CC BY
11Научная статья УДК 678.046.6
doi:10.37614/2949-1215.2022.13.1.016
ГИДРОЛИЗАТЫ КОЛЛАГЕНА ИЗ ПЛАВАТЕЛЬНОГО ПУЗЫРЯ СЕВЕРНЫХ РЫБ: ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ
Анна Ильинична Исакова1, Наталия Николаевна Петрова2, Светлана Федоровна Артахинова3
12 3Северо-Восточный федеральный университет имени М. К. Аммосова, Якутск, Россия
1 isa.a1@mail.ru
2pnn2002@mail.ru
3isf1990@mail.ru
Аннотация
Убраны данные по исследованию гидролизата коллагена, полученного из плавательного пузыря северных видов рыб с помощью щелочно-солевого гидролиза. Приведены данные по молекулярной массе, среднему размеру частиц, структуре, микробиологическим показателям, наличию тяжелых металлов. Полученный гидролизат коллагена был опробован в медицинских целях, в также в технической сфере для модификации резин. Ключевые слова:
гидролизат коллагена, плавательные пузыри, биологически активные системы, резина Original article
COLLAGEN HYDROLYSATES OBTAINED FROM THE SWIM BLADDER OF NORTHERN FISH: PREPARATION AND APPLICATION
Anna I. Isakova1, Natalia N. Petrova2, Svetlana F. Artakhinova3
12,3M. K. Ammosov North-Eastern Federal University, Yakutsk, Russia
1 isa.a1@mail.ru
2pnn2002@mail.ru
3isf1990@mail.ru
Abstract
This article contains data on the study of collagen hydrolyzate obtained from the swim bladder of northern fish species by alkaline-salt hydrolysis. Data on molecular weight, average particle size, structure, microbiological parameters, and heavy metals are given. The obtained collagen hydrolyzate was tested in a number of medical applications, as well as in the technical field for the modification of rubbers. Keywords:
collagen hydrolyzate, swimming bladders, biologically active systems, rubber
В настоящее время гидролизованные белки широко используются в индустрии массового питания, медицине, ветеринарии и микробиологической промышленности. Их применяют также в качестве биологически активных добавок (БАД) к пище, специальных пищевых и кормовых ингредиентов. Они высоко ценятся в детской диетологии, применяются в рационах животных, в первую очередь, в качестве компонентов стартерных кормов молодняка. Широко используются в качестве основы питательных сред для культивирования клеток тканей и бактерий, в качестве незаменимого компонента питательных сред для выращивания микроорганизмов и их защитных сред, а также в качестве кровеостанавливающих губок, компонентов искусственной кожи и других средств доставки лекарственных препаратов. [1, 2]. Коллаген и его гидролизаты задействуют не только для производства медицинских изделий, БАДов и пищевых продуктов, но и в технических сферах: например, для модификации полимерных материалов в целях приближения свойств синтетических эластомеров к свойствам натурального каучука, а также для замены различных ингредиентов полимерных композиций в целях разработки экологически чистых материалов. Широкий спектр областей применения белковых продуктов вызывает значительный интерес у производителей и заставляет изыскивать новые источники сырья.
Коллаген представляет собой фибриллярный белок соединительной ткани и обладает рядом положительных свойств: отсутствием токсичности и канцерогенных свойств, слабой антигенностью, высокой механической прочностью и устойчивостью к тканевым ферментам, способностью образовывать комплексы с биологически активными веществами (гепарином, хондроитинсульфатом), стимуляцией регенерации собственных тканей организма [3]. Будучи введенным в синтетический каучук марки СКИ-3, направленным образом меняет свойства материала, улучшает когезионную прочность, клейкость, сопротивление раздиру и приближает синтетический каучук по комплексу свойств к натуральному каучуку.
