CC BY
37ОБЗОРЫ
Научный обзор
https://doi.org/10.36233/0372-9311-33
Гетерогенность в изогенных популяциях бактерий и современные технологии клеточного фенотипирования
Андрюков Б.ГЛ Тимченко Н.Ф., Ляпун И.Н., Бынина М.П., Матосова Е.В.
НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток, Россия
Аннотация
В рамках современной микробиологической парадигмы колонии генетически идентичных микроорганизмов рассматриваются как биосоциальные системы, состоящие из нескольких гетерогенных клональных кластеров клеток (фенотипов бактерий), которые по-разному реагируют на изменения в окружающей среде. За последние десятилетия фенотипическая гетерогенность обнаружена во всех изогенных популяциях патогенных бактерий. Она обеспечивает избирательное преимущество клеточных фенотипов при изменениях физико-химических параметров среды обитания и конкурентном взаимодействии с другими микроорганизмами. Установлено, что данной адаптационной стратегией бактерий управляют разнообразные механизмы вне- и внутриклеточного генеза. Гетерогенность в бактериальных сообществах имеет большое значение для выживания патогенных бактерий в организме-хозяине, прогрессирования и персистенции инфекций, а также снижения эффективности антибиотикотерапии. Современный спектр аналитических инструментов для изучения клеточного фенотипирования представлен как методами оптической визуализации и качественной структурной характеристики одиночных клеток, так и омиксными технологиями количественного анализа и мониторинга молекулярных внутриклеточных процессов. Эти разнообразные инструменты позволяют не только выявлять и модулировать фенотипическую гетерогенность в изогенных популяциях бактерий, но и оценивать функциональную значимость клеточных фенотипов для развития инфекционного процесса. Целью обзора является интеграция современных представлений о гетерогенности в изогенных популяциях бактерий с акцентом на представлении современных аналитических технологий оценки и мониторинга фенотипирования одиночных клеток.
Ключевые слова: бактерии, изогенные популяции, фенотипическая гетерогенность, клеточное фе-нотипирование, современные технологии, одиночные клетки
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания по теме НИР № 0545-2019-0007 «Молекулярные механизмы образования устойчивых некультивируемых форм бактерий». Для цитирования: Андрюков Б.Г., Тимченко Н.Ф., Ляпун И.Н., Бынина М.П., Матосова Е.В. Гетерогенность в изогенных популяциях бактерий и современные технологии клеточного фенотипирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021; 98(1): 73-83. https://doi.org/10.36233/0372-9311-33
Review article
https://doi.org/10.36233/0372-9311-33
Heterogeneity in isogenic bacteria populations and modern technologies of cell phenotyping
Boris G. Andryukov^, Nelly F. Timchenko, Irina N. Lyapun, Marina P. Bynina, Ekaterina V. Matosova
Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia
Abstract
In the framework of the modern microbiological paradigm, colonies of genetically identical microorganisms are considered as biosocial systems consisting of several heterogeneous clonal cell clusters (bacterial phenotypes) that respond differently to changes in the environment. Phenotypic heterogeneity was found in recent decades in all isogenic populations of pathogenic bacteria. Such heterogeneity provides a selective advantage of cellular phenotypes with changes in the physicochemical parameters of the environment and competitive interaction with other microorganisms. Heterogeneity in bacterial communities is of great importance for the survival of pathogenic bacteria in the host organism, the progression and persistence of infections, as well as the decrease in the effectiveness of antibiotic therapy. The modern spectrum of analytical tools for studying cellular phenotyping is presented both by optical imaging methods and qualitative structural characteristics of single cells, and by omix technologies of quantitative analysis and monitoring of molecular intracellular processes. These diverse tools make
Щ Check for updates
© Коллектив авторов, 2021
REVIEWS
it possible not only to identify and modulate phenotypic heterogeneity in isogenic bacterial populations, but also to evaluate the functional significance of cellular phenotypes in the development of the infectious process. The aim of the review is the integration of modern concepts of heterogeneity in isogenic bacterial populations, with an emphasis on the presentation of modern analytical technologies for assessing and monitoring phenotypic typing of single cells.
Keywords: bacteria, isogenic populations, phenotypic heterogeneity, cell phenotyping, modern technologies, single cells
Funding. The work was carried out within the framework of the state assignment on the topic of research work No. 0545-2019-0007 "Molecular mechanisms of the formation of stable uncultivated forms of bacteria." For citation: Andryukov B.G., Timchenko N.F., Lyapun I.N., Bynina M.P., Matosova E.V. Heterogeneity in isogenic bacteria populations and modern technologies of cell phenotyping. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2021;98(1):73-83. https://doi.org/10.36233/0372-9311-33
Введение
Бактериальные колонии традиционно рассматривались как клональные популяции идентичных клеток, которые обладают схожими морфологическими, биохимическими и генетическими свойствами и патогномоничными признаками для их идентификации. Неслучайно для фундаментальных исследований по классической генетике и физиологии обычно использовали колониальные и периодические культуры бактерий, исходя из предположения о популяционной идентичности всех клеток [1-3].
С позиции современной микробиологической парадигмы колонии микроорганизмов рассматриваются как биосоциальные системы, состоящие из нескольких гетерогенных клональных кластеров клеток (фенотипов бактерий) [1, 3, 4]. В последние десятилетия четко обозначилась тенденция системного подхода в изучении биологических явлений и процессов в бактериях, включая транскриптомику, протеомику и метаболомику одиночных клеток. В связи с этим повысилась актуальность интеграции регуляторных (фенотипических) и мутационных (генетических) адаптационных реакций бактерий на изменившиеся условия окружающей среды, а также комплексного исследования гетерогенности этих трансформаций и их вклада в эволюцию [5, 6].
Для сохранения жизнеспособности отдельных бактерий и всей популяции, обитающих в меняющихся условиях окружающей среды, формирование гетерогенных фенотипов имеет большое значение благодаря расширению спектра используемых адаптационных стратегий [2, 3, 6]. Таким образом, значение фенотипической гетерогенности в изоген-ных популяциях патогенных бактерий заключается в регуляции экспрессии генов, развитии инфекционного процесса и формировании резистентности к антибиотикам [3, 7].
Однако, несмотря на интенсивные исследования гетерогенности в последние десятилетия, еще остаются вопросы, связанные с раскрытием механизмов, ответственных за формирование диверсификаций в популяциях, а также процессов
их регуляции микробным сообществом [3, 4, 6, 8]. До настоящего времени сохранилось несоответствие между механистическим пониманием гетерогенности и использованием аналитических инструментов для мониторинга и оценки этого явления на уровне отдельных клеток [3, 6, 9, 10].
Целью обзора является интеграция современных концепций гетерогенности в изогенных популяциях бактерий с акцентом на представлении современных аналитических технологий оценки и мониторинга фенотипирования одиночных клеток.
Фенотипическая гетерогенность изогенных популяций бактерий
Гетерогенность (пластичность, диверсификация) в изогенной популяции проявляется в различиях свойств отдельных фенотипов бактериальных клеток. Она может быть представлена би(мульти) модальным распределением морфофизиологиче-ских параметров клеток: формы, размера, структуры, скорости роста, активности метаболизма и др. [5, 11]. Различия в фенотипах симпатрических изо-генных популяций обычно имеют характер гауссова распределения и изучаются на уровне отдельных клеток [8, 12-14].
