CC BY
94ОБЗОРЫ
ОБЗОРЫ
© Андрюков Б.Г., Ляпун И.Н., 2020
Check for updates
Молекулярные механизмы персистенции бактерий
Андрюков Б.Г.1,2Н, Ляпун И.Н.1
1ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» Минобрнауки РФ, 690087, Владивосток, Россия; 2ФГБОУ ВО «Дальневосточный федеральный университет», 690087, Владивосток, Россия
Высокий уровень смертности от инфекционных болезней в значительной степени опосредован повсеместным и бесконтрольным использованием антибиотиков, что привело к появлению лекарственно-резистентных штаммов бактерий. Быстрая эволюция резистентности бактерий к антимикробным препаратам является серьезным вызовом для современного здравоохранения, обусловливает необходимость создания новых антибиотических средств, а также активизации изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования устойчивости микроорганизмов. Одним из таких механизмов является бактериальная персистенция, которая проявляется образованием в микробной культуре клеток-персисторов, являющихся фенотипическим вариантом изогенной популяции. Персистенция бактерий может возникать самопроизвольно, независимо от воздействия антимикробных средств или причин, связанных с окружающей средой (недостаток питательных веществ, окислительный стресс или гипоксия). Эта небольшая по численности генерация клеток способна сохранять жизнеспособность даже в присутствии антимикробных средств в концентрациях, многократно превышающих терапевтические. Наличие в организме пер-систорных клеток патогенных бактерий снижает эффективность антибиотического лечения не в связи с генотипической лекарственной устойчивостью микроорганизма, а вследствие наличия фенотипической резистентности клеток-персисторов. Различие принципиальное, поскольку персисторы нечувствительны ко всем антибиотикам и для их эрадикации необходима разработка принципиально новых антимикробных стратегий. Клетки-персисторы представляют собой фенотипические варианты материнской культуры бактерий, которые присутствуют во всех популяциях микроорганизмов, а после наступления благоприятных условий способны рекультивироваться и сформировать новую генерацию вегетативных бактерий. В обзоре рассмотрены современные концепции молекулярно-генетических механизмов персистенции бактерий с акцентом на их клиническом значении для возникновения персистирующих инфекций, а также обсуждаются инновационные технологии эрадикации устойчивых клеточных форм микроорганизмов.
Ключевые слова: персистенция бактерий; персистирующие инфекции; молекулярные механизмы; клетки-персисторы; резистентность; эрадикация; современные технологии.
Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания по теме НИР № 0545-2019-0007 «Молекулярные механизмы образования устойчивых некультивируемых форм бактерий».
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Для цитирования: Андрюков Б.Г., Ляпун И.Н. Молекулярные механизмы персистенции бактерий. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020; 97(3): 271-279. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-10
Поступила 02.03.2020 Принята в печать 16.04.2020
Molecular Mechanisms оf Persistence оf Bacteria
Boris G. Andryukov1-20, Irina N. Lyapun1
1Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 690087, Vladivostok, Russia; 2Pacific State Medical University, 690087, Vladivostok, Russia
A significant mortality rate from infectious diseases is largely mediated by the widespread and uncontrolled use of antibiotics, which has led to the emergence of drug-resistant strains of bacteria. The rapid evolution of
REVIEWS
bacterial resistance to antimicrobials is a serious challenge for modern health care, mediates the need to create new antibiotic agents, as well as to intensify the study of molecular mechanisms underlying the formation of microorganism resistance. One of these mechanisms is bacterial persistence, manifested by the formation of persistent cells in the culture, which are a phenotypic variant of the isogenic population. The persistence of bacteria can occur spontaneously, regardless of exposure to antimicrobials or environmental reasons, such as lack of nutrients, oxidative stress or hypoxia. This small cell subpopulation is able to maintain viability even in the presence of antimicrobial agents at concentrations many times higher than therapeutic. The presence of persistent cells of pathogenic bacteria in the host organism reduces the effectiveness of antibiotic treatment, not due to the genotypic drug resistance of the microorganism, but due to the presence of phenotypic resistance of persister cells. The difference is fundamental, since cell-persisters are insensitive to any antibiotics and the development of fundamentally new antimicrobial strategies is necessary for their eradication. Persister cells are phenotypic variants of the maternal culture of bacteria that are present in all populations of microorganisms, and after the onset of favorable conditions, they are able to reclaim and form a new generation of vegetative bacteria. This review discusses modern concepts of the molecular genetic mechanisms of bacterial persistence with an emphasis on their clinical significance for the occurrence of persistent infections, and discusses innovative technologies for the eradication of resistant cell forms of microorganisms.
Keywords: bacterial persistence; persistent infections; molecular mechanisms; persister cells; resistance; eradication; modern technologies.
Acknowledgments. This work was carried out as part of a state assignment on the topic of research No. 0545-2019-0007 «Molecular mechanisms of the formation of stable uncultivated forms of bacteria». Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
For citation: Andryukov B.G., Lyapun I.N. Molecular mechanisms of persistence of bacteria. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2020; 97(3): 271-279. (In Russ.).
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-10
Received 2 March 2020 Accepted 16 April 2020
Введение
Вскоре после открытия и триумфального применения для лечения бактериальных инфекций антибиотиков, ознаменовавших начало новой исторической эпохи в медицине, американский микробиолог Gladys L. Hobby (1942) впервые обратила внимание на загадочное явление — отсутствие полной стерилизации пенициллином культуры S. aureus [1]. Небольшая выжившая часть клеток продолжала оставаться жизнеспособной, а при наступлении благоприятных условий давала начало новой микробной популяции — такой же чувствительной к антибиотику.