Нами был найден новый экологически чистый источник коллагена для получения на его основе биодеградируемого, гипоаллергенного гидролизата. В качестве сырья были использованы плавательные пузыри северных видов рыб — отходы производства рыбоперерабатывающих компаний Республики Саха (Якутия). Отходы состояли из плавательных пузырей сиговых и других видов рыб. Уникальность северных видов рыб определяется богатым аминокислотным составом соединительной ткани, высокой концентрацией биологически активных веществ, поскольку эти факторы позволяют всему живому лучше адаптироваться к суровым условиям существования на Севере. Вначале исследований нами был использован плавательный пузырь осетра, однако, несмотря на уникальность и эффективность полученных продуктов, исследования пока не дали ожидаемого экономического эффекта. Если в случае использования осетра сырьевая база является ограниченной, то для остальных промысловых рыб таких проблем не существует. Могут быть использованы отходы сиговых рыб (омуля, сига, чира и др.), широко распространенных в Республике Саха (Якутия). Следует еще раз подчеркнуть, что данный вид сырья является отходом, который промышленным образом не перерабатывается. С этой точки зрения поиск новых областей применения гидролизатов коллагена, полученных из плавательных пузырей северных рыб, является актуальной и важной задачей.
Целью работы является разработка технологий гидролиза коллагена из плавательного пузыря северных рыб и изыскание рациональных путей применения полученного продукта в различных отраслях. Коллаген, входящий в состав разных видов рыб, имеет свои особенности химического состава, которые позволяют варьировать в определенных пределах состав и свойства получаемых на их основе материалов. Все это требует всестороннего изучения. Поскольку коллаген является высокомолекулярным полимером, в фармацевтической и косметической промышленности он в чистом виде не используется. Для лучшего проникновения в организм человека (фармацевтические препараты, мази, кремы) необходимо снизить молекулярную массу полипептидных цепей, то есть необходимо разработать оптимальную технологию гидролиза исходного сырья. Лишь с использованием метода расщепления молекулы коллагена образуется «активный» гидролизованный коллаген, который максимально усваивается организмом. Благодаря данному методу появляется максимально сбалансированный комплекс аминокислот, которые участвуют в развитии и восстановлении тканей.
Объекты и методы исследований
Объектом исследований являлся коллаген из плавательного пузыря сиговых рыб. Плавательный пузырь подвергали щелочно-солевому гидролизу с последующей сублимационной сушкой. Полученный гидролизат исследовали различными методами, а также тестировали в медицинских экспериментах in vivo на подопытных крысах линии Wister. Кроме того, гидролизат коллагена был введен в эластомерные материалы на основе эпихлоргидринового каучука HydrinT6000, бутадиен-нитрильных каучуков марок БНКС-18, БНКС-28, полиизопренового каучука марки СКИ-3.
В ходе работы были исследованы молекулярная масса, размеры, структура, микробиологические показатели гидролизата коллагена, а также содержание тяжелых металлов самих плавательных пузырей. Молекулярную массу определяли вискозиметрическим методом. Для определения вязкости раствора полимера измеряют время истечения равных объемов растворителя и раствора через капилляр вискозиметра при заданной постоянной температуре. Вискозиметрические измерения проводили на аппарате Laudaproline PVL 15 с капиллярным вискозиметром Уббелоде с диаметром 0,005 мм при Т = 25 °С.
Размер частиц гидролизата определяли методом динамического рассеяния света, измерения проводили при температуре 25 °С на анализаторе частиц субмикронного диапазона NanosizerZS (Великобритания) с углом детектирования в 173 ° и 13 °. В анализаторе используется гелий-неоновый
лазер мощностью 4 мВт, работающий на длине волны 633 нм. Структуру гидролизата коллагена исследовали с помощью растрового электронного микроскопа JEOL JSM-7800F.
Наличие тяжелых металлов в плавательных пузырях определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии на спектрофотометре «Спектр 5-3». Также на базе Якутской республиканской ветеринарно-испытательной лаборатории были исследованы микробиологические показатели гидролизата коллагена.
Обсуждение результатов
Гидролизат коллагена получали из плавательных пузырей северных видов рыб, которые почти полностью состоят из коллагена [4]. Реакция щелочно-солевого гидролиза плавательных пузырей сводится к селективному разрушению, в основном к разрыхлению волокнистых структур, разрыву межмолекулярных связей, сохраняющих трехспиральную структуру исходного коллагена. Ход процесса описан в работе [5]. На рис. 1 представлены электронные микрофотографии плавательного пузыря омуля и гидролизата коллагена, полученного из него.