Следовательно, основные характеристики видов бактерий, полученные в ходе изучения популяций традиционными микробиологическими или аналитическими методами, носят усредненный характер и не способны в полной мере отобразить величину гетерогенности [6, 7, 14].
Ранее считалось, что единственным источником биологического разнообразия являются генетические мутации, которые опосредуют эволюцию. С позиции современной концепции фенотипиче-ской гетерогенности популяции эволюция является результатом естественного отбора, действующего на различные клеточные фенотипы бактерий. Они определяются как жесткой базовой последовательностью генома, так и более пластичными паттернами экспрессии отдельных генов [8, 9, 15-17].
Обоснование такой концепции связано с многочисленными примерами участия фенотипических адаптационных реакций в эпигенетическом насле-
ОБЗОРЫ
довании и клеточной регуляции репарации ДНК [8, 18], с влиянием на персистенцию бактерий стохастических и детерминированных процессов [9, 15], повышающих потенциал жизнеспособности бактерий и сохранения популяции.
Например, способность бактерий выживать при воздействии антибиотиков без мутации (фенотипи-ческая резистентность) традиционно рассматривается как следствие бактериальной реакции на сигналы окружающей среды [15, 19]. Однако эта устойчивость может возникнуть и в отсутствие внешних раздражителей. Межклеточные флуктуации и стохастические процессы формируют гетерогенность в микробной популяции. Это связано с появлением ненаследуемо-го клеточного фенотипа устойчивых некультивируе-мых клеток, которые обладают резистентностью к любому классу антибиотиков и способностью ограничивать эффективность лечения [19].
В отличие от генетической изменчивости, связанной с необратимыми мутациями, фенотипи-ческая гетерогенность является следствием бактериального ответа на случайные модуляции параметров окружающей среды, старение клеток, межклеточное взаимодействие, а также стохастичность («биологический шум») в экспрессии генов.
Взаимодействуя друг с другом, данные причины модулируют диверсификацию ответов в бактериальных субпопуляциях. Специфический ответ клеточного фенотипа может влиять на жизнеспособность или устойчивость культуры при изменившихся условиях окружающей среды. Это может быть исследовано с учетом специфики ответной реакции [6, 7, 20-23].
Динамическое развитие и применение современных аналитических технологий с более высоким пространственно-временным разрешением позволяет маркировать, сортировать и проводить избирательные исследования гетерогенных фенотипов в сочетании с методами анализа одиночных клеток (фенотипированием). Это дает возможность не только обнаружить и модулировать фенотипиче-скую гетерогенность в бактериальных популяциях, но и оценить ее функциональную значимость в развитии инфекционного процесса. Кроме того, полученные сведения помогут обеспечить целевое применение инновационных антимикробных стратегий [20, 21, 23, 24].
Современные аналитические технологии фенотипирования для мониторинга и оценки гетерогенности в популяциях бактерий
Фенотипическая гетерогенность бактериальных популяций является ключевым фактором формирования устойчивости патогенов к антимикробным средствам и возникновения инфекций. Поэто-
му в последние годы использование традиционных методов изучения биологических свойств бактерий, оценивающих их общие популяционные характеристики, устарело [20]. Однако количественная молекулярная характеристика негенетических фенотипов и их типирование в бактериальных популяциях стали возможными относительно недавно, с развитием современных аналитических технологий визуализации и анализа из арсенала микробиологии одиночных клеток [25-27].
С конца ХХ в. спектр методов, доступных для изучения гетерогенности биологических процессов в одиночных клетках, постоянно расширяется. Примерами хорошо охарактеризованных и изученных бактериальных фенотипов служат дормантные клеточные формы [7, 24], субтипы Bacillus cereus, которые являются продуцентами цитотоксина К [28], и подгруппы клеток в культуре Salmonella typhimurium, экспрессирующие флагеллин [29].
Развитие аналитических технологий феноти-пирования шло параллельно с совершенствованием методов выделения и иммобилизации одиночных клеток для исследования. Сегодня используемые для этого экспериментальные инструменты включают как традиционные приемы (серийные разведения, физическое улавливание) и относительно новые (работа с проточной суспензией, флюоресцентная сортировка), так и современные технологии (применение микрофлюидных устройств, магнитной сепарации) [9, 10, 25].
Совершенствование приёмов мониторинга и оценки фенотипической гетерогенности в бактериальных популяциях шло по пути повышения чувствительности и производительности методов. Эти инструменты позволяли за короткое время исследовать большое количество (десятки тысяч) одиночных клеток и получать количественные результаты, позволяющие установить связь между гетерогенностью популяций и функциональностью фенотипов [9, 30].
Современный спектр аналитических инструментов клеточного фенотипирования представлен методами оптической визуализации, которые позволяют исследовать качественные (структурные) характеристики одиночных клеток, и омиксными технологиями количественного анализа и мониторинга молекулярных внутриклеточных процессов [10, 12, 30].
В общем виде развитие аналитических технологий фенотипирования клеток арсенала SCM шло в четырех направлениях (рисунок):
• биофизическая характеристика клеток;
• оценка экспрессии отдельных генов;
• анализ специфических белков;
• исследование метаболитов.
В 2021 г. будет 45 лет, как T. Hirschfeld и его коллеги впервые приобрели опыт успешного при-
REVIEWS
Рамановская спектроскопия
Raman spectroscopy Времяпролётная масс-спектрометрия
Time-of-flight mass spectrometry
Инфракрасная спектроскопия (Фурье)
Fourier-transform infrared spectroscopy
Магнитно-резонансная спектроскопия с высоким разрешением
High-resolution magnetic resonance spectroscopy
Секвенирование РНК
RNA sequencing
Флюоресцентная гибридизация in situ
Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени
Real-time RT-PCR
Флюоресцентная покадровая микроскопия (использование репортерных систем)
Time-lapse fluorescence microscopy
(using reporting systems)
Оптическая микроскопия / Optical microscopy Проточная цитометрия / Flow cytometry Рамановская спектроскопия / Raman spectroscopy
Трансмиссионная электронная микроскопия
Transmission electron microscopy
Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса
Surface plasmon resonance spectroscopy
Поверхностная плазмонно-резонансная микроскопия
Surface plasmon resonance microscopy
Анализ метаболитов (внутриклеточных и внеклеточных) одиночных клеток Analysis of metabolites (intracellular and extracellular) of the Individual cells
Информация об избытке секреции белка или белок-белковом взаимодействии Information on excess of protein secretion or protein-protein interaction
Проточная цитометрия
Flow cytometry
Рамановская спектроскопия
Raman spectroscopy
Времяпролётная масс-спекгрометрия
Time-of-flight mass spectrometry
Дают информацию о состоянии экспрессии определенных генов, динамике синтеза белков Information on condition of certain genes expression and dynamics of proteins synthesis
Оценка размера, массы, объёма, внутренней структуры отдельных клеток, механических свойств Estimating size, mass, volume, internal structure of the individual cells, mechanical properties
Современные технологии фенотипирования для мониторинга и оценки гетерогенности бактериальных популяций. Modern phenotypic technologies for monitoring and evaluating heterogeneity in bacterial populations.
менения количественной оптической визуализации цитоплазматических белковых молекул Escherichia coli [12]. Тем самым динамическая природа внутриклеточных молекулярных процессов в различных условиях роста, физиологии и стресса бактерий впервые была подтверждена экспериментально на уровне отдельных клеток, а новая технология и ее авторы оказались у истоков зарождения протеоми-ки [12, 31, 32].