Это наблюдение стало убедительным доказательством того, что новая популяция бактерий сохранила биологические свойства материнской культуры и не представляет собой генетически модифицированный пенициллин-резистентный штамм, а выжившие клетки являются его фенотипической разновидностью. Выявленная генерация клеток под влиянием антибиотикотерапии временно изменила свои биологические свойства, свела к минимуму метаболическую и репродуктивную активность для последующего возрождения погибшей популяции. Удивительная устойчивость этих клеток к антибиотикам не стала наследуемым признаком, а природа этого феномена имеет совершенно иные механизмы, чем природная резистентность бактерий к антимикробным препаратам, опосредуемая генетическими мутациями.
Спустя 2 года J.W. Bigger (1944) получил аналогичные результаты и назвал выжившую субпопуляцию бактерий клетками-персисторами («неде-лящиеся, бездействующие клетки») [2]. Однако на волне эйфории от успехов применения антибиотиков в 1940-1970-е гг. работы G.L. Hobby и J.W. Bigger не получили должного внимания, и дальнейшие исследования клеточной персистенции прекратились [3, 4]. Кроме того, клетки-персисторы не культивировались на обычных питательных средах и не проявляли метаболическую активность, что затрудняло их выявление и изучение традиционными микробиологическими методами [4, 5] (рис. 1).
На рубеже ХХ и XXI вв. появление устойчивых к антимикробным препаратам штаммов патогенных бактерий стало серьезной угрозой глобальному здравоохранению, и с трибуны ВОЗ заговорили о грядущем закате эры антибиотиков. В последние десятилетия на фоне роста инфекционной патологии заболевания все чаще стали принимать затяжной или хронический характер и ассоциироваться с условно-патогенными микроорганизмами и госпитальным заражением пациентов [6].
В сложившихся условиях поиск и создание новых антибиотиков становится все более сложным, все менее перспективным и экономически нерентабельным процессом. А для эффективной борьбы с резистентностью бактерий требуются разработка инновационных антимикробных стратегий, новые мишени и решения. Одним из перспективных под-
ОБЗОРЫ
(p)ppGpp + RpoS Антибиотики Antibiotics
Dead cells
Вегетативные клетки Vegetative cells
Клетки-персисторы Persister cells
Реверсивный переход Reverse transition
R
о\ /о
Клеточная смерть Dead cells
108 , 106„ 1041020
Антибиотики в бактериальной культуре Antibiotics in bacterial culture
Клетки-персисторы Persister cells
Вегетативные кпе' egetative cells
02
8 10 12 14 16 18
Планктонные клетки бактерий Антибактериальные средства, дезинфектанты Planktonic bacteria cells Antibacterial facilities, disinfectants
Оксидативный стресс Oxidative stress
Неблагоприятные условия
рН, Т \ /
ré
0 ^ ê -----------f..........'-----
t Unfavourable conditions —... — e (P)PPGpp + RpoS
Недостаток питательных веществ Nutrient deficiency
Благоприятные условия Favourable conditions
Матрикс биопленки Biofilm matrix
I ,
y///////////
//}/////7/77ау
Рис. 1. Субпопуляция персисторных клеток бактерий является устойчивой к антибиотикам.
После гибели большей части вегетативных бактерий и окончания антибиотикотерапии клетки-персисторы восстанавливают популяцию материнской культуры клеток.
Fig. 1. A subpopulation of persistent bacteria cells is resistant to antibiotics.
After the death of most vegetative bacteria and the end of antibiotic therapy, persister cells restore the population of maternal cell culture.
4
ходов является изучение персистенции бактерий. Растущий научный интерес к этому биологическому феномену стал особенно заметен на фоне появления новых сведений о молекулярно-генетических механизмах, лежащих в основе их устойчивости [3, 5, 6].
В этом обзоре рассматриваются современные концепции молекулярно-генетических механизмов персистенции бактерий с акцентом на их клиническом значении для возникновения персистирующих инфекций, обсуждаются инновационные технологии эрадикации устойчивых клеточных форм микроорганизмов.
Персистенция бактерий
Одними из ключевых признаков жизнеспособности любой прокариотической клетки являются согласованное воспроизведение интрацеллюляр-ных структур и синтез макромолекул. Однако открытие в середине ХХ в. феномена персистенции бактериальных клеток и последующее его изучение
позволили расширить представление об адаптационных стратегиях микроорганизмов и механизмах сохранения ими патогенного потенциала [7-10].
Впоследствии было показано, что большинство бактериальных культур, находясь в стационарной фазе роста и благоприятных условиях, имеет небольшую (1-3%) неделящуюся фенотипическую субпопуляцию персисторов, биологической функцией которых является сохранение популяции в случае внезапно наступивших изменений условий среды обитания [5, 6, 11].
Помимо постоянного присутствия этой клеточной субпопуляции в любой культуре прокариот, увеличение их численности происходит в ответ на возникающую угрозу любых неблагоприятных факторов среды обитания. Кроме уже обсуждавшегося влияния антимикробных средств, это могут быть дефицит (отсутствие) питательных веществ, окси-дативный стресс, гипоксия, изменение температуры [6, 9, 10].
