — T3N0M0 — — — — — — —

45 + — + — + + + T3N0M1 — — — — — — —

46 + — — + + + + T3N2M0 — — — — — — —

47 — + + + + — + T4N2M1 + — — — — + —

48 — + — — + + — T3N0M1 — + + + — — —

49 + + + + + + + T2N1M1 — — — — — — —

50 — + + — — — — T2N2M0 — — — — — — —

П р и м е ч а н и е. Слева приведены номера пациентов и данные для образцов ДНК из опухолей, справа — для образцов условно-нормальной ткани; + соответствует наличию метилированного аллеля в образце ДНК ткани данного пациента; — соответствует отсутствию метилирования. По центру приведена ТКМ-классификация опухоли.

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2017; 62(1) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-1-13-18

БИОХИМИЯ

Таблица 2

Частота метилирования 7 генов микроРНК при скПКР

Ген микроРНК p* Опухолевая ткань, n (%) Условно-нормальная ткань, n (%) Ткань почки «доноров», n (%)

miR-9-l 3,6*10-5 21/50 (42) 3/50 (6) 0/5 (0)

miR-9-3 0,0033 21/50 (42) 7/50 (14) 0/5 (0)

miR-34b/c 0,00027 29/50 (58) 11/50 (22) 0/5 (0)

miR-124a-1 0,0026 25/50 (50) 9/50 (18) 0/5 (0)

miR-124a-2 8,3*10-5 30/50 (60) 10/50 (20) 1/5 (20)

miR-124a-3 3,6-10-5 21/50 (42) 3/50 (6) 0/5 (0)

miR-129-2 3-10-6 19/50 (38) 1/50 (2) 0/5 (0)

Примечание. Условно-нормальной ткани соответствует гистологически неизмененная ткань пациентов. «Доноры» соответствуют постмортальным лицам без онкопатологии в анамнезе. Указаны процент и доля образцов, в которых данный ген микроРНК метилирован от общего количества образцов (п = 50). Здесь и в табл. 4: статистически значимые величины р даны жирным шрифтом.

теризуется высоким значением специфичности — 88% (чувствительность 72%). Среди систем из 4 генов с наибольшей суммой чувствительности и специфичности выбрана система № 7 (miR 9-1, 34Ь/с, 124а-3, 129-2), которая имеет наиболее высокие показатели АиС (0,84) и чувствительности (88%), а система № 5 (miR 9-3, 34Ь/с, 124а-2, 129-2) — наиболее высокую специфичность (94%).

Ассоциация метилирования с прогрессией скПКР и прогностические системы маркеров метастазирования. Профиль гиперметилирования 5 исследованных нами генов ассоциируется с клинико-гистологическими характеристиками опухолей, которые связаны с прогрессией скПКР (табл. 4). Так, гиперметилирование генов miR-129-2 и -9-1 ассоциируется с увеличенным размером опухоли, miR-34b/c и -129-2 — с более поздней стадией скПКР, miR-129-2 — с пониженной степенью дифференцировки клеток опухоли. Гиперметилирование 3 генов, miR-129-2, -9-3, и -124а-3, ассоциируется с появлением метастаз в лимфатических узлах и удаленных органах (см. табл. 4).

Мы исследовали возможность использования систем маркеров, основанных на гиперметилировании генов микроРНК, для прогнозирования метастазирования. Рассмотрены 3 гена (miR-9-3, -124а-3 и -129-2), частота гиперметилирования которых статистически значимо или маргинально значимо повышена при метастазировании (см. табл. 4). Оказалось, что среди систем из 1 гена наилучшими показателями обладает система на основе гена

Таблица 4

Ассоциация гиперметилирования генов микроРНК в образцах опухолевой ткани с клинико-гистологическими характеристика-