Это исследование явилось ключевым в развитии аналитических технологий количественной оптической визуализации гетерогенности биологических процессов в бактериальной клетке, что стало началом новой эпохи в молекулярной микробиологии [31, 32].
Чаще всего в современных исследованиях для фенотипирования применяются специализированные репортерные штаммы и флюоресцентные красители. Изучение микро- и наноразмерных паттернов одиночных клеток бактерий и мониторинг их функциональности с высоким временным и пространственным разрешением позволяют измерять количество копий мРНК или молекул специфических белков в режиме реального времени [31-33]. Более того, сочетание современных оптических методов с микрофлюидными технологиями дает возможность
получать количественные сведения о биологических процессах, происходящих в отдельных бактериальных клетках в условиях стресса [9, 10, 34].
Так, G. Manina с коллегами [34] для исследования взаимосвязи между скоростью роста M. tuberculosis и продукцией рибосом в отдельных клетках сконструировали репортерный штамм со встроенным в локус рибосомальной РНК геном, который кодирует дестабилизированный зеленый флюоресцентный белок. Используя покадровую микроскопию и микрофлюидное устройство, авторы изучили внутриклеточную динамику экспрессии рРНК in vitro и in vivo. Эти исследования подтвердили возможность формирования высокой гетерогенности бактерий в изогенной популяции под влиянием внешних раздражителей.
За годы использования эти методы успели завоевать популярность среди исследователей, однако необходимость использования зонда для визуализации ограничивает получаемый объем информации по сравнению с инновационными омиксными клеточными технологиями SCM [31, 33, 35-37].
Среди лазерных инструментов из арсенала технологий SCM, чаще всего используемых для оценки клеточных фенотипов в бактериальных популяциях, наибольшую популярность завоевали
ОБЗОРЫ
проточная цитометрия (ПЦ) и рамановская спектрометрия (РС) комбинационного рассеяния [4, 9, 10, 25, 27, 36].
Принцип работы проточного цитометра основан на обнаружении двух типов свечения: рассеянного и флюоресцентного от одиночной клетки в суспензии. Рассеянное лазерное излучение предоставляет информацию об основных биологических характеристиках клеток (размере, форме, внутриклеточных свойствах, мембранном потенциале). Флюоресценция дает сведения о специфических физиологических свойствах клеточных фенотипов, окрашенных соответствующими комбинациями флюорохромных красителей (содержание ДНК, метаболическая активность, рН, жизнеспособность и др.) [9, 10, 38-40].
Многолетнее использование ПЦ для изучения гетерогенности в микробных популяциях выявило ряд существенных преимуществ метода: экономичность, точность, чувствительность, способность анализировать тысячи клеток за секунду [14, 20, 27]. Этот аналитический инструмент стал незаменимым для изучения фенотипирования небольших по численности клеточных субпопуляций — от оценки изменений функций и метаболической активности до идентификации генов, экспрессируемых в определенных условиях [20, 27, 38].
Несмотря на то что образцы исследуемых культур требуют предварительного посева и выделения, использование ПЦ позволяет получить результаты в реальном времени за относительно короткий срок [14, 38]. Это связано со скоростью оценки внутриклеточных молекулярно-биологических процессов в отдельных клетках в динамических условиях и с высоким разрешением, а также с получением большого разнообразия количественных данных [14, 27, 38].
Однако при использовании ПЦ для феноти-пирования популяций были выявлены некоторые ограничения, связанные с неоднозначностью результатов, полученных на разных анализаторах, а также зависимость качества исследований от способа пробоподготовки [20, 38, 39].
Прогресс в изучении гетерогенности бактериальных популяций достигнут благодаря использованию нескольких технологий, основанных на различных биофизических принципах детекции. Спектр комбинационного рассеяния электромагнитных волн, получаемый при РС, с каждым годом привлекает все большее внимание специалистов различных профилей, в том числе молекулярных микробиологов [27, 36, 37, 40].
Эта высокоинформативная технология позволяет получить информацию о макромолекулярной структуре одиночной бактериальной клетки (белки, нуклеиновые кислоты, липиды и др.) в виде биохимического отпечатка [36, 40], а также оценить ак-
тивность метаболизма и степень жизнеспособности каждого гетерогенного фенотипа [27, 40].
В ходе недавнего исследования С. Garcia-Timermans с бельгийскими коллегами [27] провели сравнительный анализ использования ПЦ и РС для изучения фенотипической гетерогенности в периодических бактериальных культурах E. coli. Авторы пришли к выводу, что ПЦ рационально использовать для количественной оценки фенотипической неоднородности на уровне популяции, а РС — для более глубокого анализа гетерогенности отдельных клеток, поскольку эта технология позволяет получить информацию о состоянии их функциональности в связи с макромолекулярной структурой.
Другой лазерный метод — инфракрасная Фурье-спектроскопия (FT-IR) — дает похожую информацию, но в его основе лежит поглощение энергии асимметричными функциональными группами внутриклеточных биомолекул [41] (таблица).
В последние годы при исследовании гетерогенности широкую популярность получили методы одноклеточной транскриптомики (субтранскрипто-мики), которые предоставляют количественную информацию о фенотипической экспрессии генов. Среди первых исследователей, которые экспериментально доказали связь генотипа с фенотипом на уровне одиночных клеток, были M.B. Elowitz с коллегами. Они показали полезность исследования уровней генных продуктов, РНК-мессенджеров для типирования отдельных клеток [47].
Например, благодаря применению аналитических инструментов из арсенала SCM M.B. Elowitz с коллегами [47] смогли провести важное экспериментальное исследование, в котором была количественно измерена стохастичность экспрессии генов на уровне отдельных клеток E. coli и отдельных молекул. В результате получены данные, позволяющие оценить многообразие стратегий, используемых на клеточном уровне для формирования гетерогенности в популяции.
Для проведения современных субтранскрип-томных исследований используют технологию дифференциального анализа экспрессии генов, которая была инициирована созданием ДНК-микрочипов, или микрофлюидных устройств [48]. Это позволяет с помощью высокопроизводительных методов секве-нирования РНК обнаружить около 85% транскрипто-ма c разделением на три фракции: не зависящую от скорости роста, предназначенную для синтеза белка и для метаболических ферментов [20, 49, 50].
