CC BY
29
УДК 577.151.042
В.О. Пустыльняк, А.Н. Ширшова, Л.Ф. Гуляева, В.И. Каледин, В.П. Николин, Г.И. Каурова, В.А. Маталин, А. Г. Шмаков,
В.М. Шварцберг, О.П. Коробейничев
ГИПЕРИНДУКЦИЯ CYP2В И CYP2С ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ПРОДУКТАМИ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ФТОРИРОВАНИЯ ТРИБУТИЛФОСФАТА
ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск ФГУП РНЦ «Прикладная химия», Санкт-Петербург Институт химической кинетики и горения СО РАН, Новосибирск
В работе изучалась индукция цитохромов Р450 1а, 2Ь и 2с подсемейств под действием нового перфторированного соединения (TBF) в зависимости от дозы и времени действия препарата. Показано, что TBF значительно увеличивает специфичные активности, ассоциированные с Сур2Ь и Сур2с в печени мышей и практически не влияет на специфичные активности для Сур1а. Результаты мультиплексной ОТ-ПЦР показали, что после введения TBF относительный уровень мРНК генов Сур2Ь в печени мышей увеличился в 7,5 раза. Таким образом, полученные нами результаты дают возможность полагать, что препарат TBF является новым индуктором Сур2Ь в печени мышей и что его индуцирующий эффект реализуется на уровне транскрипции генов Сур2Ь.
Ключевые слова: цитохромы Р450, индукция, Сур2Ь
Введение
С каждым годом увеличивается число вредных факторов, влияющих на организм животных и человека. К таким факторам, прежде всего, относятся отходы производства, пестициды, пищевые добавки, лекарственные препараты и множество других химических соединений. Для предупреждения возможных угрожающих последствий воздействия химических соединений на живые организмы необходима информация об их токсикологических эффектах.
Печень считается основным органом, вовлеченным в биотрансформацию химических соединений различной структуры как эндогенного, так и экзогенного происхождения. Основной системой, ответственной за метаболизм ксенобиотиков в печени, является микросомальная монооксиге-назная система, одним из ключевых компонентов которой является цитохром Р450. Важнейшими свойствами CYP являются множественность его молекулярных форм и их индуцибельность
[3]. Эти два свойства взаимосвязаны, поскольку именно использование разных индукторов привело к выявлению разных форм цитохрома Р450.
При токсикологическом изучении новых пер-фторированных соединений, созданных в лаборатории фторирования ФГУП РНЦ «Прикладная
химия», мы обратили внимание на необычные свойства препарата, полученного при электрохимическом фторировании трибутилфосфата. Работая на мышах, мы заметили, что после однократного внутрижелудочного введения его в субтоксичной дозе у животных прогрессивно увеличивается печень, достигая максимума (более 300% от нормы) через неделю и держась на таком уровне, постепенно уменьшаясь, в течение месяца и более. Поскольку гепатомегалия является макроскопическим проявлением действия индукторов цитохром Р450-зависимой монооксиге-назной системы печени, таких, как фенобарбитал, пролифераторы пероксисом, полициклические углеводороды, полихлорированные бифенилы и др., и поскольку некоторые фторированные углеводороды также обладают индуцирующей способностью [11], мы предположили, что и испытываемый нами препарат является индуктором этих ферментов, причем, судя по динамике и величине вызываемого им увеличения массы печени, весьма эффективным. В настоящей работе представлены результаты проверки этого предположения, показавшие, что данный препарат, обозначаемый далее как ТВ^ практически не влияя на активность цитохрома Р450 1А (Сур1а), в десятки раз и в течение длительного времени увеличивает в
печени мышей активность ферментов, ассоциированных с Сур2Ь и Сур2с, т. е. является мощным индуктором фенобарбиталового типа.
Методы исследования
Реактивы
Использованный в работе препарат TBF получен электрохимическим фторированием трибу-тилфосфата. Электрохимическое фторирование проводили в среде жидкого безводного фтористого водорода на никелевых анодах. Основные параметры фторирования: объем электролизера — 4 литра, площадь анодов — 3300 см2, плотность тока
— 0,015 А/см2, нагрузка 50 А, начальная концентрация трибутилфосфата — 10% (400 г, 391,6 мл). Каждый час проводили корректировку электролита трибутилфосфатом, количество которого рассчитывали по уравнению электрохимического фторирования трибутилфосфата (расходный коэффициент 0,171 г/Ач). Время электролиза составило 137,5 часа, пропущенное количество электричества — 6876 Ач, получено сырца 105,5 г.
