CC BY
132
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 614.777:579.68]-078
Анганова Е.В.1,2, Савилов Е.Д.1,2, СавченковМ.Ф. 2,3, Чемезова Н.Н.2
гетерогенность микробных сообществ поверхностных водоемов по показателям антибиотикорезистентности бактерий
'ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Минздрава России, 664079, Иркутск; 2ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения РАМН, 664003, Иркутск; 3ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, 664003, Иркутск
Микроорганизмы, выделенные из водоемов в пределах урбанизированных территорий, обладают множественной антибиотикорезистентностью, поэтому при проведении микробиологического мониторинга водных объектов в качестве дополнительного критерия их антропогенного загрязнения целесообразно учитывать показатели антибиотикоустойчивости бактерий. Изучение гетерогенности микробных сообществ крупнейших водоемов Восточной Сибири (реки Ангара и Лена) по показателю антибиотикорезистентности бактерий проведено с позиций кластерной структурированности. Установлено, что условно-патогенные грамотрицательные бактерии и аутохтонные представители микробиоценозов водных объектов характеризуются принадлежностью к 4 кластерам (антибиотикочувствительные, моно-, умеренно- и полиантиби-отикорезистентные). При этом доли микроорганизмов, принадлежащих к разным кластерам, существенно варьируют в отношении как разных водных объектов, так и отдельных участков одного водоема, и во многом зависят от антропогенной нагрузки на водоемы. Таким образом, гетерогенность микробных популяций позволяет представить сравнительную количественную оценку водоемов, а также их участков по показателю антибиотикорезистентности микроорганизмов. Увеличение доли антибиотикорезистентных штаммов отражает гигиеническую и эпидемиологическую значимость данного свойства, так как свидетельствует о загрязнении источников водоснабжения хозяйственно-бытовыми сточными водами.
Ключевые слова: поверхностные водные объекты; антропогенное воздействие; микроорганизмы; антибио-тикорезистентность; кластерный анализ.
AnganovaE.V.12, SavilovE.D.12, SavchenkovM.F.23, ChemezovaN.N.2 - HETEROGENEITY OF MICROBIAL COMMUNITIES OF SURFACE WATERS ON INDICES OF ANTIBIOTIC RESISTANCE OF BACTERIA
1Irkutsk State Medical Academy of Postgraduate education, 664079, Irkutsk, Russian Federation; Research Center of Problems of Family Health and Human Reproduction, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Irkutsk, Russian Federation, 664003; 3Irkutsk State Medical University, 664003, Irkutsk, Russian Federation
Microorganisms isolated from reservoirs within urbanized areas, have acquired multiple antibiotic resistance, in this connection during the microbiological monitoring of water objects as an additional criterion of anthropogenic pollution it is worth to take into account indices of antibiotic resistance of bacteria. The study of heterogeneity of microbial communities of largest reservoirs in Eastern Siberia (Angara River and Lena) in terms of antibiotic resistance bacteria was performedfrom the positions of cluster structuredness. Opportunistic gram-negative bacteria and allochthonous representatives ofmicrobiocenoses of the water bodies were established to be characterized by belonging to four clusters (antibiotic sensitive, mono-, moderately - and poly-antibiotic resistant). At the same time the proportion of microorganisms belonging to different clusters, vary significantly both in terms of different water bodies, and in separate parts of the same body of water, being largely dependent on anthropogenic load on water. Thus, the heterogeneity of the microbial populations permits to present comparative quantitative assessment of reservoirs, as well as their portions, in terms of antibiotic resistance of microorganisms. The increment in the proportion of resistant strains reflects the sanitary and epidemiological importance of this property, because provides evidence of the contamination of water supplies by household sewage.
Keywords: surface water bodies; anthropogenic impact; microorganisms; antibiotic resistance; cluster analysis.
Введение. Современные тенденции глобализации приводят к возникновению серьезных рисков для здоровья населения, связанных с проблемами обеспечения безопасности водных ресурсов, их интенсивным микробиологическим загрязнением в результате сброса сточных вод [1]. Вода открытых водоемов является естественной средой обитания разнообразных микроорганизмов, сосуществующих в виде сложных ассоциаций - микробиоценозов, количественные и качественные характеристики которых могут существенно изменяться в условиях антропогенного воздействия [2, 3]. Поэтому при проведении микробиологического мониторинга водных объектов необходимо учитывать частоту встречаемости не только общих колиформных бактерий, но и других грамотрицательных форм бактерий [4], а также
Для корреспонденции: Анганова Елена Витальевна, eva. irk@mail.ru.