Последующие исследования [4, 9, 10] расширили возможность использования технологий SCM для количественной оценки молекулярных характеристик фенотипических вариаций в популяциях микроорганизмов. Например, в последние годы все большей популярностью для исследования фенотипической гетерогенности бактерий
REVIEWS
Примеры использования современных технологий из арсенала SCM для фенотипирования бактериальных популяций
Examples of using modern technologies from the Single Cell Microbiology (SCM) arsenal for phenotypic of bacterial populations
Технологии SCM Принцип метода Получаемая информация Источник
SCM technologies Method's principle Information obtained Source
Трансмиссионная электронная микроскопия Transmission electron microscopy
Атомно-силовая микроскопия Atomic force microscopy
Флюоресцентная микроскопия Fluorescence microscopy
Конфокальная флюоресцентная микроскопия Confocal fluorescence microscopy
Поверхностный плазмонный резонанс Surface plasmon resonance
Получение изображения ультратонкого образца путём пропускания через него
пучка электронов (Л = 0,005 нм) Image acquisition of an ultrathin sample by transmission of an electron beam through it (Л = 0.005 nm)
Сканирующий зондовый микроскоп, основанный на ван-дер-ваальсовых взаимодействиях зонда с поверхностью образца Scanning probe microscope based on van der Waals interactions of the probe with the sample surface
Визуализация изображения с использованием люминесценции возбуждённых
атомов и молекул объектов Image visualization using luminescence of excited atoms and molecules of objects
Визуализация изображения биологических структур с использованием флюорофоров Imaging of biological structures using fluorophores
Возбуждение поверхностного плазмона на его резонансной частоте внешней электромагнитной волной Excitation of a surface plasmon at its resonant frequency by an external electromagnetic wave
Проточная Обнаружение рассеянного света
цитометрия и флюоресценции от одиночной клетки
Flow cytometry Detection of scattered light and fluorescence
from a single cell
Визуализация субклеточных структур одиночных [42] клеток бактерий и их связи с функцией фенотипов Visualization of subcellular structures of single bacterial cells and their relationship with the function of phenotypes
Количественная оценка наномеханических свойств [16] поверхности клеточной стенки, адгезии, морфологии, упругости (модуль Юнга) Quantitative assessment of nanomechanical properties of the cell wall surface, adhesion, morphology, elasticity (Young's modulus)
Картирование микрогетерогенности pH, [17, 21]
локальной концентрации ионов, электрического потенциала клетки Mapping of microheterogeneity of pH, local ion concentration, cell electrical potential
Трёхмерная флюоресцентная томография [21]
одиночных клеток бактерий 3D-fluorescence tomography of single bacterial cells
Измерение кинетики связывания взаимодействий [43, 44] лигандов с отдельными клетками; статистический анализ гетерогенности в популяции Measurement of the kinetics of binding of ligand interactions with individual cells; statistical analysis of heterogeneity in a population
Основные характеристики клеток и специфические [9, 14, 20, физиологические свойства (рН, метаболизм и др.) 27, 38, 39] The main characteristics of cells and specific physiological properties (pH, metabolism, etc.)
РС комбинационного рассеяния Raman spectroscopy of Raman scattering
Инфракрасная Фурье-спектроскопия Fourier transform infrared spectroscopy
Флюоресцентное разведение Fluorescence dilution
Магнитно-резонансная спектроскопия с высоким разрешением High-resolution magnetic resonance spectroscopy
Способность молекул к неупругому (рамановскому) рассеянию монохроматического света The ability of molecules to inelastic (Raman) scattering of monochromatic light
Поглощение энергии асимметричными функциональными группами внутриклеточных биомолекул Energy absorption by asymmetric functional groups of intracellular biomolecules
Разбавление предварительно сформированного пула флюоресцентного белка после остановки его индукции Dilution of a preformed pool of fluorescent protein after stopping its induction
Атомы Н- обладают квантовым свойством вращения, генерируя радиочастотные сигналы. При использовании мощного магнитного поля возникают спектры высокого разрешения H- atoms have a quantum property of rotation, generating radio frequency signals. When using a powerful magnetic field, high-resolution spectra appear
Анализ макромолекулярного состава бактерий в виде биохимического отпечатка одиночной клетки Analysis of the macromolecular composition of bacteria in the form of a biochemical imprint of a single cell
[20, 27, 36, 37, 40]
Создание метаболических отпечатков бактерий [41] до уровня подвида. Выявление тонких изменений в биохимических фенотипах бактерий Creating metabolic imprints of bacteria to the level of a subspecies. Identification of subtle changes in the biochemical phenotypes of bacteria
Изучение динамики внутриклеточной репликации [19] бактерий на уровне отдельных клеток Studying the dynamics of intracellular bacterial replication at the level of individual cells
Ассоциации между метаболитами и клеточными [45, 46] процессами в живых одиночных клетках бактерий. Дает количественную характеристику метаболического профиля клеток и их поверхностных структур при физиологическом состоянии и стрессе Associations between metabolites and cellular
processes in living single bacterial cells. Gives a quantitative description of the metabolic profile of cells and their surface structures under physiological condition and stress
ОБЗОРЫ
пользуются спектроскопия поверхностного плаз-монного резонанса (СПР) и ее разновидность — поверхностная плазмонно-резонансная микроскопия (ППРМ) [43, 44, 46].
Эти неинвазивные аналитические технологии не вызывают цитолиз и позволяют проводить про-теомный анализ на уровне отдельных клеток: сортировку и обнаружение отдельных белков [26, 48]. Кроме того, благодаря возможности визуализировать отдельные субклеточные объекты нано- и микрометрового масштаба и при этом сохранять исходное состояние целевого аналита, сегодня ППРМ стала универсальной сенсорной платформой для изучения кинетики биомолекулярного связывания [43, 44].
СПР — поверхностно-чувствительный метод без меток, который можно использовать для определения показателя преломления материала на тонкой металлической поверхности [43, 44, 46]. Он основан на колебании свободных электронов, индуцированном электромагнитной волной на границе раздела металл-диэлектрик. Эти электронные колебания генерируют поверхностные электромагнитные волны (так называемые плазмонные поляритоны), распространяющиеся и экспоненциально затухающие на границе раздела сред. СПР используют для исследования связывания олигонуклеотидов ДНК или белков по изменению угла минимальной отражательной способности [43, 46].
К. Syal с коллегами [43] продемонстрировали возможности метода плазмонной визуализации на примере исследования изогенной популяции E. coli O157:H7. Авторами была показана возможность получения в реальном времени кинетических констант связывания одиночных живых клеток бактерий со специфическими антителами IgG и количественного определения гетерогенности в микробной популяции.
Таким образом, современный спектр используемых аналитических технологий для мониторинга и оценки гетерогенности популяций бактерий достаточно многообразен и продолжает непрерывно совершенствоваться. Выбор методов зависит от поставленных целей и решаемых задач. Однако широкий выбор используемых аналитических инструментов для фенотипирования бактериальных популяций наводит на мысль о наличии методологической проблемы — отсутствия стандартизированного подхода при изучении этого важного биологического явления [4, 10].
В последние годы наблюдается увеличение количества исследований, направленных на изучение этапов формирования клеточных фенотипов в окружающей среде. Однако роль микробной гетерогенности в патогенезе и механизмах, лежащих в основе адаптации патогенов к среде организма-хозяина, пока редко рассматривается с использованием одноклеточных подходов в реальном времени.
Заключение
Фенотипическая гетерогенность в генетически идентичной популяции патогенных бактерий имеет решающее значение для адаптации микроорганизмов в период инфекционного процесса и развития их устойчивости к антибиотикам. Изучение и мониторинг формирования диверсификаций в изо-генных популяциях патогенных бактерий, помимо фундаментальных знаний о механизмах, лежащих в основе этого биологического феномена, предоставляет значимую информацию об этой важной и недооцененной стратегии вирулентности [51-53].
Традиционные схемы лечения, основанные на широком использовании антибиотиков, оказываются все менее эффективными для лечения хронических и персистирующих инфекций. Изучение механизмов формирования клеточных фенотипов в популяциях конкретных видов и штаммов патогенных микроорганизмов имеет значение и для современной ориентации медицины на персонифицированное лечение [54, 55].