Рис. 1. Электронные микрофотографии плавательного пузыря омуля при разрешении х 150 (А) и х 10000 (В), а также гидролизата коллагена, полученного из него, при разрешении х 150 (С) и х 1000 (В)
На фотографиях при увеличении 150 и 1000 различимы фрагменты разрыхленной структуры, отдельные волокна коллагена, хаотично расположенные нити.
Результаты исследований показали, что молекулярная масса гидролизата коллагена, полученного из омуля, составляет 17521 г / моль, а средний размер частиц коллагена в водной суспензии — 65,62 нм (рис. 2), то есть в суспензии коллагена присутствуют частицы нанодиапазона, что в дальнейшем может быть использовано для получения медицинских препаратов, косметологических средств, а также нанонаполнителей для полимерных материалов. Можно предположить высокую проницаемость гидролизатов коллагена через биологические барьеры кожи, высокую усвояемость организмом человека при потреблении в качестве БАД вследствие малых размеров, что открывает широкие перспективы для применения в различных областях.
При использовании гидролизата коллагена в медицинской и фармацевтической отраслях нужно быть уверенным, что он не содержит вредных веществ. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии было исследовано содержание свинца, кадмия, ртути, мышьяка, цинка, меди, ртути, марганца в плавательном пузыре омуля. Показано, что содержание этих элементов не превышает
предельно допустимых концентраций (ПДК). На последующих стадиях переработки для достижения безопасности продукта при контакте с организмом человека проводили диализ для удаления реагентов, используемых для гидролиза. Также на базе Якутской республиканской ветеринарно-испытательной лаборатории были исследованы микробиологические показатели полученного гидролизата коллагена (табл. 1), которые подтвердили его безопасность.
Содержание тяжелых металлов в плавательном пузыре были определены на спектрофотометре «Спектр 5-3» методом атомно-абсорбционного анализа. Результаты приведены в табл. 2.
Полученный гидролизат коллагена был опробован в экспериментах in vivo при лечении ран и обморожений по методике, изложенной в [6]. Продолжительность эксперимента составляла 14 сут. По сравнению с контрольной группой для ран, обработанных пленками и порошком из плавательного пузыря, в первые сутки изменения площади были несколько меньше, но заживление ран происходило на 2-е сут раньше, а также несколько уменьшались сроки образования грануляционной ткани.
25' __ 26? о S 15 Q. (D | 10 □ Z Е-' Size Distribution by Number
0 1 1 10 100 Size (d.nm) Record S: омуль ц.ф. 1 1000 10000
Рис. 2. Распределение частиц гидролизата коллагена в суспензии, полученной из плавательного пузыря омуля
Таблица 1
Микробиологические показатели гидролизата коллагена, полученного из плавательных пузырей северных видов рыб
Показатель Нормативные документы Значение по Фактические
на методы исследований нормативным документам параметры
Патогенные ГОСТ 31659-2012 В образце массой 25 г не Не обнаружены
микроорганизмы, в том допускаются
числе сальмонеллы
КМАФАнМ*, КОЕ / г ГОСТ 10444.15-94 Не более 1 • 104 1,6 • 103
БГКП** (колиформы) ГОСТ 31747-2012 В 0,1 г не допускаются Не обнаружены
E. coli ГОСТ 3072-2001 То же То же
Staphylococcus aureus ГОСТ 31746-2012 » »
* Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. ** Бактерии группы кишечной палочки.