For correspondence: Anganova Elena, eva.irk@mail.ru.
показатели антибиотикоустойчивости микроорганизмов [5]. Отношение к антимикробным препаратам (АМП) является принципиально важным информативным свойством микроорганизмов, в том числе водных изолятов условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ) и аутох-тонных представителей микробиоценозов поверхностных водоемов. Исследования последних десятилетий показывают, что микроорганизмы, выделенные из водоемов в пределах урбанизированных территорий, обладают множественной антибиотикорезистентностью [5-9]. Приобретение резистентности микроорганизмов к АМП демонстрирует их эволюционную изменчивость под воздействием факторов окружающей среды [10, 11]. В связи с этим следует отметить, что АМП стали мощным фактором, определяющим микроэкологические изменения в популяциях бактерий, проявляющиеся в формировании их антибиотикорезистентности [8]. Полученные данные свидетельствуют о необходимости оптимизации системы мониторинга изменения антибиотикорезистент-ности микроорганизмов, циркулирующих в водоемах, в
]^1гиена и санитария 4/2014
условиях усиливающегося антропогенного прессинга.
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы являются изучение антибиотикорезистентности бактерий и оценка по данному показателю состояния микробиоценозов на примере двух крупнейших поверхностных водоемов Сибири - рек Ангара и Лена.
Материалы и методы
За период 1999-2008 гг. исследовано более 8000 штаммов микроорганизмов. Определение антибиоти-корезистентности микроорганизмов и интерпретацию результатов проводили согласно МУК 4.2.1890-04 [12]. Для определения чувствительности микроорганизмов использовали диско-диффузионный метод, среду Мюл-лера-Хинтона, паспортизованные стандартные наборы дисков (производство НИЦФ, Санкт-Петербург). Оценку гетерогенности микробных популяций водных экосистем проводили в соответствии с разработанным нами способом по индексу антибиотикорезистентности (ИАР) с позиции кластерной структурированности [9].
Для оценки резистентности по математическому показателю использовали индекс множественной антибио-тикорезистентности (МАР), определяемый по формуле:
МАР= X: У,
где X - количество антибиотиков, к которым резистентен штамм, У - число исследованных антибиотиков у данного штамма [13]. Однако индекс МАР, во-первых, не учитывает чувствительные штаммы, во-вторых, не дает критериев полирезистентности (т.е. не указывает, при какой величине МАР данный микроорганизм следует считать множественно резистентным), и, наконец, использование индекса МАР не предусматривает кластерного анализа полученных данных с учетом величины индекса. Учитывая изложенные выше ограничения, мы предложили группировать ИАР (по величине или диапазону величин) для проведения кластерного анализа полученных данных, что позволяет оценить антибиоти-корезистентность микробной популяции [9]. По величинам и диапазонам величин ИАР все индексы группируют в 5 кластеров. При этом шаг индекса составляет 0,05. В I кластер входит индекс, равный 0,0 (чувствительные штаммы), в II кластер - индекс, равный 0,05 (монорезистентные). III кластер (резистентные к 2-5 АМП) объединил 4 индекса в диапазоне 0,10 < ИАР < 0,25; в IV кластер (резистентные к 6 и более АМП) вошло самое большое количество индексов (15) в диапазоне 0,30 < ИАР < 0,95. V кластер (резистентные к максимальному количеству АМП, использованных в эксперименте) представлен одним индексом, равным 1,0. Указанные величины ИАР рассчитаны при использовании 20 АМП. В зависимости от количества антибиотиков величина ИАР во II, III и IV кластерах будет меняться. Величины индексов ИАР I и V кластеров неизменны при любом количестве тестируемых АМП. Значимость различий полученных величин оценивали по критерию Стьюдента с использованием поправки Бон-феррони для множественных сравнений с предварительной проверкой на нормальность распределения [14, 15].