Показатель Ген микроРНК Клинико-гистологический показатель p

Размер опухоли miR-9-1 Т1 vs Т3/Т4 0,0922

miR-129-2 Т1 vs Т3/Т4 0,0354

Стадия рака miR-34b/c I+II vs III + IV 0,0475

miR-129-2 I+II vs III + IV 0,0028

Дифференцировка miR-129-2 нd + md vs ld 0,0045

Метастазирование miR-124a-3 N0/M0 vs N1-2/M1 0,0661

miR-9-3 N0/M0 vs N1-2/M1 0,0309

miR-129-2 N0/M0 vs N1-2/M1 0,0016

miR-129-2: значения чувствительности и специфичности составили 75 и 79% соответственно (табл. 5). Система из 2 генов, которая включает miR-129-2 и дополнительно miR-9-3, характеризуется повышением чувствительности до 94% и понижением специфичности до 59% по сравнению с системой из 1 гена. Система из 3 генов, связанных с метастазированием, показала 100% чувствительность и низкую специфичность (47%).

Обсуждение. Результаты гиперметилирования 7 изученных генов микроРНК (miR-9-1, 9-3, 34Ь/с, 124а-1, 124а-2, 124а-3 и 129-2), полученные в данной работе, указывают на онкосупрессорную функцию этих микроРНК при скПКР. Из 7 генов микроРНК, исследованных нами, ранее в литературе упоминалось гиперметилирование при скПКР только для четырех из них. Так, ранее при скПКР показано гиперметилирование гена miR-124a-3 [13, 14]; для генов miR-9-1 и miR-9-3 также отмечено гиперметилирование, ассоциированное с уменьшением экспрессии этих генов [10]. В работе [15] указано, что частота метилирования гена miR-34b/c достигает 100% при скПКР. Полученные нами данные для этих 4 генов хорошо согласуются с указанными результатами.

Известно, что онкосупрессорные свойства miR-9 проявляются подавлением ядерного фактора каппа-В и транскрипционных факторов РохО, и подавление этой микроРНК связано с ме-тастазированием [10], что согласуется с нашими результатами. МикроРНК miR-34b/c проявляет онкосупрессорные свойства путем подавления онкогенов с-МВТ и циклинзависимой киназы 4, как показано ранее при раке кишечника, а при эпителиальном

Таблица 3

Потенциально диагностические системы маркеров — генов микроРНК с наибольшей суммой чувствительности и специфичности

Система Набор генов микроРНК AUC (95% CI) Критерий отсечения Sen Sp PV NV

№ 1 9-1; 124а-3 0,78 (0,703—0,861) 1/2 0,660 0,900 0,868 0,726

№ 2 9-1; 9-3; 124а-3 0,81 (0,732—0,891) 1/3 0,800 0,800 0,800 0,800

№ 3 9-1; 124а-3; 129-2 0,81 (0,742—0,891) 1/3 0,720 0,880 0,857 0,759

№ 4 9-1; 124а-1; 124а-3; 129-2 0,83 (0,764—0,912) 1/4 0,840 0,760 0,778 0,826

№ 5 9-3; 34b/c; 124а-2; 129-2 0,83 (0,752—0,909) 2/4 0,660 0,940 0,917 0,734

№ 6 9-1; 9-3; 124а-3; 129-2 0,83 (0,762—0,910) 1/4 0,820 0,780 0,788 0,812

№ 7 9-1; 34b/c; 124а-3; 129-2 0,84 (0,778—0,920) 1/4 0,880 0,720 0,759 0,857

Примечание. Здесь и в табл. 5: показаны значения площади под кривой (AUC) в виде среднего и 95% доверительного интервала (95% Cl), оптимальный критерий отсечения, а также значения чувствительности (Sen) и специфичности (Sp), положительное (PV) и отрицательное (NV) предсказательные значения.