REVIEWS
В зависимости от условий существования, фазы роста и условий среды обитания микробной популяции происходит постоянная трансформация вегетативных форм в генерацию клеток-персисторов и обратно [3, 4]. При этом численность бездействующей популяции может значительно варьировать, а в условиях дефицита (отсутствия) питательных веществ достигать почти тотального перехода всей популяции в состояние персистенции [12]. Биологическое значение присутствия и образования этих анабиотических клеточных генераций заключается в сохранении популяций после длительного и экстремального по величине воздействия неблагоприятных факторов [7, 8, 13].
В процессе жизнедеятельности вегетативные (активные) бактериальные клетки популяций могут трансформироваться в персистентный фенотип и обратно, при этом скорость этих реверсий ориентирована на фазы роста и условия среды обитания [3,
7, 8].
На основании полученных данных был сделан вывод о более широкой биологической функции клеток-персисторов и связи индукции генерации этой бактериальной субпопуляции не только с влиянием антибиотиков. Например, феномен персистен-ции бактерий в последние годы все чаще рассматривается в качестве универсальной адаптационной («оборонительной») стратегии микроорганизмов в ответ на конкурентный стресс, являющейся результатом межвидовых взаимодействий и имеющей большое значение для сохранения популяции в сообществе с доминантными видами [14-16].
За десятилетия изучения феномена персистен-ции бактерий установлено, что клетки-персисто-ры, в отличие от вегетативных клеточных форм, находятся в состоянии метаболического и репродуктивного покоя. Это позволяет им уклоняться от врожденных механизмов иммунной защиты организма-хозяина и сохранять жизнеспособность после воздействия экстремальных факторов среды обитания, в том числе влияния антибиотиков, многие из которых активны по отношению только к делящимся клеткам [8, 13, 15]. Механизмы большинства из них нацелены на ингибирование ключевых внутриклеточных звеньев метаболизма и репродукции: синтеза белков, клеточной стенки и репликации нуклеиновых кислот [17].
Безусловно, наличие в организме неактивных устойчивых клеточных форм патогенных бактерий в значительной степени способствует возникновению персистирующих инфекций и их возможных последствий: увеличению заболеваемости и смертности от самой инфекции, а также повышенному риску ее распространения [13, 14, 18]. Наличие в организме этой бездействующей генерации бактерий снижает эффективность антибиотического лечения, что опосредовано не генетической лекар-
ственной устойчивостью микроорганизма, а резистентностью фенотипического варианта изогенной популяции — клеток-персисторов. Таким образом, в отличие от генотипической резистентности микроорганизмов, устойчивость при персистенции бактерий временна и обратима. Различие принципиальное, поскольку персисторы не чувствительны к любым антибиотикам, а для их эрадикации необходима разработка принципиально новых антимикробных стратегий. Поэтому лечение перси-стирующих инфекций затруднено и, как правило, связано с необходимостью продолжительных или многократных курсов антимикробной терапии [3, 4, 17, 18].
В последние десятилетия установлено, что персистенция является универсальным явлением. Она обнаружена не только у бактерий и архей, но и у вирусов [19], грибов [20], одноклеточных водорослей [21], раковых клеток [22], семян растений [23], что предполагает наличие общих закономерностей и общебиологическое значение этого феномена для выживания систем в различных стрессовых условиях [5, 7, 24].
Формирование в бактериальной культуре генерации клеток-персисторов хорошо объясняет инновационная парадигма фенотипической гетерогенности популяций, являющейся чаще всего следствием спонтанного механизма молекулярного стохастического переключения фенотипа во время экспоненциальной или стационарной фазы роста микроорганизмов [5, 11, 12]. Однако формирование персисторов может быть опосредовано и адаптивными механизмами в ответ на экстремальные условия среды обитания, а также в начале стационарной фазы при нутриентном истощении [5, 13, 15]. Это приводит к появлению фенотипической гетерогенности, которая повышает жизнеспособность бактериальной популяции [14, 25-27].
Феномен персистенции бактерий согласуется с гипотезой континуума клеточного покоя. Согласно этой гипотезе, образование клеток-персисторов наряду с формированием жизнеспособных, но некуль-тивируемых (viable but non-culturable, VBNC) клеточных форм бактерий рассматривается в качестве одного из наиболее распространенных способов выживания бактерий в неблагоприятных условиях [28-30].
Сходство обстоятельств формирования и морфологических признаков указывает на достаточно близкое родство этих устойчивых клеточных форм, однако есть экспериментальные данные, показывающие, что VBNC является формой более глубокого покоя. Для восстановления параметров роста этих жизнеспособных, но некультивируемых бактерий после прекращения действия стрессора необходимо больше времени (до суток и более), тогда как клетки-персисторы рекультивируются после завер-
ОБЗОРЫ
шения антибиотикотерапии на плотных питательных средах в течение нескольких часов [28, 30, 31]. Это обстоятельство позволило некоторым авторам предположить, что клетки-персисторы являются переходной формой трансформации в VBNC-состо-яние [12].
Некоторые авторы [28-30] ставят знак равенства между клетками-персисторами и VBNC, объединяя их на основании сходства обстоятельств формирования, морфологических, физиологических признаков, а также молекулярно-генетических механизмов возникновения.
Молекулярно-генетические механизмы персистенции бактерий
Еще в 1950-е гг. исследователи задавались вопросом о функционировании отдельных клеток микроорганизмов. Этот интерес был основан на интуитивном понимании того, что физиология отдельных клеток в изогенных популяциях бактерий может отличаться от большинства других. Несмотря на то что бактериальная персистенция известна уже около 80 лет, генерация клеток-персисторов изучена мало. Технические проблемы с получением лабораторной модели дормантных клеток и невозможность их культивирования на обычных питательных средах дополнялись отсутствием чувствительных аналитических инструментов для изучения персистенции бактерий [11, 13, 28].