Экспериментальные животные
В работе использованы 10-недельные беспородные самцы весом 27-30 г и самки мышей линии C57BL/6 весом 18-22 г. Животные были получены из питомника ИЦиГ СО РАН и содержались группами по 4-6 особей в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище (комбикорм ПК120-1, «Лабораторснаб», Москва). Эксперименты на животных проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755). Необходимое количество препарата TBF перед использованием эмульгировали в воде и вводили мышам однократно через зонд в желудок в объеме 1 мл на 100 г массы тела. LD50 определяли на беспородных мышах методом наименьших квадратов с использованием пробит-анализа. В опытах с индукцией ферментов использовали мышей линии C57BL, являющейся тесторной при изучении индукции микросомальных ферментов. Для индукции ферментов препарат TBF вводили в дозах 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 и 1,5 мл/кг, что соответствует примерно 6, 12, 23, 45 и 68% от LD50, которая была найдена равной 2,2 мл/кг. В качестве контрольных использовали интактных животных. На 9-е сутки после введения возрастающих доз препарата и через 1, 3, 6, 9, 13, 17 и 93 сут. после его введения в максимальной дозе (1,5 мл/кг) животных умерщвляли декапитацией, извлекали печень и по отношению массы печени к массе тела рассчитывали печеночный индекс (масса печени /масса животного х 100%). Гепатотоксичность препарата TBF и фенобарбитала оценивали по увеличению
в сыворотке крови мышей активности аланин- и аспартатаминотрансферазы, которую определяли с помощью наборов АЛТ-НОВО и АСТ-НОВО (ЗАО «Вектор-Бест», п. Кольцово Новосибирской обл.).
Определение ферментативных
активностей CYP
После взвешивания печени 1 г ее ткани гомогенизировали в 3 мл 1,15% раствора KCl и общепринятым методом дифференциального центрифугирования получали микросомальную фракцию. Концентрацию белка в ней определяли по методу Лоури [10]. Активность разных форм цитохрома Р450 определяли спектрофлюориметрическим методом [2] по скорости О-деалкилирования их высокоспецифичных субстратов 7-метокси- и 7-этоксирезоруфина (CYP1A), 7-пентокси- и 7-бензилоксирезоруфина (CYP2B и CYP2B/2C соответственно).
Выделение РНК и получение кДНК
Суммарную РНК выделяли из печени животных с использованием TRIZOL Reagent (Life Technologies, США) согласно инструкции производителя. Для получения кДНК использовали по 1 мкг суммарной РНК. Обратную транскрипцию проводили 1 ч при 42 °С в реакционном объеме 25 мкл, куда входили следующие компоненты: 5 мкМ oligo(dT)17, 1-кратный буфер для РНК-зависимой ДНК-полимеразы, 10 мМ DDT, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфа-ты (каждый) и 200 ед. акт. M-MLV РНК-зависи-мой ДНК-полимеразы («Promega», США).
Мультиплексная полимеразная цепная реакция
В реакции использовались следующие праймеры:
Cyp2b:
F- 5’-AAA GTC CCG TGG CAA CTT CC-3’;
Cyp2b:
R-5’-CAT CCC AAA GTC TCT CAT GG-3’;
Р-актин:
F-5’-ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA-3’,
Р-актин:
R-5’-CGG AAC CGC TCA TTG CC-3’.
Мультиплексную ПЦР [8] проводили в реакционном объеме 40 мкл. В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводилось выравнивание продуктов амплификации исследуемого гена, был выбран ген «домашнего хозяйства» р-актин. Каждая проба ПЦР содержала 2 мкл кДНК, 1-кратный буфер для ПЦР, 0,2 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (каждого), 20 пкМ праймеры для cyp2b и 2 ед. ак. Taq ДНК-полимеразы. Праймеры для амплификации р-актина (20 пкМ) были добавлены через несколько циклов. В наших условиях наиболее подходящее число циклов для сур2Ь — 26 , р-акти-
на — 25. Реакцию амплификации для генов cyp2b и в-актина проводили в следующих условиях: 95 °C — 1 мин, 61 °C — 0,5 мин и 72 °C — 1 мин.
