CC BY
25
УДК 339.138:628.477.6
Новосельцева А.О., Епишкина Ю.М., Баурин Д.В., Шакир И.В., Панфилов В.И.
ГИДРОЛИЗАТ БЕЛКА ПОДСОЛНЕЧНИКА, КАК АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ИСТОЧНИК АЗОТА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ BACILLUS MEGATERIUM
Новосельцева Алёна Олеговна, студентка 3 курса бакалавриата факультета биотехнологии и промышленной экологии, e-mail: aonovoseltseva@gmail.com;
Епишкина Юлия Михайловна, студентка 1 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Баурин Дмитрий Витальевич, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии;
Шакир Ирина Васильевна, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии;
Панфилов Виктор Иванович, д.т.н., профессор, заведующий кафедрой биотехнологии,
Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, 125480, Москва, ул. Героев
Панфиловцев, д. 20
В данной работе представлены результаты исследования возможности использования гидролизатов белка подсолнечника в качестве источника органического азота в питательных средах как альтернатива использованию коммерческого пептона. Гидролиз изолята белка проводился коммерческими ферментными препаратами протеолитического действия: Proteinase T, Protex 7L, Protex 40E, Protex 51FP (Danisco Genecor, Дания), Fermgen, и панкреатин (Биосинтез, Российская Федерация). В качестве объекта исследования был выбран штамм Bacillus megaterium B-3750. Полученные данные показали, что культура накапливает значительное количество биомассы с высоким количеством клеток на мл.
Ключевые слова: подсолнечный шрот, гидролизат белка, растительный пептон, источник азота, витамин B12.
SUNFLOWER PROTEIN ENZYMATIC HYDROLYSATES AS AN ALTERNATIVE NITROGEN SOURCE FOR CULTIVATION OF Bacillus megaterium
Novoseltseva A.O., Epishkina J.M., Baurin D.V., Shakir I.V., Panfilov V.I.
This paper presents the results of research the possibility of using sunflower protein hydrolysates as a source of organic nitrogen for nutrient media as an alternative to using commercial peptone. Concentrate hydrolysis was carried out with commercial enzyme proteolytic preparations, such as Proteinase T, Protex 7L, Protex 40E, Protex 51FP (Danisco Genecor, Denmark), Fermgen and Pancreatin (Biosynthesis, the Russian Federation). Bacillus megaterium strain B - 3750 was a test object and proved to accumulate a significant amount of biomass with high cell count per ml.
Keywords: sunflower meal, plant peptone, protein isolate, nitrogen source, vitamin B12.
Подсолнечник представляет собой
высокодоходную масличную культуру, которая может не только обеспечить потребность экономики Российской Федерации в высококачественном растительном масле, необходимом для пищевого производства, но и стать достаточно эффективным источником азота, как элемент многокомпонентной питательной среды. По состоянию на 2019 г. Россия занимает второе место в мире по объемам производства подсолнечника (14,6 млн тонн). В течение последних лет наблюдается положительная тенденция роста этого показателя [1]. Актуальность исследования возможности использования шрота подсолнечника в качестве источника органического азота [2] для культивирования микроорганизмов также обуславливается высокой стоимостью коммерческих препаратов, таких как пептон [3], мясной и дрожжевой экстракты. В данной работе был использован продукт гидролиза подсолнечного шрота как источник азота для культивирования Bacillus megaterium [4].
Bacillus megaterium представляет особую ценность в первую очередь как продуцент витамина B12 (кобаламина), необходимого млекопитающим, в том числе человеку. Витамин В12 включает в себя
два кофермента: метилкобаламин и
аденозилкобаламин, которые играют существенную роль в метаболизме животных, ДНК-синтезе, синтезе гемоглобина и механизмах регуляции процессов жизнедеятельности, однако биологически не синтезируются в организмах млекопитающих [5].
В качестве источника азота для питательных сред во многих коммерческих препаратах используется пептон, который может быть получен из растительного сырья, в том числе из шрота подсолнечника, путем гидролиза. Однако преимущество отдается ферментативному расщеплению, так как в этом случае не происходит разрушения аминокислот, которое характерно для кислотного гидролиза. С целью ферментативной обработки могут быть использованы различные протеазы протеолитического действия.