результаты и обсуждение
Исследования позволили установить, что микробные популяции водных объектов представлены условно-патогенными микроорганизмами, входящими по ИАР в 3 (Ангара) и 4 (Лена) кластера. Отличительной особенностью микробиоценоза р. Лены (в отличие от р. Ангары) является присутствие штаммов, входящих в I кластер (чувствительных ко всем использованным в работе антибиотикам, ИАР 0,0) и составивших 4,3%. Что касается монорезистентных условно-патогенных грамотрицательных микроорганизмов, самой высокой (p < 0,05) частота их встречаемости (27,8 ± 4,3%) была в районе Южного Байкала (исток Ангары). Количество монорезистентных бактерий в микробных сообществах этой реки вблизи городов, испытывающих выраженную антропогенную нагрузку, оказалось значимо ниже и выглядело следующим образом: в районе Ангарска данный показатель составил 4,5%, Иркутска - 0,8% (с поправкой Бонферрониp < 0,025). Количество монорезистентных штаммов микробной популяции р. Лены в районе Якутска оставалось на том же уровне, что и в микробном сообществе реки на всей ее протяженности: 6,1 и 7,6% соответственно (р > 0,05).
Доминирующая часть УПЭ микробных сообществ изучаемых водоемов относилась к III кластеру - умеренно-резистентных (0,10 < ИАР < 0,25). Самая высокая частота встречаемости умеренно-резистентных штаммов была характерна для микробного сообщества р. Лены на всей ее протяженности (68,3%). Количество умеренно-резистентных штаммов в микробном сообществе р. Ангары на разных ее участках варьировало (исток реки 58,4%, в черте Иркутска 64,6%, в черте Ангарска 49,2%), однако данные различия не носили статистически значимого характера (p > 0,025 с поправкой Бонферрони).
Особый гигиенический и эпидемиологический интерес представляет оценка частоты встречаемости полирезистентных микроорганизмов (IV кластер), объединяющих большую группу бактерий, характеризующихся значительным количеством ИАР в диапазоне от 0,30 до 0,95. Установлено, что частота встречаемости по-лиантибиотикоустойчивых штаммов энтеробактерий в целом по р. Лене составила 19,8%, в то же время в районе Якутска удельный вес бактерий с данным свойством оказался в 2 раза выше (p < 0,01) (см. таблицу).
Аналогичная картина наблюдалась и в отношении р. Ангары, в истоке которой количество полиантибиотико-устойчивых штаммов составило 13,8% и оказалось значимо меньшим, чем в районе городов, где доля микро-
оценка антибиотикорезистентности (по иАр) водных штаммов УПЭ
Кластер
Водный объект I II III IV V
% Р % Р % Р % Р %
Р. Лена:
на всей 4,3 7,6 68,3 19,8 0,0
протяженности < 0,05 > 0,05 < 0,05 <0,05
в районе Якутска 0,0 6,1 53,5 40,4 0,0
Р. Ангара:
в районе Ангарска 0,0 4,5 49,2 46,3 0,0
в районе Иркутска 0,0 0,8 < 0,025* 64,6 > 0,025* 34,6 < 0,025* 0,0
исток р. Ангары 0,0 27,8 58,4 13,8 0,0
Примечание. * - c поправкой Бонферрони.
50-
45-
40-
35-
30-
25-
20-
15-
10-
5-
0-
р>0,05
Исток р. Ангары
организмов, входящих в IV кластер, увеличилась почти в 3 раза.
На исследованных участках водоемов количество полирезистентных штаммов оказалось значимо меньшим по сравнению с частотой встречаемости умеренно-резистентных микроорганизмов (р<0,05), за исключением участка в районе Ангарска, где количество бактерий, входящих в IV и III кластеры, было практически равным.
Среди УПЭ микробиоценозов исследованных водоемов отсутствовали изоляты, входящие в V кластер (т.е. резистентные ко всем протестированным АМП).
Таким образом, использование ИАР с выделением кластеров позволяет охарактеризовать гетерогенность микробных популяций водных экосистем и провести сравнительную количественную оценку по данному признаку микробиоценозов разных водоемов, а также микробных сообществ различных участков одного водоема.