Таблица 5

Характеристики прогностических систем маркеров метастазирова-ния при скПКР

Система генов AUC (95% CI) Критерий отсечения Sen Sp PV NV

129-2 0,772 (0,712—0,936) 1/1 0,750 0,794 0,632 0,871

9-3; 129-2 0,824 (0,712—0,936) 1/2 0,938 0,588 0,517 0,952

124а-3; 129-2 0,783 (0,653—0,913) 1/2 0,875 0,588 0,500 0,909

9-3; 124а-3 0,745 (0,608—0,882) 1/2 0,875 0,500 0,452 0,895

9-3; 124а-3; 129-2 0,824 (0,715—0,933) 1/3 1,000 0,471 0,471 1,000

раке яичников miR-34b/c подавляет с-МЕТ и ингибирует пролиферацию, подвижность и инвазию клеток [9]. В литературе также упоминается ассоциация между статусом метилирования гена miR-124а-3 и размером опухоли скПКР [13]; однако в указанной работе не обнаружено связи с метастазированием. В нашем исследовании обнаружено маргинально значимое (р = 0,0661) различие в метилировании miR-124а-3 между образцами от пациентов с наличием и отсутствием метастазирования. Таким образом, из полученных нами данных можно заключить, что связь с наибольшим количеством клинических параметров скПКР проявляет ген тЖ-129-2. Связь гиперметилирования этого гена с метастазированием при скПКР показана нами впервые, и этот ген можно выделить как новый маркер прогноза ме-тастазирования при скПКР.

Основываясь на полученных результатах относительно профиля метилирования генов микроРНК, мы составили различные системы маркеров скПКР. Отобранные нами маркеры (преимущественно гены miR 9-1, 124а-3 и 129-2) и системы маркеров (№ 1—3) позволяют выявлять скПКР с чувствительностью до 80% и специфичностью до 90%. Из генов, гиперметилирование которых связано с метастазированием (miR-129-2, miR-9-3, miR-124a-3), нами составлены и охарактеризованы 3 прогностические системы маркеров. Ранее в литературе не упоминались такие системы маркеров, основанные на гиперметилировании генов микроРНК. Описаны лишь системы, основанные на измерении уровня экспрессии микроРНК, которые позволяют выявлять опухолевые клетки, в том числе при анализе сыворотки крови пациентов. Так, в работе [16] показано, что система из т1Я-378 и т1Я-451, исследованная на выборке из 90 образцов, позволяет выявлять рак почки с чувствительностью 81% и специфичностью 83% (АиС 0,860), а система из miR-193a-3p, -362, -572, -28-5р и -378, исследованная на выборке из 79 образцов, характеризуется значением АиС, равным 0,796 (95% С1: 0,724—0,867) [17]. В некоторых исследованиях приводятся системы, состоящие только из 1 микроРНК: miR-210 позволяет выявлять скПКР с чувствительностью 81% и специфичностью 79,4% (АиС 0,874), что показано на выборке из 132 образцов [18], а miR-451 — с чувствительностью 81% и специфичностью 77% (АиС 0,77; на выборке из 125 образцов) [16].

Из полученных нами результатов следует, что гиперметилирование генов микроРНК может быть основой для эффективной системы биомаркеров для диагностики рака почки. Гиперметилирование гена miR-129-2 — новый эффективный маркер предсказания метастазирования (чувствительность 75% и специфичность 79%, АиС 0,77), ко-

biochemistry

торый можно сочетать с маркерами, выявленными в других исследованиях.

Финансирование. Исследование выполнено в рамках плановой темы ФГБНУ «НИИОПП» (0520-2014-0030) и финансировано Федеральным агентством научных организаций (ФАНО).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1—3, 5—10, 13—18 см. REFERENCES)

4. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В., ред. Состояние онкологической помощи населению России в 2015 году. М.: МНИ-ОИ имени П.А. Герцена — филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России; 2016.

11. Рыков С.В., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. Новые гены микроРНК, подверженные метилированию в опухолях легкого. Генетика. 2013; 49(7): 896—901.

12. Береснева Е.В., Рыков С.В., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Ермилова В.Д., Казубская Т.П. и др. Профиль метилирования группы генов микроРНК при светлоклеточном почечноклеточном раке; связь с прогрессией рака. Генетика. 2013; 49(3): 366—75.

REFERENCES

1. Randall J.M., Millard F., Kurzrock R. Molecular aberrations, targeted therapy, and renal cell carcinoma: current state-of-the-art. Cancer Metastasis Rev. 2014; 33(4): 1109—24.