Таблица 2
Содержание тяжелых металлов в плавательном пузыре северных видов рыб, мкг / кг
Материал в сыром виде Pb Cd Hg As Zn Cu Fe Mn
ПДК 1,0 0,2 0,3 1,0 40,0 10,0 - -
Плавательный пузырь 0,22 ± 0,01 Не обнаружен 0,00290 ± 0,00005 0,0072 ± 0,0003 17,868 ± 0,002 3,6 ± 0,1 22,3 ± 0,4 0,32 ± 0,07
Таким образом, гидролизат, полученный из плавательных пузырей северных видов рыб, которые являются новым малоисследованным источником сырья, может быть перспективным материалом для получения различных изделий и лекарственных средств для медицины, фармации, косметологии. Препараты на основе гидролизованного коллагена могут поддержать работоспособность иммунной системы, вывести токсины, замедлить процессы старения, восстановить ткани при больших нагрузках и пр. Разработанный гидролизат коллагена может применяться в качестве трансдермальных лекарственных препаратов для лечения ожогов, обморожений, а также в качестве лекарственных препаратов и косметических средств, БАД, предназначенной для корма крупного рогатого скота, домашних животных. Он может быть использован как исходный материал для получения искусственной кожи и костной ткани. Перспективные направления использования коллагена из северных пород рыб — создание «чернил» для биологических SD-принтеров (биоразлагаемые контейнеры для стволовых клеток), таргетная доставка лекарственных препаратов.
Другая перспективная сфера применения гидролизата коллагена связана с его использованием в технической сфере. Гидролизаты из плавательного пузыря северных рыб были опробованы нами при производстве резинотехнических изделий уплотнительного назначения. Модификация резиновых смесей на основе эпихлогидринового каучука марки HydrinT6000 (Япония) 3 мас. ч. гидролизата коллагена, введенными на 100 мас. ч. каучука, приводит к увеличению сопротивления раздиру на 12,8 % по сравнению с исходной резиной, не содержащей гидролизата. Физико-механические свойства при этом сохраняются на исходном уровне. Для резин на основе бутадиен-нитрильных каучуков марок БНКС-18, БНКС-28, содержащих 3 мас. ч. гидролизата коллагена, значение остаточной деформации сжатия снижается на 17 и 20 % соответственно по сравнению с исходным материалом, что является положительным эффектом. При добавлении 3 мас. ч. гидролизата коллагена в резиновую смесь на основе БНКС-18 условная прочность при разрыве полученных материалов увеличивается на 30 %. Данный показатель незначительно снижается при модификации БНКС-26. Исследования морозостойкости резин на основе БНКС-18, которую оценивали по коэффициенту эластического восстановления после сжатия, показали, что введение гидролизата коллагена в рецептуру резин положительно влияет на их низкотемпературные свойства. Также при введении гидролизата коллагена наблюдается существенное увеличение скорости вулканизации в главном периоде: для резиновой смеси на основе БНКС-18 на 216 %, для БНКС-28 на 359 %, для ЭПХГ на 83 %. То есть подобное влияние позволит в будущем сократить продолжительность вулканизации резинотехнических изделий.
Таким образом, плавательные пузыри промысловых рыб как вид сырья обладают высокой экологичностью, при этом они являются отходами переработки. В экспериментах in vivo по применению пленок из коллагена из плавательного пузыря северных видов рыб в качестве медицинских средств для заживления ран подопытных животных установлено, что сокращается площадь раны, несколько уменьшаются сроки ее заживления, пленки не вызывают раздражающего действия и оказывают стимулирующее влияние на процессы заживления ран. При модификации резин на основе полярных каучуков гидролизат коллагена является полифункциональной добавкой, его можно рассматривать в качестве вторичного вулканизующего агента, ускорителя вулканизации.
Список источников
1. Пат. 2612155 C1 Рос. Федерация, МПК A 23 J 1 / 00. Способ получения белковых гидролизатов / Пономарев В. В., Бикбов Т. М., Хабибулина Н. В.; заявитель и патентообладатель В. В. Пономарев. № 2015150716/2015-11-26 ; заявл. 26.11.2015 ; опубл. 02.03.2017, Бюл. № 7. 16 с.
2. Югай А. В. К вопросу актуальности использования нетрадиционных видов рыб на примере бычков семейства Cottidae // Известия ТИНРО (Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра). 2009. Т. 156. С. 341-347.
3. Хилькин А. М., Шехтер А. Б., Истранов Л. П., Леменев В. Л. Коллаген и его применение в медецине. М.: Медицина, 1976. 256 с.
4. Гармаева Д. К., Иванова С. В., Никифоров П. В., Аржакова Л. И. Результаты планиметрического анализа заживления кожных ран при аппликации тканевым клеем // Мат-лы III Межрег. науч.-практич. конф. с междунар. уч-м «Экология и здоровье человека на Севере». Якутск, 2012. С. 42-45.