Несомненный интерес представляет также изучение антибиотикорезистентности представителей аутохтонной составляющей водных объектов. Оценка антибиотико-резистентности аутохтонной микрофлоры, выделенной на всей протяженности р. Лены, показала присутствие микроорганизмов, относящихся по ИАР к 4 кластерам (Г-ГУ), со следующим распределением частот: 15,6% представителей аутохтонной микрофлоры вошли в I кластер, проявив чувствительность ко всем протестированным АМП (ИАР 0,0). Около половины микроорганизмов (45,1%) были отнесены ко II кластеру, т. е. оказались мо-норезистентыми и имели ИАР, равный 0,05. Третья часть (35,5%) исследованных штаммов проявили себя как умеренно-резистентные (III кластер). Полирезистентность выявлена у незначительной части аутохтонных бактерий: к IV кластеру принадлежало только 3,8% изолятов, что значимо меньше (р < 0,01), чем количество микроорганизмов II и III кластеров. Бактерии, входящие в V кластер, не выделены.
Иное распределение по кластерам аутохтонных микроорганизмов отмечено в районе Якутска, испытывающего выраженную антропогенную нагрузку. В черте города и его пригородов не выявлено аутохтонных представителей, чувствительных ко всем протестированным АМП (I кластер). Доля монорезистентных штаммов составила 24,2% и оказалась значимо меньшей, чем на протяжении всей р. Лены (р < 0,05). Основная часть ау-тохтонных грамположительных штаммов микробного сообщества реки в районе Якутска (70,3%) относилась к кластеру умеренно-резистентных микроорганизмов (0,10 < ИАР < 0,25), проявив резистентность к 2-5 АМП. Количество полирезистентных грамположительных микроорганизмов в районе Якутска составило только 5,5% и оказалось статистически значимо меньшим (р < 0,01), чем частота встречаемости штаммов бактерий, входящих во II и III кластеры.
Изучение антибиотикорезистентности представителей аутохтонной микрофлоры р. Ангары показало, что микробное сообщество, как и в р. Лене, было представлено бактериями 4 кластеров (I-[V). Грамположитель-ные микроорганизмы, входящие в I кластер, обнаружены только в истоке р. Ангары (3,5%). В районе Иркутска
р<0,01
р< 0,05
р<0,01
р<0,01
р. Ангара в районе Иркутска
р. Ангара в районе Ангарска
~г
"Г
р. Лена на всей протяженности
р. Лена в районе Якутска
Условно-патогенные грамотрицательные микроорганизмы Аутохтонные микроорганизмы
Количество полиантибиотикорезистентных кластеров (IV кластер) УПЭ и аутохтонных представителей микробиоценозов р. Ангары и Лены.
и Ангарска указанных штаммов не выявлено. Монорезистентные штаммы также наиболее широко представлены в истоке реки (26%). В районе Ангарска и Иркутска штаммы со свойством монорезистентности встречались реже и составили 19,6 и 13,6% соответственно. Подавляющая часть грамположительных микроорганизмов на исследованных участках реки была представлена умеренно-резистентными штаммами (III кластер): в районе Ангарска 75%, в районе Иркутска 79,6%, в истоке реки 70,5% (p > 0,025 c поправкой Бонферрони). Полирезистентные штаммы (IV кластер) выявлены только в районах антропогенного загрязнения (Ангарск - 5,4%, Иркутск - 6,8%). В истоке реки штаммы с данным свойством не обнаружены. Значимых различий между количеством полирезистентной аутохтонной микрофлоры, выделенной в районе сравниваемых городов, не обнаружено. В данной группе микроорганизмов отсутствовали штаммы с максимальным ИАР, равным 1,0 (V кластер).
Сравнительный анализ антибиотикорезистентности выявил наличие существенных различий в уровне изучаемого показателя между условно-патогенными гра-мотрицательными и аутохтонными микроорганизмами (см. рисунок).
Как следует из рисунка, практически во всех случаях УПЭ характеризовались значимо более высоким уровнем резистентности по сравнению с аутохтонными микроорганизмами. В истоке р. Ангары аутохтонных микроорганизмов, обладающих полирезистентностью, не обнаружено.