2. Rini B.I., Campbell S.C., Escudier B. Renal cell carcinoma. Lancet (London, England). 2009; 373(9669): 1119—32.

3. Gupta K., Miller J.D., Li J.Z., Russell M.W., Charbonneau C. Epidemiologic and socioeconomic burden of metastatic renal cell carcinoma (mRCC): a literature review. Cancer Treat. Rev. 2008; 34(3): 193—205.

4. Kaprin A.D., Starinskiy V.V., Petrova G.V., eds. State of the Oncological Care in Russia in 2015 [Sostoyanie onkologicheskoy pomoshchi naseleniyu Rossii v 2015 godu]. Moscow: MNIOI imeni P.A. Gertsena — filial FGBU «NMIRTs» Minzdrava Rossii; 2016. (in Russian)

5. Jonasch E., Gao J., Rathmell W.K. Renal cell carcinoma. BMJ. 2014; 349: g4797.

6. Mack S.C., Hubert C.G., Miller T.E., Taylor M.D., Rich J.N. An epigenetic gateway to brain tumor cell identity. Nat. Neurosci. 2016; 19(1): 10—9.

7. Palmisano W.A., Divine K.K., Saccomanno G., Gilliland F.D., Baylin S.B., Herman J.G. et al. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res. 2000; 60(21): 5954—8.

8. Vrba L., Muñoz-Rodríguez J.L., Stampfer M.R., Futscher B.W. miRNA gene promoters are frequent targets of aberrant DNA methylation in human breast cancer. PLoS One. 2013; 8(1): e54398.

9. Wong K.Y., Yu L., Chim C.S. DNA methylation of tumor suppressor miRNA genes: a lesson from the miR-34 family. Epigenomics. 2011; 3(1): 83—92.

10. Hildebrandt M.A., Gu J., Lin J., Ye Y., Tan W., Tamboli P. et al. Hsa-miR-9 methylation status is associated with cancer development and metastatic recurrence in patients with clear cell renal cell carcinoma. Oncogene. 2010; 29(42): 5724—8.

11. Rykov S.V., Khodyrev D.S., Pronina I.V., Kazubskaya T.P., Loginov V.I., Braga E.A. Novel miRNA genes methylated in lung tumors. Genetika. 2013; 49(7): 782—6. (in Russian)

12. Beresneva E.V., Rykov S.V., Khodyrev D.S., Pronina I.V., Ermilova V.D., Kazubskaya T.P. et al. Methylation profile of group of miRNA genes in clear cell renal cell carcinoma; involvement in cancer progression. Genetika. 2013; 49(3): 320—8. (in Russian)

13. Gebauer K., Peters I., Dubrowinskaja N., Hennenlotter J., Abbas M., Scherer R. et al. Hsa-mir-124-3 CpG island methylation is associated with advanced tumours and disease recurrence of patients with clear cell renal cell carcinoma. Br. J. Cancer. 2013; 108(1): 131—8.

14. Peters I., Dubrowinskaja N., Abbas M., Seidel C., Kogosov M., Scherer R. et al. DNA methylation biomarkers predict progression-

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2017; 62(1) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-1-18-24

ГЕМАТОЛОГИЯ

free and overall survival of metastatic renal cell cancer (mRCC) treated with antiangiogenic therapies. PLoS One. 2014; 9(3): e91440.

15. Vogt M., Munding J., Grüner M., Liffers S.T., Verdoodt В., Hauk J. et al. Frequent concomitant inactivation of miR-34a and miR-34b/c by CpG methylation in colorectal, pancreatic, mammary, ovarian, urothelial, and renal cell carcinomas and soft tissue sarcomas. VirchowsArch. 2011; 458(3): 313—22.

16. Redova M., Poprach A., Nekvindova J., Iliev R., Radova L., Lakomy R. et al. Circulating miR-378 and miR-451 in serum are potential biomarkers for renal cell carcinoma. J. Transl. Med. 2012; 10: 55.