Значительные достижения молекулярной биологии и генетики в начале XXI в. расширили представления о молекулярно-генетических механизмах, лежащих в основе персистенции бактерий. С появлением и развитием концепции микробиологии отдельных клеток (single-cell microbiology) были разработаны новые аналитические инструменты и методы одноклеточной изоляции (раман-спектро-метрия, микрофлюидика, проточная цитометрия, компартментализация) [32-34]. Появилась возможность выделять и выращивать ранее некультивируе-мые одиночные клетки для проведения оценки жизнеспособности, а также мониторинга физиологии и функций отдельных клеток, что было невозможно 10-15 лет назад [35-39].
В зависимости от целей и задач исследований эти методы сочетаются с секвенированием РНК (scRNA-seq), а также с генетическим, макромоле-кулярным, пространственным, протеомным профилированием одиночных клеток [35-37]. С помощью этих методов установлено, что в регуляции образования клеток-персисторов принимают участие различные независимые молекулярные механизмы [40-43].
Каждый из этих механизмов приводит к формированию в популяции небольшой генерации дремлющих клеток. Например, реагируя на различные внешние раздражители, бактерии используют
сенсорные системы, трансформирующие внешние сигналы в модуляцию внутриклеточного содержания вторичных мессенджеров-индукторов. Среди них внутриклеточные нуклеотидные молекулы-алармоны (p)ppGpp (гуанозин пентафосфат и гу-анозин тетрафосфат). Они играют ключевую роль в ответе бактериальной клетки на внешние раздражители, выполняя функцию одного из основных медиаторов «строгого контроля» и регулятора активности метаболизма [42-45]. В свою очередь, концентрация этих молекул в клетке регулируется ppGpp-синтазами, активность которых зависит от содержания аминокислот, при непосредственном участии суперсемейства гормонов RelA/SpoT, синтезирующих ppGpp [42, 44, 46].
Эти молекулы опосредуют формирование клеток-персисторов путем изменения активности ряда ферментов, в первую очередь ДНК-праймазы, лизиндекарбоксилазы, РНК-полимеразы и др., а также в качестве сигнальных молекул регулируют скорость репликации бактерий и их метаболическую активность [44, 47, 48]. Кроме того, вторичный мессенджер ^)ppGpp был идентифицирован как регулятор активности многочисленных генетических оперонов, кодирующих токсин-антитокси-новые системы (ТАС) прокариот, открытых в конце ХХ в. [49]. Их изучение позволило установить широкую распространенность у бактерий этих важнейших оперонов [28, 50-52]. Последующее установление связи ТАС с формированием фенотипа бактериальной персистенции стало мощным стимулом изучения этих генетических локусов, в значительной степени опосредующих устойчивость прокариот к антибактериальным препаратам [42, 43, 48].
За последние десятилетия выявлено, что генетические опероны ТАС состоят из двух промоторов, расположенных по соседству на хромосомах и плаз-мидах. Они регулируют синтез стабильного токсина и нестабильного антитоксина, чувствительного к клеточным протеазам. В нормальных условиях эти системы представляют собой нетоксичный комплекс, в котором антитоксин блокирует комплементарный токсин путем прямого связывания мРНК [42, 48].
Увеличение уровня ^)ppGpp вызывает снижение активности экзополифосфатаз и повышение внутриклеточного содержания полифосфата. Эти высокомолекулярные полимеры при участии Lon-протеазы опосредуют деградацию антитоксина, деполяризацию клеточных мембран, а также значительное ингибирование активности метаболизма и угнетение репродукции [46, 47, 51] (рис. 2).
При наступлении экстремальных условий обитания происходит деградация антитоксина гомо-олигомерной АТФ-зависимой Lon(La)-протеазой и двухкомпонентными протеазными системами
REVIEWS
Нетоксичный ТА-комплекс Активированный токсин Клетки-персисторы Non-toxic TA complex Activated toxin Persister cells
Ген, кодирующий токсин Токсин Toxin encoding gene Toxin
Генные промоторы Gene promoters
A
£
\
__. f ClpXP
Ген, кодирующий антитоксин Антитоксин АТФ-зависимая Lon-протеаза \J ClpAP Antitoxin encoding gene Antitoxm «тг. -----.—».-----»----
Интактивированный токсин Inactivated toxin
ATP-dependent Lon-protease
PolyP
J
Полифосфат Polyphosphate
Рис. 2. Молекулярно-генетические механизмы формирования фенотипа персистенции у бактерий. Fig. 2. Molecular genetic mechanisms of the formation of the phenotype of persistence in bacteria.
ClpXP и ClpAP, в результате чего освобождается и активируется токсин. Клеточной мишенью активного токсина становятся внутриклеточные ферменты, ингибирование которых опосредует значительное замедление скорости синтеза белка и клеточной стенки, угнетение метаболизма и репликации ДНК бактерий, что приводит к частичной или полной их устойчивости к этиотропной антибактериальной терапии [43, 50].
Так, активация токсина RelE (локус RelEB), согласно данным [51], повышает устойчивость E. coli к ванкомицину в 10 тыс. раз, а высвобождение токсина YafQ (локус TA DinJ-YafQ) снижает чувствительность этой же бактерии к цефалоспориновому антибиотику I поколения, цефазолину, в 2400 раз. При этом важно, что гены ТАС, расположенные на плазмидах, способны в биопленках переноситься горизонтально к другим патологическим микроорганизмам, придавая им устойчивость к антибиотикам [27, 48, 51].