Современные аналитические технологии, используемые для изучения динамики молекулярных трансформаций на уровнях как одиночных клеток, так и всей бактериальной популяции, становятся все более информативными и чувствительными. Например, в основе недавно разработанной технологии Persister-FACSeq лежит комбинированный метод флюоресцентной сортировки и секвенирова-ния нового поколения. Это позволяет изучать механизм возникновения устойчивости к антибиотикам у некультивируемых клеток-персистеров в популяции E. coli путем изучения экспрессии генов и синтеза специфического белка [54].
Полученные за последние годы знания о фено-типической гетерогенности в бактериальных популяциях пока недостаточны для управления сообществами микроорганизмов. Возможно, более широкое применение омиксных технологий типирования расширит понимание молекулярно-биологических процессов на уровне отдельных клеток и даст возможность прогнозирования и контроля влияния устойчивых фенотипов патогенных бактерий на развитие инфекций, их вирулентность и резистентность к антимикробной терапии.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Oleskin A.V., Botvinko I.V., Tsavkelova E.A. Colonial organization and intercellular communication in microorganisms. Microbiology (Mikrobiologiya). 2000; 69(3): 249-65. https://doi.org/10.1007/BF02756730
2. Магданова Л.А., Голясная Н.В. Гетерогенность как адаптивное свойство бактериальной популяции. Микробиология. 2013; 82(1): 3-13.
https://doi.org/10.7868/S0026365613010072
3. Sánchez-Romero M.A., Casadesús J. Contribution of pheno-typic heterogeneity to adaptive antibiotic resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111(1): 355-60. https://doi.org/10.1073/pnas.1316084111
4. Heyse J., Buysschaert B., Props R., Rubbens P., Skirtach A.G., Waegeman W., et al. Coculturing bacteria leads to reduced phe-notypic heterogeneities. Appl. Environ. Microbiol. 2019; 85(8): e02814-18. https://doi.org/10.1128/AEM.02814-18
5. Jeanson S., Floury J., Gagnaire V., Lortal S., Thierry A. Bacterial colonies in solid media and foods: a review on their growth and interactions with the micro-environment. Front. Microbiol. 2015; 6: 1284. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01284
6. Ryall B., Eydallin G., Ferenci T. Culture history and population heterogeneity as determinants of bacterial adaptation: the adap-tomics of a single environmental transition. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012; 76(3): 597-25. https://doi.org/10.1128/MMBR.05028-11
7. Dhar N., McKinney J.D. Microbial phenotypic heterogeneity and antibiotic tolerance. Curr. Opin. Microbiol. 2007; 10(1): 30-8. https://doi.org/10.1016ZJ.MIB.2006.12.007
8. Ackermann M. A functional perspective on phenotypic heterogeneity in microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 2015; 13(8): 497-08. https://doi.org/10.1038/nrmicro3491
9. Davis K.M., Isberg R.R. Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches. Bioessays. 2016; 38(8): 782-90. https://doi.org/10.1002/bies.201500121
10. Gonzalez-Cabaleiro R., Mitchell A.M., Smith W., Wipat A., Ofiteru I.D. Heterogeneity in pure microbial systems: experimental measurements and modeling. Front. Microbiol. 2017; 8: 1813. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01813
11. Tsimring L.S. Noise in biology. Reports. Prog. Phys. 2014; 77(2): 26601. https://doi.org/10.1093/nar/gkw273
12. Li G.W., Xie X.S. Central dogma at the single-molecule level in living cells. Nature. 2011; 475(7356): 308-15. https://doi.org/10.1038/nature10315
13. Govers S.K., Adam A., Blockeel H., Aertsen A. Rapid phenotypic individualization of bacterial sister cells. Sci. Rep. 2017; 7(1): 1-9. https://doi.org/10.1038/s41598-017-08660-0
14. Heins A.L., Johanson T., Han S., Lundin L., Carlquist M., Ger-naey K.V., et al. A quantitative flow cytometry to understand population heterogeneity in response to changes in substrate availability in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae chemostats. Front. Bioeng. Biotechnol. 2019; 7: 187. https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00187
15. Lewis K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 2010; 64: 35772. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.112408.134306
16. Dorobantu L.S., Bhattacharjee S., Foght J.M., Gray M.R. Atomic force microscopy measurement of heterogeneity in bacterial surface hydrophobicity. Langmuir. 2008; 24(9): 4944-51. https://doi.org/10.1021/la7035295
17. Cao H., Kuipers O.P. Influence of global gene regulatory networks on single cell heterogeneity of green fluorescent protein production in Bacillus subtilis. Microb. Cell. Fact. 2018; 17(1): 134. https://doi.org/10.1186/s12934-018-0985-9
18. Stracy M., Uphoff S., Garza de Leon F., Kapanidis A.N. In vivo single-molecule imaging of bacterial DNA replication, transcription, and repair. FEBSLett. 2014; 588(19): 3585-94. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2014.05.026
19. Helaine S., Cheverton A.M., Watson K.G., Faure L.M., Matthews S.A., Holden D.W. Internalization of Salmonella by macrophages induces formation of nonreplicating persisters. Science. 2014; 343(6167): 204-08. https://doi.org/10.1126/science.1244705
20. Ambriz-Avina V., Contreras-Garduno J.A., Pedraza-Reyes M. Applications of flow cytometry to characterize bacterial physiological responses. Biomed. Res. Int. 2014; 2014: 461941. https://doi.org/10.1155/2014/461941
21. Burdikova Z., Svindrych Z., Pala J., Hickey C.D., Wilkinson M.G., Panek J., et al. Measurement of pH micro-heterogeneity in natural cheese matrices by fluorescence lifetime imaging. Front. Microbiol. 2015; 6: 183. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00183
REVIEWS
22. Han Y., Zhang F. Heterogeneity coordinates bacterial multigene expression in single cells. PLoS Comput. Biol. 2020; 16(1): e1007643. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007643
23. Casadesus J., Low D.A. Programmed heterogeneity: epigenetic mechanisms in bacteria. J. Biol. Chem. 2013; 288(20): 13929— 35. https://doi.org/10.1074/jbc.R113.472274
24. Андрюков Б.Г., Сомова Л.М., Матосова Е.В., Ляпун И.Н. Фенотипическая пластичность бактерий как стратегия резистентности и объект современных антимикробных технологий (обзор). Современные технологии в медицине. 2019; 11(2): 164-82. http://doi.org/10.17691/stm2019.11.2.22
25. Brehm-Stecher B.F., Johnson E.A. Single-cell microbiology: tools, technologies, and applications. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004; 68(3): 538-59.
https://doi.org/10.1128/MMBR.68.3.538-559.2004
26. Fritzsch F.S., Dusny C., Frick O., Schmid A. Single-cell analysis in biotechnology, systems biology, and biocatalysis. Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 2012; 3: 129-55. https://doi.org/10.1146/ annurev-chembioeng-062011-081056
27. Garcia-Timermans C., Rubbens P., Heyse J., Kerckhof F.M., Props R., Skirtach A.G., et al. Discriminating bacterial pheno-types at the population and single-cell level: a comparison of flow cytometry and raman spectroscopy fingerprinting. Cytometry A. 2020; 97(7): 713-26. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23952
28. Ceuppens S., Boon N., Uyttendaele M. Diversity of Bacillus cereus group strains is reflected in their broad range of pathogenicity and diverse ecological lifestyles. FEMS Microbiol. Ecol. 2013; 84(3): 433-50. https://doi.org/10.1111/1574-6941.12110
29. Stewart M.K., Cummings L.A., Johnson M.L., Berezow A.B., Cookson B.T. Regulation of phenotypic heterogeneity permits Salmonella evasion of the host caspase-1 inflammatory response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108(51): 20742-7. https://doi.org/10.1073/pnas.1108963108
30. Heins A.L., Weuster-Botz D. Population heterogeneity in mi-crobial bioprocesses: origin, analysis, mechanisms, and future perspectives. Bioprocess. Biosyst. Eng. 2018; 41(7): 889-16. https://doi.org/10.1007/s00449-018-1922-3
31. Xie X.S., Choi P.J., Li G.W., Lee N.K., Lia G. Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells. Annu. Rev Biophys. 2008; 37: 417-44.