17. Wang C., Hu J., Lu M., Gu H., Zhou X., Chen X. et al. A panel of five serum miRNAs as a potential diagnostic tool for early-stage renal cell carcinoma. Sci. Rep. 2015; 5: 7610.

18. Zhao A., Li G., Peoc'h M., Genin C., Gigante M. Serum miR-210 as a novel biomarker for molecular diagnosis of clear cell renal cell carcinoma. Exp. Mol. Pathol. 2013; 94(1): 115—20.

Поступила 18.07.16 Принята к печати 01.08.16

ГЕМАТОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 618.2-092:612.115]-074

Иванец Т.Ю., Кесслер Ю.В., Колодько В.Г.

РЕФЕРЕНСНЫЕ ИНТЕРВАЛЫ ДЛЯ ОСНОВНЫХ ПАРАМЕТРОВ КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КРОВИ В ДИНАМИКЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ С БЕРЕМЕННОСТЬю ПОСЛЕ ЭКО И ПЭ

ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава Российской Федерации, 117997, Москва

Представлены результаты обследования 1140 женщин со спонтанной одноплодной беременностью и 307 женщин с одноплодной беременностью, наступившей в результате проведения программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ). Пациентки были распределены на 6 подгрупп в зависимости от гестационного срока (4—8, 9—13, 14—20, 21—27, 28—34 и 35—40 нед). Исследовано 16 основных гематологических показателей. Референсные интервалы (2,5 и 97,5 персентили) для разных сроков физиологической беременности были вычислены согласно рекомендациям Международной Ассоциации клинической химии (IFSS) по статистической обработке референсных значений. Показано, что при оценке результатов клинического анализа крови у беременных женщин необходимо использовать специальные референсные интервалы. Сравнительный анализ гематологических показателей в динамике беременности у здоровых женщин и у пациенток программы ЭКО и ПЭ показал, что интерпретацию результатов обследования у обеих групп пациенток можно проводить с использованием референсных интервалов, полученных для спонтанной беременности. Исключение составили общее количество лейкоцитов и количество тромбоцитов в сроке 4—8 нед.

Ключевые слова: гематологические показатели; референсные интервалы; беременность; ЭКО.

Для цитирования: Иванец Т.Ю., Кесслер Ю.В., Колодько В.Г. Референсные интервалы для основных параметров клинического анализа крови в динамике физиологической беременности. Сравнительный анализ с беременностью после ЭКО и ПЭ. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (1):18-24 DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-1-18-24 Ivanetz T.Yu., Kessler Yu.V., Kolodko V.G.

THE REFERENCE RANGES FOR MIN PARAMETERS OF CLINICAL BLOOD ANALYSIS IN DYNAMICS OF PHYSIOLOGICAL PREGNANCY A COMPARATIVE ANALYSIS WITH PREGNANCY AFTER EXTRA CORPORAL FERTILIZATION AND EMBRYO TRANSFER INTO UTERINE CAVITY

The academician V.I. Kulakov research center of obstetrics, gynecology and perinatology of Minzdrav of Russia, 117997 Moscow, Russia

The article presents the results of examination of 1140 women with .spontaneous monocyesis occurred and 307 women with monocyesis occurred as a result of implementation ofprogram of extra-corporeal fertilization and transfer of embryos into uterus. The female patients were distributed to 6 subgroups depending on gestation period (4-8, 9-134, 14-20, 21-27, 28-34, 35-40 weeks). The 16 main hematologic indices were analyzed. The reference intervals (2.5 and 97.5 percentiles) for various periods of physiological pregnancy were calculated according IFSS guidelines concerning statistical processing of reference values. It is demonstrated that at evaluation of results of clinical analysis of blood in pregnant women it is necessary to apply special reference intervals. The comparative analysis of hematologic indices in dynamics of pregnancy of healthy women and in female patients of the program of extra-corporeal fertilization and transfer of embryos into uterus demonstrated that interpretation of results of

Для корреспонденции: Иванец Татьяна Юрьевна, канд. мед. наук, зав. лаб., e-mail: [email protected]