Выделение изолята белка подсолнечника было изучено ранее на кафедре биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева. Были произведены депротеинизация и получение гидролизатов обезжиренного подсолнечного шрота [6].
В настоящем исследовании для получения изолята использовали Fermgen и щелочные протеазы: Protex 7L, Protex 40E, Protex 51FP,
Proteinase T, панкреатин. Все препараты разрешены к применению в пищевой промышленности и имеют диапазон pH от 4,0 до 12,0, что соответствовало растворимости изолята белка подсолнечника. Ферментативный гидролиз проводили на водяной бане в течение 12 часов при постоянном перемешивании (магнитная мешалка). В процессе гидролиза каждые 2 часа осуществлялся отбор проб на анализ содержания аминного азота по методу Серенсена (формольного титрования) [7]. Полученные гидролизаты использовали в качестве среды для ферментации бактерий. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с рабочим объемом 100 мл при 37°C в течение 24 часов при постоянном перемешивании со скоростью 180 об/мин. Инокулят вносили из расчета 10% от объема ферментационной среды. Рост культуры определяли с помощью микрометода Коха [8]. Высев производили на агаризованные питательные среды состава МПА (мясо - пептонный агар) [9]. Количество редуцирующих веществ (РВ) оценивали с помощью оптического метода по реакции с 3,5-ДНСК (динитросалициловая кислота) [10]. Приведенные данные представляют собой средние значения, полученные в трехкратной повторности.
Для исследования влияния замещения источника азота на рост клеток в культуральную среду добавляли 10 г/л изолята белка подсолнечника вместо 10 г/л мясного пептона. В процессе ферментации каждый час отбирали пробу на содержание РВ, аминного азота и выполняли высев на твердую питательную среду для оценки показателей роста культуры (рис. 1).
Замена мясного пептона неочищенным подсолнечным изолятом белка не ингибировала рост клеток, максимальная концентрация клеток достигала 3,3 109 КОЕ/мл была достигнута на 10-й час ферментации на среде с мясным пептоном, и 4,5-108 КОЕ/мл на 10-й час ферментации в колбе на среде с изолятом белка подсолнечника. рН повышался с 6,6 до 8,4 и до 8,21 в течение 24 ч ферментации на среде, содержащей мясной пептон и изолят белка подсолнечника соответственно. Однако концентрация аминного азота в среде на основе изолята белка подсолнечника была на 51% ниже по сравнению со средой на основе мясного пептона (364 мг/л и 714 мг/л соответственно). Длительность лаг-фазы составила 6 часов при использовании среды с белком подсолнечника (по сравнению с 2 часами при использовании мясного пептона), что было вызвано низким содержанием доступных низкомолекулярных соединений для быстрого накопления биомассы бактерии. Высокомолекулярные белковые комплексы могут быть расщеплены на доступные питательные вещества для роста бактерий путем применения промышленных протеаз.
Рис. 1. Графики зависимости роста ln (КОЕ/мл) и потребления аминного азота (мг/л) от времени при ферментации в колбах Bacillus megaterium на среде, содержащей мясной пептон (а) и неочищенный изолят белка подсолнечника (б)
Применение ферментативного гидролиза позволяет значительно увеличить показатель аминного азота в гидролизатах. Гидролиз изолята проводился коммерческими ферментными препаратами протеолитического действия: Proteinase T, Protex 7L, Protex 40E, Protex 51FP (Danisco Genecor, Дания), Fermgen, и панкреатин (Биосинтез, Российская Федерация). Для исследования влияния использования ферментативных гидролизатов изолята белка подсолнечника на рост клеток проводили гидролиз. Полученную среду инокулировали Bacillus megaterium. После 24 ч ферментации в колбе при перемешивании рассчитывали ln (КОЕ/мл) и определяли расход аминного азота (мг/л) (рис. 2).