https://doi.org/10.1146/annurev.biophys.37.092607.174640
32. Hinterdorfer P., Garcia-Parajo M.F., Dufrene Y.F. Single-molecule imaging of cell surfaces using near-field nanoscopy. Acc. Chem. Res. 2012; 45(3): 327-36. https://doi.org/10.1021/ar2001167
33. Skinner S.O., Sepulveda L.A., Xu H., Golding I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 2013; 8(6): 1100-13. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.066
34. Manina G., Dhar N., McKinney J.D. Stress and host immunity amplify Мycobacterium tuberculosis phenotypic heterogeneity and induce nongrowing metabolically active forms. Cell. Host. Microbe. 2015; 17(1): 32-46. https://doi.org/10.1016/jxhom.2014.11.016
35. Arbel-Goren R., Shapira Y., Stavans J. Method for labeling transcripts in individual Escherichia coli cells for single-molecule fluorescence in situ hybridization experiments. J. Vis. Exp. 2017; (130): 56600. https://doi.org/10.3791/56600
36. Read D.S., Woodcock D.J., Strachan N.J.C., Forbes K.J., Colles F.M., Maiden M.C.J., et al. Evidence for phenotypic plasticity among multihost Campylobacter jejuni and C. coli lineages, obtained using ribosomal multilocus sequence typing and Raman spectroscopy. Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79(3): 965-73.
https://doi.org/10.1128/AEM.02521-12
37. van de Vossenberg J., Tervahauta H., Maquelin K., Blok-ker-Koopmans C.H.W., Uytewaal-Aarts M., van der Kooij D., et al. Identification of bacteria in drinking water with Raman.
ОБЗОРЫ
Anal. Methods. 2013; 5(11): 2679-87. https://doi.org/10.1039/c3ay40289d
38. Davey H.M. Prospects for the automation of analysis and interpretation of flow cytometric data. Cytometry A. 2010; 77(1): 3-5. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20835
39. Davey H.M. Flow cytometric techniques for the detection of microorganisms. Methods. Cell. Sci. 2002; 24(1-3): 91-7. https://doi.org/10.1023/A:1024106317540
40. Андрюков Б.Г., Карпенко А.А., Матосова Е.В., Ля-пун И.Н. Рамановская спектроскопия — современная диагностическая технология для изучения и индикации возбудителей инфекций (обзор). Современные технологии в медицине. 2019; 11(4): 161-74. http://doi.oig/10.17691/stm2019.11A19
41. Wharfe E.S., Jarvis R.M., Winder C.L., Whiteley A.S., Gooda-cre R. Fourier transform infrared spectroscopy as a metabolite fingerprinting tool for monitoring the phenotypic changes in complex bacterial communities capable of degrading phenol. Environ. Microbiol. 2010; 12(12): 3253-63. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2010.02300.x
42. Shukla S., Bajpai V.K. Visual demonstration of transmission electron microscopy for intracellular observation of a single bacterial cell. Bangladesh J. Pharmacol. 2017; 12(1): 23-7. https://doi.org/10.3329/bjp.v12i1.31390
43. Syal K., Wang W., Shan X., Wang S., Chen H.Y., Tao N. Plas-monic imaging of protein interactions with single bacterial cells. Biosens. Bioelectron. 2015; 63: 131-7. https://doi.org/10.1016/j.bios.2014.06.069
44. Peterson A.W., Halter M., Tona A., Plant A.L., Elliott J.T. Mass measurements of focal adhesions in single cells using high resolution surface plasmon resonance microscopy. Proc. SPIE Int. Soc. Opt. Eng. 2018; 10509: 1050905. https://doi.org/10.1117/12.2290776
45. Righi V., Constantinou C., Kesarwani M., Rahme L.G., Tzi-ka A.A. Effects of a small, volatile bacterial molecule on Pseudomonas aeruginosa bacteria using whole cell high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectroscopy and genomics. Int. J. Mol. Med. 2018; 42(4): 2129-36. https://doi.org/10.3892/ijmm.2018.3760
46. Zhou X.L., Yang Y., Wang S., Liu X.W. Surface plasmon resonance microscopy: from single molecule sensing to single cell imaging. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2020; 59(5): 1776-85. https://doi.org/10.1002/anie.201908806
47. Elowitz M.B., Levine A.J., Siggia E.D., Swain P.S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 2002; 297(5584): 1183-6. https://doi.org/10.1126/science.1070919
48. Liu Y., Singh A.K. Microfluidic platforms for single cell protein analysis. J. Lab. Autom. 2013; 18(6): 446-54. https://doi.org/10.1177/22110-68213-494389
49. Cho S., Cho Y., Lee S., Kim J., Yum H., Kim S.C., et al. Current challenges in bacterial transcriptomics. Genomics. Inform. 2013; 11(2): 76-82. https://doi.org/10.5808/GI.2013.11.2.76
50. Shahrezaei V., Marguerat S. Connecting growth with gene expression: of noise and numbers. Curr. Opin. Microbiol. 2015; 25: 127-35. https://doi.org/10.1016/j.mib.2015.05.012
51. Schröter L., Dersch P. Phenotypic diversification of microbial pathogens - cooperating and preparing for the future. J. Mol. Biol. 2019; 431(23): 4645-55. https://doi.org/10.1016/jjmb.2019.06.024
52. Weigel W.A., Dersch P. Phenotypic heterogeneity: a bacterial virulence strategy. Microbes Infect. 2018; 20(9-10): 570-7. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2018.01.008
53. Mortier J., Tadesse W., Govers S.K., Aertsen A. Stress-induced protein aggregates shape population heterogeneity in bacteria. Curr. Genet. 2019; 65(4): 865-9. https://doi.org/10.1007/s00294-019-00947-1
54. Henry T.C., Brynildsen M.P. Development of Persister-FACSeq: a method to massively parallelize quantification of persister
physiology and its heterogeneity. Sci. Rep. 2016; 6: 25100. https://doi.org/10.1038/srep25100
55. Binder D., Drepper T., Jaeger K.E., Delvigne F., Wiechert W., Kohlheyer D., et al. Homogenizing bacterial cell factories: analysis and engineering of phenotypic heterogeneity. Metab. Eng. 2017; 42: 145-56. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2017.06.009
REFERENCES
1. Oleskin A.V., Botvinko I.V., Tsavkelova E.A. Colonial organization and intercellular communication in microorganisms. Microbiology (Mikrobiologiya). 2000; 69(3): 249-65. https://doi.org/10.1007/BF02756730
2. Magdanova L.A., Golyasnaya N.V. Heterogeneity as an adaptive trait of microbial populations. Microbiology (Mikrobiologiya). 2013; 82(1): 1-10. https://doi.org/10.1134/S0026261713010074
3. Sánchez-Romero M.A., Casadesús J. Contribution of phenotypic heterogeneity to adaptive antibiotic resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111(1): 355-60. https://doi.org/10.1073/pnas.1316084111