Продукты ПЦР разделяли в 2%-ном агарозном геле, окрашивали бромистым этидием (0,5 мкл/мл) и сканировали в УФ свете с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва). Денситометрию проводили с помощью компьютерной программы »Total Lab». Величину экспрессии каждого гена представляли в относительных еди-
• Самки линии C57BL 6
8
X
£
Рис. 1. Печеночные индексы у беспородных самцов и самок мышей линии C57BL в разные сроки после однократного внутрижелудочного введения препарата TBF в дозе 1,5 мл на 1 кг массы тела.
Приведены средние значения ± SD (п=3).
ницах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена сур2Ь к интенсивности полосы гена р-актина.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы 8ТАТ1БТ1СА. Для оценки достоверности различий между выборками использовали ^критерий Стьюдента. Все результаты представлены как среднее значение ± SD.
Результаты
На рис. 1 представлены значения печеночного индекса у беспородных самцов и самок мышей линии C57BL в разные сроки после однократного внутрижелудочного введения препарата ТВБ в дозе 1,5 мл на 1 кг массы тела. Видно, что, увеличившись на 1/3 через сутки, через неделю этот показатель был в три раза выше, чем в контроле, и держался на таком уровне, очевидно, более трех недель, поскольку даже через 13 недель был вдвое выше, чем у контрольных животных.
Для определения индуцирующей активности препарата в микросомах печени мышей линии С57ВЬбылиизмереныкаталитическиеактив-нос-ти метоксирезоруфин-О-деалкилазы (МРОД) и этоксирезоруфин-О-деалкилазы (ЭРОД), высокоспецифичных субстратов СУР1А и отражающих активность СУР2В и СУР2В/2С 7-пенток-сирезроуфин-О-деалкилазы (ПРОД) и 7-бен-
Рис. 2. Динамика специфичных активностей (пмоль/мин/мг микросомального белка) в зависимости от времени действия при однократном введении TBF в дозе 1,5 мл/кг массы животного. Приведены средние значения ± SD (п=9).
* Достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,01). А) МРОД, Б) ЭРОД, В) ПРОД, Г) БРОД.
Рис. 3. Эффекты разных доз препарата TBF на ПРОД (А) и БРОД (Б) активности в печени мышей.
Приведены средние значения ± SD (п=9). * Достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,01).
зилоксирезоруфин-О-деалкилазы (БРОД) соответственно. Как видно на рис. 2, активность МРОД и ЭРОД в печени у получавших препарат ТВБ подопытных мышей в течение всего времени наблюдения почти не отличалась от контроля, в то время как активность ПРОД и БРОД во много раз превышала уровень активности соответствующих ферментов у контрольных животных. При этом если активность ПРОД с течением времени после достижения максимума медленно снижалась параллельно снижению печеночного индекса животных, то активность БРОД держалась у них на максимальном уровне в течение всех 13 недель наблюдения. О большей по сравнению с ПРОД чувствительности БРОД к действию препарата свидетельствует и тот факт, что активность ПРОД на максимуме индукции увеличилась в 10 раз, тогда как активность БРОД
— в 17 раз (Рис. 2).
Поскольку сила индуктора определяется его эффективной дозой, в следующей серии экспериментов мы сравнили эффекты разных доз препарата TBF на ПРОД и БРОД активности в печени мышей. Животные были декапитированы и исследованы на 9-е сутки после введения препарата. Как видно на рис. 3, значительное (в 8,5 раза по сравнению с контролем) увеличение активности ПРОД имело место лишь при дозе препарата 1,5 мл/кг, причем при самых низких дозах (0,125-0,5 мл/кг) вообще какого-либо увеличения активности фермента не наблюдалось. Это, однако, не исключает того, что и при низких дозах некоторая индукция фермента имела место, но к моменту исследования активность его нормализовалась. Что касается БРОД активности, то она была более восприимчива к действию индуктора, реагируя уже на минимальную (0,125 мл/кг) дозу препарата. Увеличение дозы вызывало и увеличение уровня индукции данного фермента (в 13 раз по сравнению с контролем при дозе 1,5 мл/кг.)