а)
а
. + -------в'
и—■--.--Н
-------*
о ■ * / f
3 I /
"о..... Г /
гк----—-й .X
х---*
в----f
ыД-т4
¡»•-о--
о
X
J 10 15 20
В fi е J ! я, ч
- à -Protei 7L ■■■■>■■■ Frotes 4ÜE -a-Ргпех 5 IFF -X-Proteinase T-■Q'- Faiiigai —h-
б)
912 ID
А
Ь É12 л - V -V
I Т '"Чй -
3 512 ■> Н1 X,
. \ Ч
а 412 +
-
<
212 112 12
"Х- -XX
—X
Чг V Vv,
G
Вре'ч
-ir- Protex TL --♦-- Protex 40E - О-- Protex 51FP
- 'X' - ProtH iuase T Fermgen
Рис. 2. Кривые роста культуры Bacillus megaterium (а) и зависимость концентрации аминного азота (мг/л) (б) от
времени при ферментации на неочищенных ферментативных гидролизатах белка подсолнечника.
Замена мясного пептона ферментативными гидролизатами изолята белка к значительным изменениям
не приводила.
Максимальная
концентрация клеток достигала 5,1109 КОЕ/мл на 10-й час ферментации в колбе при перемешивании на среде на основе ферментативных гидролизатов, полученных с помощью Fermgen, и 4,5 • 108 на 10-й час ферментации в колбе со средой с изолятом белка подсолнечника. pH повышался с 6,6 до 8,4 и до 8,21 в течение 24 ч ферментации на среде, содержащей мясной пептон и изолят белка подсолнечника соответственно.
В настоящей работе изучалась возможность замены мясного пептона изолятом белка подсолнечника как источника азота для культивирования Bacillus megaterium B-3750. Было отмечено, что использование изолята белка подсолнечника не оказало существенного влияния на процесс ферментации, по сравнению с
использованием коммерческого мясного пептона, что позволяет в дальнейшем снизить затраты на промышленное производство витамина B12.
Ферментация Bacillus megaterium на среде, содержащей изолят белка подсолнечника, обработанный кислой протеиназой Fermgen, а также щелочной эндопептидазой Protex 7L, продемонстрировала наибольший рост бактерий, что означает, что данные ферменты могут быть эффективно использованы в процессе промышленного культивирования штаммов продуцентов.
Список литературы
1. World Supply & Disappearance [Электронный ресурс]. URL: https://www.sunflowernsa.com/stats/world-supply/.
2. Sosulski F., Fleming S. E. Chemical, functional, and nutritional properties of sunflower protein products // Journal of the American Oil Chemists' Society. 1977. № 2 (54).
3. Kabirullah M., Wills R. B. H. Functional properties of acetylated and succinylated sunflower protein isolate // International Journal of Food Science & Technology. 1982. № 2 (17). C. 235-249.
4. Gentina J. C., Acevedo F., Villagra M. P. Effect of complex nitrogen sources on the production of penicillin acylase by Bacillus megaterium // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 1997. № 1 (13). C. 127-128.
5. Martens J. H. et al. Microbial production of vitamin B 12 //Applied microbiology and biotechnology, vol. 58 (3), 275-285, 2002.
6. Романова А.Б, Самарина Е.А., Баурин Д.В. Получение белковых ферментолизатов шрота подсолнечника // Успехи в химии и химической технологии. 2013. №9 (149).
7. Brown J.H. The formol titration of bacteriological media // J. Bacteriol. American Society for Microbiology (ASM), vol. 8 (3), 245, 1923.
8. Karetkin B. A. et al. New Integrated Technology Of Probiotics Production Using Cereal Hydrolysates //International Multidisciplinary Scientific GeoConference: SGEM: Surveying Geology & mining Ecology Management, vo. 18, 393-400, 2018.
9. Baron F. et al. Rapid and cost-effective method for microorganism enumeration based on miniaturization of the conventional plate-counting technique //Le Lait, vol. 86 (3), 251-257, 2006.
10. Miller G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar //Analytical chemistry, vol. 31 (3), 426-428, 1959.