К настоящему времени установлено существование 6 типов модулей ТАС, которые отличаются строением антитоксинов и характером их взаимодействия с комплементарными токсинами [42, 43, 48]. Первоначально ведущая роль в формировании клеточной персистенции отводилась наиболее изученному модулю ТАС II типа и его локусу hipBA, содержащему первый открытый у E. coli ген устойчивости бактерий hipA. В этом типе ТАС токсин и антитоксин являются протеинами [42, 46, 51]. Однако в дальнейшем показано участие и других типов ТАС в формировании устойчивости бактерий [27, 52-54].
В различных типах ТАС используются разные механизмы активации токсина, что в итоге приводит к его высвобождению, замедлению метаболиз-
ма и остановке репродуктивной активности, образованию клеток-персисторов. Последующие исследования показали, что и другие типы модулей ТАС вызывают сверхэкспрессию токсинов в дормантных клетках дикого штамма E. coli (локусы tisB-istR, hokB-sokB и др.) [43, 46, 47]. Чрезмерная активация токсинов приводит к разрушению и гибели клеток, а этот механизм предлагается в качестве одной из перспективных стратегий, направленных на борьбу с персистенцией бактерий и их фенотипической резистентностью к антибиотикам.
Перспективные стратегии борьбы с персистенцией бактерий
Возрастающее клиническое значение перси-стенции бактерий делает все более актуальным поиск принципиально иных стратегий, направленных на борьбу с дормантными формами патогенных микроорганизмов, и альтернативных клеточных мишеней (таблица).
С учетом устойчивости клеток-персисторов к традиционным антибиотикам для их эрадикации было предложено использовать разрешенные к применению противораковые препараты циспла-тин и митомицин С (образуют внутрицепочечные сшивки ДНК). Использование этих препаратов против устойчивых клеток клинических штаммов E. coli O157:H7 (EHEC), Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus показало высокую эффективность и перспективность для лечения хронических инфекций [55].
Открытие ключевой роли токсин-антитокси-новых модулей в физиологии бактерий, а также (p) ppGpp в формировании генерации устойчивых к антибиотикам клеточных форм естественным образом связало одно из направлений научного поиска меха-
ОБЗОРЫ
Современные стратегии, направленные на ингибирование бактериальной персистенции Modern strategies aimed at inhibiting bacterial persistence
Мишень Target Механизм Mechanism Модель Model Ссылка Link
Клетки-персисторы Persister cells ДНК-сшивающие агенты проникают в клетки-персисторы и убивают их (цисплатин и митомицин C) DNA cross-linking agents penetrate and kill persistor cells (cisplatin and mitomycin C) E. coli; Pseudomonas aeruginosa; S. aureus 55
Блокирование синтеза (p)ppGpp Block synthesis (p)ppGpp Связывание каталитических домены RelA/SpoT синтетическим аналогом Relacin The binding of the catalytic domains RelA/SpoT synthetic analog Relacin M. tuberculosis 47
Литическая протеаза ClpP Lytic protease ClpP Активация (модуляция активности) литической протеазы ClpP Activation (modulation of activity) of the lytic protease ClpP Staphylococcus aureus 56
Токсин-антитоксиновые модули типа II Type II toxin antitoxin modules Ингибирование образования комплекса ТАС, прямая активация токсина после введения биомолекул для связывания антитоксина Inhibition of the formation of the TAS complex, direct activation of the toxin after the introduction of biomolecules for antitoxin binding E. coli 52
Активация токсина mazE пептидными олигомерами нуклеиновых кислот Activation of mazE toxin by nucleic acid peptide oligomers Neisseria meningitidis 53
Фармацевтическое ингибирование трансляции антитоксинов антисмысловой РНК E. coli 51
Pharmaceutical inhibition of antisense RNA antitoxin translation
Искусственная активация ТАС антисмысловыми пептидными E. coli 57
олигомерами нуклеиновых кислот
Artificial TAS activation by antisense peptide nucleic acid oligomers
низмов ингибирования образования клеток-перси-сторов с этими алармическими системами [43, 47, 48]. Например, K. Syal с коллегами [47] показали, что блокирование синтеза (p)ppGpp опосредуется связыванием активности каталитических доменов синтетаз/гидролаз RelA/SpoT этого мессенджера у Mycobacterium tuberculosis синтетическим аналогом Relacin.
B.P. Conlon и соавт. [56] пришли к выводу, что ацилдепсипептидный антибиотик (ADEP4), модулируя активность протеазы ClpP, убивает персисти-рующие клетки, разлагая более 400 внутриклеточных белков.
В последние годы как перспективная инновационная стратегия было предложено использование ТАС в качестве антибактериальных внутриклеточных мишеней [52, 53]. Научный интерес к ТАС в качестве антибактериальных стратегий обусловлен, с одной стороны, их широким распространением среди бактериальных геномов, а с другой — отсутствием в клетках эукариот, в частности ТАС не имеют аналогов у человека. Основные механизмы использования ТАС связаны с блокированием образования (деградацией) антитоксина, что приводит к разрушению комплементарным токсином дочерней клетки («постсегрегационное убийство»). Другая группа стратегий связана с искусственной активацией токсина или ингибированием образования ТАС [46, 57].
Заключение
Об окончательном раскрытии молекулярных механизмов персистенции бактерий пока говорить преждевременно. Их изучение находится в активной стадии, и возможно, что в скором времени появятся новые противомикробные стратегии, направленные на эрадикацию клеток-персисторов, которые расширят и дополнят существующие схемы традиционной антибиотикотерапии.