4. Heyse J., Buysschaert B., Props R., Rubbens P., Skirtach A.G., Waegeman W., et al. Coculturing bacteria leads to reduced phenotypic heterogeneities. Appl. Environ. Microbiol. 2019; 85(8): e02814-18. https://doi.org/10.1128/AEM.02814-18
5. Jeanson S., Floury J., Gagnaire V., Lortal S., Thierry A. Bacterial colonies in solid media and foods: a review on their growth and interactions with the micro-environment. Front. Microbiol. 2015; 6: 1284. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01284
6. Ryall B., Eydallin G., Ferenci T. Culture history and population heterogeneity as determinants of bacterial adaptation: the adap-tomics of a single environmental transition. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012; 76(3): 597-25. https://doi.org/10.1128/MMBR.05028-11
7. Dhar N., McKinney J.D. Microbial phenotypic heterogeneity and antibiotic tolerance. Curr. Opin. Microbiol. 2007; 10(1): 30-8. https://doi.org/10.1016ZJ.MIB.2006.12.007
8. Ackermann M. A functional perspective on phenotypic heterogeneity in microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 2015; 13(8): 497-08. https://doi.org/10.1038/nrmicro3491
9. Davis K.M., Isberg R.R. Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches. Bioessays. 2016; 38(8): 782-90. https://doi.org/10.1002/bies.201500121
10. González-Cabaleiro R., Mitchell A.M., Smith W., Wipat A., Ofiteru I.D. Heterogeneity in pure microbial systems: experimental measurements and modeling. Front. Microbiol. 2017; 8: 1813. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01813
11. Tsimring L.S. Noise in biology. Reports. Prog. Phys. 2014; 77(2): 26601. https://doi.org/10.1093/nar/gkw273
12. Li G.W., Xie X.S. Central dogma at the single-molecule level in living cells. Nature. 2011; 475(7356): 308-15. https://doi.org/10.1038/nature10315
13. Govers S.K., Adam A., Blockeel H., Aertsen A. Rapid phenotypic individualization of bacterial sister cells. Sci. Rep. 2017; 7(1): 1-9. https://doi.org/10.1038/s41598-017-08660-0
14. Heins A.L., Johanson T., Han S., Lundin L., Carlquist M., Ger-naey K.V., et al. A quantitative flow cytometry to understand population heterogeneity in response to changes in substrate availability in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae chemostats. Front. Bioeng. Biotechnol. 2019; 7: 187. https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00187
15. Lewis K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 2010; 64: 35772. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.112408.134306
16. Dorobantu L.S., Bhattacharjee S., Foght J.M., Gray M.R. Atomic force microscopy measurement of heterogeneity in bacterial surface hydrophobicity. Langmuir. 2008; 24(9): 4944-51. https://doi.org/10.1021/la7035295
17. Cao H., Kuipers O.P. Influence of global gene regulatory networks on single cell heterogeneity of green fluorescent protein
production in Bacillus subtilis. Microb. Cell. Fact. 2018; 17(1): 134. https://doi.org/10.1186/s12934-018-0985-9
18. Stracy M., Uphoff S., Garza de Leon F., Kapanidis A.N. In vivo single-molecule imaging of bacterial DNA replication, transcription, and repair. FEBSLett. 2014; 588(19): 3585-94. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2014.05.026
19. Helaine S., Cheverton A.M., Watson K.G., Faure L.M., Matthews S.A., Holden D.W. Internalization of Salmonella by macrophages induces formation of nonreplicating persisters. Science. 2014; 343(6167): 204-08. https://doi.org/10.1126/science.1244705
20. Ambriz-Avina V., Contreras-Garduno J.A., Pedraza-Reyes M. Applications of flow cytometry to characterize bacterial physiological responses. Biomed. Res. Int. 2014; 2014: 461941. https://doi.org/10.1155/2014/461941
21. Burdikova Z., Svindrych Z., Pala J., Hickey C.D., Wilkinson M.G., Panek J., et al. Measurement of pH micro-heterogeneity in natural cheese matrices by fluorescence lifetime imaging. Front. Microbiol. 2015; 6: 183. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00183
22. Han Y., Zhang F. Heterogeneity coordinates bacterial multigene expression in single cells. PLoS Comput. Biol. 2020; 16(1): e1007643. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007643
23. Casadesüs J., Low D.A. Programmed heterogeneity: epigenetic mechanisms in bacteria. J. Biol. Chem. 2013; 288(20): 1392935. https://doi.org/10.1074/jbc.R113.472274
24. Andryukov B.G., Somova L.M., Matosova E.V., Lyapun I.N. Phenotypic plasticity as a strategy of bacterial resistance and an object of advanced antimicrobial technologies (review). Sovre-mennye tekhnologii v meditsine. 2019; 11(2): 164-82. http://doi.org/10.17691/stm2019.1L2.22 (in Russian)
25. Brehm-Stecher B.F., Johnson E.A. Single-cell microbiology: tools, technologies, and applications. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004; 68(3): 538-59.
https://doi.org/10.1128/MMBR.68.3.538-559.2004
26. Fritzsch F.S., Dusny C., Frick O., Schmid A. Single-cell analysis in biotechnology, systems biology, and biocatalysis. Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 2012; 3: 129-55. https://doi.org/10.1146/annurev-chembioeng-062011-081056
27. Garcia-Timermans C., Rubbens P., Heyse J., Kerckhof F.M., Props R., Skirtach A.G., et al. Discriminating bacterial pheno-types at the population and single-cell level: a comparison of flow cytometry and raman spectroscopy fingerprinting. Cytometry A. 2020; 97(7): 713-26. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23952
28. Ceuppens S., Boon N., Uyttendaele M. Diversity of Bacillus cereus group strains is reflected in their broad range of pathogenicity and diverse ecological lifestyles. FEMS Microbiol. Ecol. 2013; 84(3): 433-50. https://doi.org/10.1111/1574-6941.12110
29. Stewart M.K., Cummings L.A., Johnson M.L., Berezow A.B., Cookson B.T. Regulation of phenotypic heterogeneity permits Salmonella evasion of the host caspase-1 inflammatory response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108(51): 20742-7. https://doi.org/10.1073/pnas.1108963108
30. Heins A.L., Weuster-Botz D. Population heterogeneity in mi-crobial bioprocesses: origin, analysis, mechanisms, and future perspectives. Bioprocess. Biosyst. Eng. 2018; 41(7): 889-16. https://doi.org/10.1007/s00449-018-1922-3
31. Xie X.S., Choi P. J., Li G.W., Lee N.K., Lia G. Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells. Annu. Rev. Biophys. 2008; 37: 417-44.