Чтобы ответить на вопрос, какие молекулярные механизмы вовлечены в изменение ферментативной активности при действии препарата ТВ^ мы определили уровень мРНК для генов сур2Ь с использованием метода мультиплексной оьратной транскрипции — полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Ген «домашнего хозяйства», в-актин, был использован как эндогенный внутренний стандарт, относительно которого производилась нормализация продуктов амплификации генов сур2Ь. Результаты исследования представлены на рис. 4. Как видно из рисунка, в печени контрольных животных регистрируется низкая конститутивная экспрессия генов сур2Ь, однако уже через 15 час после введения индуктора она значительно увеличивается. Максимальное (в
Рис. 4. Экспрессия генов Сур2Ь в печени мышей в зависимости от времени действия TBF.
А) электрофорез в 2% агарозном геле ПЦР-продуктов генов сур2Ь и в-актина, Б) уровни cyp2b мРНК, нормализованные на уровни мРНК р-актина. Приведены средние значения ± SD (п=9). * Достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,01).
7.5 раза) увеличение количества специфической сур2Ь мРНК достигается к 24 ч, после чего оно незначительно снижается и в дальнейшем держится на таком уровне в течение, по крайней мере, 6-ти суток (более поздние сроки не исследовали).
Заключение
Проведенное исследование показало, что препарат ТВ^ полученный после электрохимического фторирования трибутилфосфата, не вызывает значительного увеличения в печени мышей активности Сур1а-зависимых ферментов, но существенно усиливает активность ферментов, ассоциированных с Сур2Ь и Сур2с. Степень индукции последних зависит от дозы и времени действия ТВ^ причем ее динамика напоминает таковую при хроническом действии классического индуктора фенобарбитала [1]. При однократном введении, однако, фенобарбитал вызывает значительно более быстро проходящее увеличение активности указанных ферментов [7]. Максимальный уровень индукции препаратом TBF активности ПРОД в наших экспериментах был в полтора раза ниже, чем уровень индукции БРОД, что согласуется с литературными данными по индукции этих активностей классическими индукторами фенобар-биталового типа [5].
Известно, что регуляция ферментативной активности цитохромов Р450 осуществляется на разных уровнях, включая инициацию транскрипции генов, стабилизацию мРНК и/или белка [9]. В наших экспериментах методом мультиплексной ОТ-ПЦР были измерены относительные количества мРНК гена сур2Ь. Результаты анализа показали, что после введения TBF количество этой мРНК в печени мышей увеличилось в 7,5 раза, причем времязависимая динамика ее накопления схожа с таковой при индукции фенобарбиталом
[4]. Таким образом, полученные нами результаты дают возможность полагать, что препарат TBF является новым индуктором Сур2Ь печени мышей и что его индуцирующий эффект реализуется на уровне транскрипции генов Сур2Ь.
Интересно отметить, что печеночный индекс при введении мышам TBF увеличивается по сравнению с контролем значительно сильнее (в
3.5 раза), чем при индукции классическими индукторами фенобарбиталового типа — в 1,2 раза в случае фенобарбитала и в 2,1 раза в случае 1,4-бис-[2-(3,5-дихлорпиридилокси)] бензола [6]. Это может означать, что TBF оказывает более сильное токсическое действие на печень, чем указанные индукторы. Действительно, на максимуме индукции (через сутки после трехкратного введения фенобарбитала в разовой дозе 80 мг/кг и на 6-е сутки после однократного введения ТВБ в дозе 1,5 мл/кг) активность аланинаминотранс-
феразы в сыворотке крови мышей увеличилась в первом случае в 2,2 раза, а во втором — в 5,3 раза по сравнению с контролем. Активность аспарта-таминотрансферазы увеличилась у них соответственно в 1,6 раза и в 2,1 раза. Однако гепатоток-сичность препарата TBF может быть не связана с его индуцирующей активностью. Дело в том, что мы использовали суммарный неочищенный препарат-сырец, который может содержать как недофторированные примеси, так и набор продуктов деструкции исходного соединения с меньшим числом углеродных атомов в молекуле. В качестве минорных компонентов в сырце могут присутствовать водородфторсодержащие примеси, которые при гидролизе в организме мышей могут дать непосредственно токсичный для ткани печени фтористый водород, а также линейные или циклические перфторкарбонилфториды и перфторуглероды.