Однако рассчитывать на легкую борьбу с бактериальной персистенцией, по-видимому, не стоит. Механизмы персистенции слишком избыточны и специфичны для каждого вида микроорганизмов, а единый и универсальный метод эрадикации устойчивых клеток пока не просматривается.
На сегодняшний день наиболее успешные результаты были получены при использовании различных метаболитов (например, маннита, глюкозы, кардиолипина и др.) для рекультивирования кле-ток-персисторов с последующей аминогликозид-опосредованной эрадикацией [39, 40, 43].
Актуальность разработки методов борьбы с бактериальной персистенцией обоснована с позиции научной и практической значимости проблемы и экономической целесообразности. Лечение пер-систирующих инфекций, таких как туберкулез, требует длительных курсов приема значительных доз антибиотиков. Создание комбинированных схем лечения, направленных на эрадикацию инфекцион-
ного патогена и его устойчивых клеточных субпопуляций, позволит оптимизировать схемы лечения, снизить его стоимость и повысить эффективность.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Hobby G.L., Meyer K., Chaffee E. Observations on the mechanism of action of penicillin. Proc. Soc. Exp. Biol. NY. 1942; 50(2): 281-5. DOI: http://doi.org/10.3181/00379727-50-13773
2. Bigger J.W. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilization. Lancet. 1944; 244(6320): 497-500. DOI: http://doi.org/10.1016/S0140-6736(00)74210-3
3. van den Bergh B., Michiels J.E., Fauvart M., Michiels J. Should we develop screens for multi-drug antibiotic tolerance? Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2016; 14(7): 613-16.
DOI: http://doi.org/10.1080/14787210.2016.1194754
4. Rehab Mahmoud abd El-Baky. The future challenges facing antimicrobial therapy: resistance and persistence. Am. J. Microbiol. Res. 2016; 4(1): 1-15.
DOI: http://doi.org/10.12691/ajmr-4-1-1
5. Balaban N.Q., Merrin J., Chait R., Kowalik L., Leibler S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 2004; 305(5690): 1622-5. DOI: http://doi.org/10.1126/science.1099390
6. Lewis K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 2010; 64: 35772. DOI: http://doi.org/10.1146/annurev.micro.112408.134306
7. van Teeseling M.C.F., de Pedro M.A., Cava F. Determinants of bacterial morphology: from fundamentals to possibilities for antimicrobial targeting. Front. Microbiol. 2017; 8: 1264.
DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01264
8. Kysela D.T., Randich A.M., Caccamo P.D., Bran Y.V. Diversity takes shape: understanding the mechanistic and adaptive basis of bacterial morphology. PLoS Biol. 2016; 14(10): e1002565. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002565
9. Kawai Y., Mercier R., Errington J. Bacterial cell morphogenesis does not require a preexisting template structure. Curr. Biol. 2014; 24(8): 863-7.
DOI: http://doi.org/10.1016/jxub.2014.02.053
10. Harms A., Maisonneuve E., Gerdes K. Mechanisms of bacterial persistence during stress and antibiotic exposure. Science. 2016; 354(6318): aaf4268.
DOI: http://doi.org/10.1126/science.aaf4268
11. Maisonneuve E., Gerdes K. Molecular mechanisms underlying bacterial persisters. Cell. 2014; 157(3): 539-48.
DOI: http://doi.org/10.1016/jxell.2014.02.050
12. Orman M.A., Brynildsen M.P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nat. Commun. 2015; 6: 7983. DOI: http://doi.org/10.1038/ncomms8983
13. Randich A.M., Brun Y.V. Molecular mechanisms for the evolution of bacterial morphologies and growth modes. Front. Microbiol. 2015; 6: 580.
DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00580
14. Stubbendieck R.M., Straight P.D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. J. Bacteriol. 2016; 198(16): 2145-55. DOI: http://doi.org/10.1128/JB.00275-16
15. Gaivao M., Dionisio F., Gjini E. Transmission fitness in co-colonization and the persistence of bacterial pathogens. Bull. Math. Biol. 2017; 79(9): 2068-87.
DOI: http://doi.org/10.1007/s11538-017-0320-3
16. Dorosky R.J., Pierson L.S., Pierson E.A. Pseudomonas chloro-raphis produces multiple R-Tailocin particles that broaden the killing spectrum and contribute to persistence in rhizosphere communities. Appl. Environ. Microbiol. 2018; 84(18): e01230-18. DOI: http://doi.org/10.1128/AEM.01230-18
17. Fisher R.A., Gollan B., Helaine S. Persistent bacterial infections and persister cells. Nat. Rev. Microbiol. 2017; 15(8): 453-64. DOI: http://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.42
18. Grant S.S., Hung D.T. Persistent bacterial infections, antibiotic tolerance, and the oxidative stress response. Virulence. 2013; 4(4): 273-83. DOI: http://doi.org/10.4161/viru.23987
REVIEWS
19. Randall R.E., Griffin D.E. Within host RNA virus persistence: mechanisms and consequences. Curr. Opin. Virol. 2017; 23: 3542. DOI: http://doi.Org/10.1016/j.coviro.2017.03.001
20. Böhm L., Torsin S., Tint S.H., Eckstein M.T., Ludwig T., Pérez J.C. The yeast form of the fungus Candida albicans promotes persistence in the gut of gnotobiotic mice. PLoS Pathog. 2017; 13(10): e1006699.