5. Иванова С. Ф., Петрова Н. Н. Исследование коллагена из плавательного пузыря осетровых (Acipenseridae) и сиговых (Corogenidae) пород рыб // Вестник СВФУ. Серия 49. Технические науки.2015.№ 5. С. 51-59.
6. Гармаева Д. К., Петрова Н. Н., Иванова С. Ф., Никифоров П. В., Аржакова Л. И. Экспериментальный опыт применения биологического клея на основе местного сырья для заживления кожных ран // Якутский медицинский журнал. 2013. № 1 (41). С. 39-43.
References
1. Ponomarev V. V., Bikbov T. M., Khabibulina N. V. Sposob polucheniya belkovyh gidrolizatov [Method of protein hydrolysates obtaining ]. Patent RF, no. 2612155 C1, 2017.
2. Yugaj A. V. K voprosu aktual'nosti ispol'zovaniya netradicionnyh vidov ryb na primere bychkov semej stva Cottidae [On the relevance of the use of non-traditional fish species on the example of gobies of the Cottidae family]. Izvestiya Tikhookeanskogo nauchno-issledovatel'skogo rybohozyajstvennogo centra [Proceedings of the Pacific Fisheries Research Center], 2009, vol. 156, pp. 341-347. (In Russ.).
3. Khil'kin A. M., Shekhter A. B., Istranov L. P., Lemenev V. L. Kollagen i egoprimenenie v medicine [Collagen and its application in medicine]. Moscow, Meditsina, 1976, 256 p. (In Russ.).
4. Garmaeva D. K., Ivanova S. V., Nikiforov P. V., Arzhakova L. I. Rezul'taty planimetricheskogo analiza zazhivleniya kozhnyh ran pri applikacii tkanevym kleem [Results of planimetric analysis of skin wound healing with tissue glue application]. Materialy III Mezhregional'noj nauchno-prakticheskoj konferencii s mezhdunarodnym uchastiem "Ekologiya i zdorov'e cheloveka na Severe" [Proceedings of the III Interregional scientific-practical conference with international participation "Ecology and Human Health in the North"]. Yakutsk, 2012, pp. 42-45. (In Russ.).
5. Ivanova S. F., Petrova N. N. Issledovanie kollagena iz plavatel'nogo puzyrya osetrovyh (Acipenseridae) i sigovyh (Corogenidae) porod ryb [Study of collagen from the swim bladder of sturgeon (Acipenseridae) and whitefish (Corogenidae) fish species]. Vestnik SVFU. Seriya 49, Tekhnicheskie nauki [Bulletin of of the North-Eastern Federal University. Series 49. Technical Sciences], 2015, no. 5, pp. 51-59. (In Russ.).
6. Garmaeva D. K., Petrova N. N., Ivanova S. F., Nikiforov P. V., Arzhakova L. I. Eksperimental'nyj opyt primeneniya biologicheskogo kleya na osnove mestnogo syr'ya dlya zazhivleniya kozhnyh ran [Experimental experience of using biological glue based on local raw materials for skin wound healing]. YakutskijMedicinskijzhurnal [Yakutsk Medical Journal], 2013, no. 1 (41), pp. 39-43. (In Russ.).
Информация об авторах
А. И. Исакова — магистрант второго курса группы М-ХМ-20;
Н. Н. Петрова — доктор химических наук, доцент, профессор — заведующий Химическим отделением Института
естественных наук;
С. Ф. Артахинова — старший преподаватель Химического отделения Института естественных наук.
Information about the authors
A. I. Isakova — Second Year Master Student of the M-XM-20 group, Institute of Natural Sciences; N. N. Petrova — Dr. Sc. (Chemistry), Associate Professor, Professor the Head of the Chemical Department of the Institute of Natural Sciences;
S. F. Artakhinova — Senior Lecturer of the Chemical Department of the Institute of Natural Sciences.
Статья поступила в редакцию 19.02.2022; одобрена после рецензирования 04.04.2022; принята к публикации 08.04.2022. The article was submitted 19.02.2022; approved after reviewing 04.04.2022; accepted for publication 08.04.2022.