Были основания предполагать, что в качестве основного продукта при электролизе в результате деструкции и изомеризации трибутилфосфата может образоваться перфтордибутиловый эфир. Однако проверка показала, что чистый перфтордибутиловый эфир, любезно предоставленный нам докт. Г.Г. Фуриным (НИОХ СО РАН), как и исходный трибутилфосфат, не воспроизводит токсикологических показателей препарата TBF и не вызывает у мышей ни увеличения массы печени, ни повышения в ней активности изучаемых ферментов. Следовательно, если перфтор-дибутиловый эфир и присутствует в препарате, биологическая активность, очевидно, связана не с ним.
HYPERINDUCTION OF MOUSE HEPATIC CYP2B AND CYP2C BY PRODUCTS OF ELECTROCHEMICAL FLUORINATION OF TRIBUTYLPHOSPHATE
V.O. Pustylnyak, A.N. Shirshova, L.F. Gulyaeva,
V.I. Kaledin, V.P. Nikolin, G.I. Kaurova,
V.A. Matalin, V.M. Shvartsberg,
O.P. Korobejnichev
Dose- and time-dependent induction of cytochrome P450 1a, 2b and 2c subfamilies by novel perfluorochemical compound (TBF) was investigated. It was shown that TBF significant increases Cyp2b and Cyp2c specific activities in mouse liver, whereas it has little if any effect on Cyp1a specific activities. Results of multiplex RT-PCR have shown that TBF administration leads to 7,5-fold increase of relative Cyp2b mRNA level. Thus, our results provide evidence to support the conclusion that TBF is novel inducer of Cyp2b in mouse liver and mechanism of induction occur through transcriptional activation of Cyp2b genes.
Литература
1. Dynamics of androstenedione metabolite formation in rat liver microsomes during temporal phenobarbital induction / O.G. Khatsenko, L. F. Gulyaeva, V.M. Mishin, V.V. Lyakhovich // Int. J. Biochem. — 1991. — Vol. 99.
— P.257 - 261.
2. Ethoxy-, pentoxy- and benzyloxyphenoxazones and homologues: A series of substrates to distinguish between different induced cytochromes P450 / M.D. Burke, S. Thompson, C. Elcombe et al. // Biochem. Pharmacol.
— 1985. — Vol. 34. — P. 3337-3345.
3. Handschin C. Induction of drug metabolism: The role of nuclear receptors / C. Handschin, U. Meyer // Pharmacol. Rev. — 2003. — Vol. 55. — P. 649-673.
4. Hardwick J.P. Transcriptional regulation of rat liver epoxide hydratase, NADPH-cytochrome P-450b genes by Phenobarbital / J. P. Hardwick, F.J. Gonzalez, C.B. Kasper // J. Biol. Chem. — 1983. — Vol. 258. — P. 8081-8085.
5. Induction of hepatic cytochrome P450 mediated alk-oxyresorufin O-dealkylase activities in different species by prototupe P450 inducers / R.A. Lubet, J-L. Syi, J.O. Nelson, R.W. Nims // Chem. Biol. Interact. — 1990. — Vol. 75. — P. 325-339.
6. Induction of hepatic cytochromes P450 by dietary
1,4-bis[2-(3,5-dichloropyridyloxy)]benzene (TCPOBOP) in the B6C3F1 mouse: dose-dependence and Pharmacodynamics / R.W. Nims, L.E. Beebe, W.E. Utermahlen et al. // Inter. J. Toxicol. — 1999. — Vol. 18. — P. 123-130.
7. Long-term effects of Phenobarbital on rat liver microsomal drug-metabolizing enzymes and heme-metabolizing enzyme / N. Kurata, T. Yoshida, Y. Kuroiwa et al. // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. — 1989. — Vol. 65. — P. 161-179.
8. Monitoring mRNA expression by polymerase chain reaction: The «primer-dropping» method / H. Wong, W.D. Anderson, T. Cheng, K.T. Riabowol // Anal. Biochem. — 1994. — Vol. 223. — P. 251-258.
9. Poster T.D. Cytochrom P450. Multiplicity of isoforms, substrates and catalytic and regulatory mechanisms / T.D. Poster, M.J. Coon // J. Biol. Chem. — 1991. — Vol. 266. — P. 13469-13472.
10. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chem. — 1951. — Vol. 193. — P. 265-275.
11. The phenobarbital-type induction of rat liver microsomal monooxygenases by perfluorodecalin / V.M. Mishin, V.V. Obraztsov, A.Yu. Grishanova et al. // Chem.-Biol. Interactions. — 1989. — Vol. 72. — P. 143-155.