DOI: http://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006699
21. Codony F., Miranda A.M., Mas J. Persistence and proliferation of some unicellular algae in drinking water systems as result of their heterotrophic metabolism: short communication. Water SA. 2003; 29(1): 113-6.
DOI: http://doi.org/10.4314/wsa.v29i1.4953
22. Pearl Mizrahi S., Gefen O., Simon I., Balaban N.Q. Persistence to anti-cancer treatments in the stationary to proliferating transition. Cell Cycle. 2016; 15(24): 3442-53.
DOI: http://doi.org/10.1080/15384101.2016.1248006
23. Long R.L., Gorecki M.J., Renton M., Scott J.K., Colville L., Goggin D.E., et al. The ecophysiology of seed persistence: a mechanistic view of the journey to germination or demise. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 2015; 90(1): 31-59.
DOI: http://doi.org/10.1111/brv. 12095
24. Yafremava L.S., Wielgos M., Thomas S., Nasir A., Wang M., Mittenthal J.E., et al. A general framework of persistence strategies for biological systems helps explain domains of life. Front. Genet. 2013; 4: 16.
DOI: http://doi.org/10.3389/fgene.2013.00016
25. van Boxtel C., van Heerden J.H., Nordholt N., Schmidt P., Brug-geman F.J. Taking chances and making mistakes: non-genetic phenotypic heterogeneity and its consequences for surviving in dynamic environments. J. R. Soc. Interface. 2017; 14(132): 20170141. DOI: http://doi.org/10.1098/rsif.2017.0141
26. Smith S.E. Organisms as persisters. Theor. Pract. Biol. 2017; 9(14). DOI: http://doi.org/10.3998/ptb.6959004.0009.014
27. Pu Y., Ke Y., Bai F. Active efflux in dormant bacterial cells — new insights into antibiotic persistence. Drug. Resist. Updat. 2017; 30: 7-14. DOI: http://doi.org/10.1016/j.drup.2016.11.002
28. Kim J.S., Wood T.K. Tolerant, growing cells from nutrient shifts are not persister cells. mBio. 2017; 8(2): e00354-17.
DOI: http://doi.org/10.1128/mBio.00354-1718. Available at: http://mbio.asm.org/content/8/2/e00354-17.long
29. Ayrapetyan M., Williams T.C., Baxter R., Oliver J.D. Viable but non-culturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum. Infect. Immun. 2015; 83(11): 419403. DOI: http://doi.org/10.1128/IAI.00404-15
30. Ayrapetyan M., Williams T., Oliver J.D. Relationship between the viable but nonculturable state and antibiotic persister cells. J. Bacteriol. 2018; 200(20): e00249-18.
DOI: http://doi.org/10.1128/JB.00249-18
31. Amato S.M., Fazen C.H., Henry T.C., Mok W.W., Orman M.A., Sandvik E.L., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Front. Microbiol. 2014; 5: 70.
DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00070
32. Ishii S., Tago K., Senoo K. Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010; 86(5): 1281-92.
DOI: http://doi.org/10.1007/s00253-010-2524-4.
33. Li M., Xu J., Romero-Gonzalez M., Banwart S.A., Huang W.E. Single cell Raman spectroscopy for cell sorting and imaging. Curr. Opin. Biotechnol. 2012; 23(1): 56-63.
DOI: http://doi.org/10.1016/jxopbio.2011.11.019
34. Mazutis L., Gilbert J., Ung W.L., Weitz D.A., Griffiths A.D., Heyman J.A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat. Protoc. 2013; 8(5): 870-91. DOI: http://doi.org/10.1038/nprot.2013.046
35. Stuart T., Satija R. Integrative single-cell analysis. Nat. Rev. Genet. 2019; 20(5): 257-72.
DOI: http://doi.org/10.1038/s41576-019-0093-7
ОБЗОРЫ
36. Peterson V.M., Zhang K.X., Kumar N., Wong J., Li L., Wilson D.C., Moore R., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nat. Biotechnol. 2017; 35(10): 936-9. DOI: http://doi.org/10.1038/nbt.3973
37. Ramani V., Deng X., Qiu R., Gunderson K.L., Steemers F.J., Disteche C.M., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nat. Methods. 2017; 14(3): 263-6.
DOI: http://doi.org/10.1038/nmeth.4155
38. Toth E.N., Lohith A., Mondal M., Guo J., Fukamizu A., Pour-mand N. Single-cell nanobiopsy reveals compartmentalization of mRNAs within neuronal cells. J. Biol. Chem. 2018; 293(13): 4940-51. DOI: http://doi.org/10.1074/jbc.M117.800763
39. Hong-Geller E., Micheva-Viteva S.N. Targeting bacterial persistence to develop therapeutics against infectious disease. DOI: http://doi.org/10.5772/59404 Available at: https:// www.intechopen.com/books/drug-discovery-and-develop-ment-from-molecules-to-medicine/targeting-bacterial-per-sistence-to-develop-therapeutics-against-infectious-disease
40. Lin J.M., eds. Microfluidics for Single-Cell Analysis. Beijing, China: Springer Singapore; 2019.
DOI: http://doi.org/10.1007/978-981-32-9729-6
41. Michiels J.E., van den Bergh B., Verstraeten N., Michiels J. Molecular mechanisms and clinical implications of bacterial persistence. Drug. Resist. Updat. 2016; 29: 76-89.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.drup.2016.10.002
42. Tian C., Semsey S., Mitarai N. Synchronized switching of multiple toxin-antitoxin modules by (p)ppGpp fluctuation. Nucleic. Acids. Res. 2017; 45(14): 8180-9.