https://doi.org/10.1146/annurev.biophys.37.092607.174640
32. Hinterdorfer P., Garcia-Parajo M.F., Dufrene Y.F. Single-molecule imaging of cell surfaces using near-field nanoscopy. Acc. Chem. Res. 2012; 45(3): 327-36. https://doi.org/10.1021/ar2001167
33. Skinner S.O., Sepülveda L.A., Xu H., Golding I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using
REVIEWS
single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 2013; 8(6): 1100-13. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.066
34. Manina G., Dhar N., McKinney J.D. Stress and host immunity amplify Мycobacterium tuberculosis phenotypic heterogeneity and induce nongrowing metabolically active forms. Cell. Host. Microbe. 2015; 17(1): 32-46. https://doi.org/10.1016/jxhom.2014.11.016
35. Arbel-Goren R., Shapira Y., Stavans J. Method for labeling transcripts in individual Escherichia coli cells for single-molecule fluorescence in situ hybridization experiments. J. Vis. Exp. 2017; (130): 56600. https://doi.org/10.3791/56600
36. Read D.S., Woodcock D.J., Strachan N.J.C., Forbes K.J., Colles F.M., Maiden M.C.J., et al. Evidence for phenotypic plasticity among multihost Campylobacter jejuni and C. coli lineages, obtained using ribosomal multilocus sequence typing and Raman spectroscopy. Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79(3): 965-73. https://doi.org/10.1128/AEM.02521-12
37. van de Vossenberg J., Tervahauta H., Maquelin K., Blok-ker-Koopmans C.H.W., Uytewaal-Aarts M., van der Kooij D., et al. Identification of bacteria in drinking water with Raman. Anal. Methods. 2013; 5(11): 2679-87. https://doi.org/10.1039/c3ay40289d
38. Davey H.M. Prospects for the automation of analysis and interpretation of flow cytometric data. Cytometry A. 2010; 77(1): 3-5. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20835
39. Davey H.M. Flow cytometric techniques for the detection of microorganisms. Methods. Cell. Sci. 2002; 24(1-3): 91-7. https://doi.org/10.1023/A:1024106317540
40. Andryukov B.G., Karpenko A.A., Matosova E.V., Lyapun I.N. Raman spectroscopy - modern diagnostic technology for study and indication of infectious agents (review). Sovremennye tekhnologii v meditsine. 2019; 11(4): 161-74. http://doi.org/10.17691/stm2019.1L4.19 (in Russian)
41. Wharfe E.S., Jarvis R.M., Winder C.L., Whiteley A.S., Gooda-cre R. Fourier transform infrared spectroscopy as a metabolite fingerprinting tool for monitoring the phenotypic changes in complex bacterial communities capable of degrading phenol. Environ. Microbiol. 2010; 12(12): 3253-63. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2010.02300.x
42. Shukla S., Bajpai V.K. Visual demonstration of transmission electron microscopy for intracellular observation of a single bacterial cell. Bangladesh J. Pharmacol. 2017; 12(1): 23-7. https://doi.org/10.3329/bjp.v12i1.31390
43. Syal K., Wang W., Shan X., Wang S., Chen H.Y., Tao N. Plas-monic imaging of protein interactions with single bacterial cells. Biosens. Bioelectron. 2015; 63: 131-7. https://doi.org/10.1016Zj.bios.2014.06.069
44. Peterson A.W., Halter M., Tona A., Plant A.L., Elliott J.T. Mass measurements of focal adhesions in single cells using high resolution surface plasmon resonance microscopy. Proc. SPIE Int. Soc. Opt. Eng. 2018; 10509: 1050905. https://doi.org/10.1117/12.2290776
45. Righi V., Constantinou C., Kesarwani M., Rahme L.G., Tzi-ka A.A. Effects of a small, volatile bacterial molecule on Pseudomonas aeruginosa bacteria using whole cell high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectroscopy and genomics. Int. J. Mol. Med. 2018; 42(4): 2129-36. https://doi.org/10.3892/ijmm.2018.3760
46. Zhou X.L., Yang Y., Wang S., Liu X.W. Surface plasmon resonance microscopy: from single molecule sensing to single cell imaging. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2020; 59(5): 1776-85. https://doi.org/10.1002/anie.201908806
47. Elowitz M.B., Levine A.J., Siggia E.D., Swain P.S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 2002; 297(5584): 1183-6. https://doi.org/10.1126/science.1070919
48. Liu Y., Singh A.K. Microfluidic platforms for single cell protein analysis. J. Lab. Autom. 2013; 18(6): 446-54. https://doi.org/10.1177/22110-68213-494389
ОБЗОРЫ
49. Cho S., Cho Y., Lee S., Kim J., Yum H., Kim S.C., et al. Current challenges in bacterial transcriptomics. Genomics. Inform. 2013; 11(2): 76-82. https://doi.org/10.5808/GI.2013.11.2.76
50. Shahrezaei V., Marguerat S. Connecting growth with gene expression: of noise and numbers. Curr. Opin. Microbiol. 2015; 25: 127-35. https://doi.org/10.1016/j.mib.2015.05.012
51. Schröter L., Dersch P. Phenotypic diversification of microbial pathogens - cooperating and preparing for the future. J. Mol. Biol. 2019; 431(23): 4645-55. https://doi.org/10.1016/jjmb.2019.06.024
52. Weigel W.A., Dersch P. Phenotypic heterogeneity: a bacterial virulence strategy. Microbes Infect. 2018; 20(9-10): 570-7. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2018.01.008
Информация об авторах
Андрюков Борис Георгиевич — д.м.н., в.н.с. лаб. молекулярной микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, Владивосток, Россия, andrukov_bg@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4456-808X
Тимченко Нелли Фёдоровна — д.м.н., в.н.с. лаб.молекуляр-ной микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, Владивосток, Россия, https://orcid.org/0000-0001-6051-292X
Ляпун Ирина Николаевна — к.б.н., с.н.с. лаб. молекулярной микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, Владивосток, Россия, https://orcid.org/0000-0002-5290-3864 Бынина Марина Павловна — м.н.с. лаб. молекулярной микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, Владивосток, Россия, https://orcid.org/0000-0001-8255-328X
Матосова Екатерина Владимировна — м.н.с. лаб. молекулярной микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, Владивосток, Россия, https://orcid.org/0000-0001-9968-3347
Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Статья поступила в редакцию 30.04.2020; принята к публикации 07.07.2020; опубликована 25.02.2021.
53. Mortier J., Tadesse W., Govers S.K., Aertsen A. Stress-induced protein aggregates shape population heterogeneity in bacteria. Curr. Genet. 2019; 65(4): 865-9. https://doi.org/10.1007/s00294-019-00947-1
54. Henry T.C., Brynildsen M.P. Development of Persister-FACSeq: a method to massively parallelize quantification of persister physiology and its heterogeneity. Sci. Rep. 2016; 6: 25100. https://doi.org/10.1038/srep25100
55. Binder D., Drepper T., Jaeger K.E., Delvigne F., Wiechert W., Kohlheyer D., et al. Homogenizing bacterial cell factories: analysis and engineering of phenotypic heterogeneity. Metab. Eng. 2017; 42: 145-56.
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2017.06.009 Information about the authors
Boris G. Andryuko^ — D. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of molecular microbiology, Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia, andrukov_ bg@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4456-808X Nelly F. Timchenko — D. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of molecular microbiology, Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia, https://orcid.org/0000-0001-6051-292X
Irina N. Lyapun — Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of molecular microbiology, Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia, https://orcid.org/0000-0002-5290-3864
Marina P. Bynina — junior researcher, Laboratory of molecular microbiology, Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia, https://orcid.org/0000-0001-8255-328X Ekaterina V. Matosova — junior researcher, Laboratory of molecular microbiology, Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia, https://orcid.org/0000-0001-9968-3347
Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
The article was submitted 30.04.2020; accepted for publication 07.07.2020; published 25.02.2021.