DOI: http://doi.org/10.1093/nar/gkx552
43. Svenningsen M.S., Veress A., Harms A., Mitarai N., Semsey S. Birth and resuscitation of (p)ppGpp induced antibiotic tolerant persister cells. Sci. Rep. 2019; 9(1): 6056.
DOI: http://doi.org/10.1038/s41598-019-42403-7
44. Wood T.K. Combatting bacterial persister cells. Biotechnol. Bioeng. 2016; 113(3): 476-83.
DOI: http://doi.org/10.1002/bit.25721
45. Maisonneuve E., Castro-Camargo M., Gerdes K. (p)ppGpp controls bacterial persistence by stochastic induction of toxin-antitoxin activity. Cell. 2013; 154(5): 1140-50.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.cell.2013.07.048
46. Manav M.C., Beljantseva J., Bojer M.S., Tenson T., Ingmer H., Hauryliuk V., et al. Structural basis for (p)ppGpp synthesis by the Staphylococcus aureus small alarmone synthetase RelP. J. Biol. Chem. 2018; 293(9): 3254-64.
DOI: http://doi.org/10.1074/jbc.RA117.001374
47. Syal K., Flentie K., Bhardwaj N., Maiti K., Jayaraman N., Stallings C.L., et al. Synthetic (p)ppGpp analogue is an inhibitor of stringent response in mycobacteria. Antimicrob. Agents. Chemother. 2017; 61(6): e00443-17.
DOI: http://doi.org/10.1128/AAC.00443-17
48. Hauryliuk V., Atkinson G.C., Murakami K.S., Tenson T., Gerdes K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nat. Rev. Microbiol. 2015; 13(5): 29809. DOI: http://doi.org/10.1038/nrmicro3448
49. Ogura T., Hiraga S. Mini-F plasmid genes that couples host cell division to plasmid proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983; 80(15): 4784-8.
DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.80.15.4784
50. Page R., Peti W. Toxin-antitoxin systems in bacterial growth arrest and persistence. Nat. Chem. Biol. 2016; 12(4): 208-14. DOI: http://doi.org/10.1038/nchembio.2044
51. van Melderen L. Toxin-antitoxin systems: why so many, what for? Curr. Opin. Microbiol. 2010; 13(6): 781-5.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.mib.2010.10.006
52. Lee K.Y., Lee B.J. Structure, biology, and therapeutic application of toxin-antitoxin systems in pathogenic bacteria. Toxins. 2016; 8(10): 305. DOI: http://doi.org/10.3390/toxins8100305
53. Maleki A., Ghafourian S., Pakzad I., Badakhsh B., Sadeghi-fard N. MazE antitoxin of toxin-antitoxin system and fbpA as reliable targets to eradication of Neisseria meningitidis. Curr. Pharm. Des. 2018; 24(11): 1204-10.
DOI: http://doi.org/10.2174/1381612824666171213094730
54. Cui P., Xu T., Zhang W.H., Zhang Y. Molecular mechanisms of bacterial persistence and phenotypic antibiotic resistance. Yi Chuan. 2016; 38(10): 859-71.
DOI: http://doi.org/10.16288/j.yczz.16-213
55. Chowdhury N., Wood T.L., Martínez-Vázquez M., García-Con-treras R., Wood T.K. DNA-crosslinker cisplatin eradicates bacterial persister cells. Biotechnol. Bioeng. 2016; 113(9): 198492. DOI: http://doi.org/10.1002/bit.25963
56. Conlon B.P., Nakayasu E.S., Fleck L.E., LaFleur M.D., Isabella V.M., Coleman K., et al. Activated ClpP kills persisters and eradicates a chronic biofilm infection. Nature. 2013; 503(7476): 365-70. DOI: http://doi.org/10.1038/nature12790
57. Równicki M., Pienko T., Czarnecki J., Kolanowska M., Barto-sik D., Trylska J. Artificial activation of Escherichia coli mazEF and hipBA toxin-antitoxin systems by antisense peptide nucleic acids as an antibacterial strategy. Front. Microbiol. 2018; 9: 2870. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02870
Информация об авторах:
Андрюков Борис Гэоргиеви43 — д.м.н., в.н.с. лаб. молекулярной микробиологии ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова», Владивосток, Россия; профессор Департамента медицинской биохимии и биофизики Школы биомедицины ФГБОУ ВО «Дальневосточный федеральный университет», Владивосток, Россия. ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-4456-808X. E-mail: andrukov_bg@mail.ru
Ляпун Ирина Николаевна — к.б.н., н.с. лаб. молекулярной микробиологии ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова», Владивосток, Россия. ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-5290-3864. E-mail: irina-lyapun@list.ru
Участие авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Information about the authors:
AndryukovBoris GeorgievichB— D. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of molecular microbiology, Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia; Prof., Department of Medical Biochemistry and Biophysics, School of Biomedicine, Pacific State Medical University, Vladivostok, Russia. ORCID ID: https://orcid.org/0000-0003-4456-808X. E-mail: andrukov_bg@mail.ru
Lyapun Irina Nikolaevna — PhD (Med.), researcher, Laboratory
of molecular microbiology, Somov Institute of Epidemiology and
Microbiology, Vladivostok, Russia.
ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-5290-3864.
E-mail: irina-lyapun@list.ru
Contribution: the authors contributed equally to this article.