Сравнивая антибиотикорезистентность бактерий двух групп, следует отметить, что частота встречаемости условно-патогенных грамотрицательных бактерий, входящих в I и II кластеры, была значимо меньшей по сравнению с представителями аутохтонного сообщества (за исключением истока р. Ангары, где данные показатели оказались практически равными - 27,8 и 26% соответственно). В то же время энтеробактерии чаще характеризовались полиантибиотикорезистентностью. Данная закономерность имела место в отношении как исследованных водоемов, так и отдельных участков рек.
Заключение
Исследование показало, что загрязнение источников водоснабжения хозяйственно-бытовыми сточными
[гиена и санитария 4/2014
водами обусловливает увеличение в структуре микробиоценозов поверхностных водоемов доли бактерий, обладающих антибиотикорезистентностью. Установлено, что УПЭ и аутохтонные представители микробиоценозов водных объектов характеризуются принадлежностью (по индексам антибиотикорезистентности) к 4 кластерам (чувствительные, моно-, умеренно- и полирезистентные). При этом доли микроорганизмов, принадлежащих к разным кластерам, существенно варьируют в отношении как разных водных объектов, так и отдельных участков одного водоема, и зависят прежде всего от антропогенной нагрузки на водоемы. Выявленная закономерность, свидетельствуя о гигиенической и эпидемиологической значимости свойства антибиотикорези-стентности микроорганизмов, позволяет использовать его в качестве дополнительной количественной характеристики водоемов при их сравнительной оценке, связанной с потенциальной опасностью водных объектов для здоровья населения. В связи с этим для расширения возможностей и повышения информативности изучения поверхностных водоемов целесообразен комплексный подход, отражающий (помимо других аспектов) гетерогенность микробных популяций по показателю анти-биотикорезистентности с позиции кластерной структурированности. Данный подход имеет существенное значение, так как напрямую связан с антропогенной нагрузкой на водоемы.
Лите р атур а
1. Рахманин Ю.А., Доронина О.Д. Стратегические подходы управления рисками для снижения уязвимости человека вследствие изменения водного фактора. Гигиена и санитария. 2010; 2: 8-13.
2. Бухарин О.В., Немцева Н.В. Микробиология биоценозов природных водоемов. Екатеринбург: УрО РАН; 2008.
3. Логашова Н.Б. Эколого-микробиологический мониторинг качества питьевой воды города Саратова: Дис. ... канд. биол. наук. Саратов; 2009.
4. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Дмитриева Р.А., Доскина Т.В., Талаева Ю.Г., Иванова Л.В. и др. Проблемы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России. Гигиена и санитария. 2005; 5: 14-8.
5. Савилов Е.Д., Долженко Ю.А., Протодьяконов А.П., Мамонтова Л.М., Астафьев В.А., Анганова Е.В. и др. Эколого-эпидемиологическая оценка качества вод реки Лены. Новосибирск: Наука; 2006.
6. Макаров Ю.А., Горковенко Н.Е. Микробиологическая оценка воды природных водоемов Зейско-Буреинской равнины. Электронный научный журнал «Исследовано в России». Available at: http//www. zhurnaLape.relam.ru/artides/2007/123
7. Загайнова А.В. Разработка подхода к оценке риска возникновения бактериальных кишечных инфекций, распространяемых водным путем: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. М.; 2010.
8. Ларцева Л.В., Истелюева А.А. Геоэкологические особенности антибиотикорезистентной микрофлоры внутренних водотоков. Геология, география и глобальная энергия. 2011; 3: 180-6.
9. Анганова Е.В. Условно-патогенные энтеробактерии: доминирующие популяции, биологические свойства, медико-экологическая значимость: Автореф. дисс. ... д-ра биол. наук. Иркутск; 2012.
10. Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., Анганова Е.В., Астафьев В.А. Условно-патогенные микроорганизмы в водных экосистемах Восточной Сибири и их роль в оценке качества вод. Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2008; 1: 47-51.
11. Лисицкая И.А. Бактериальные сообщества некоторых компонентов экосистемы дельты Волги и Северного Каспия:
Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Астрахань; 2008.
12. МУ 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России; 2004.
13. Krumperman P.H. Multiple antibiotic resistance indexing of Escherichia coli to identify high-risk sources of fecal contamination of foods. Appl. Environ. Microbiol. 1983; 46(1): 165-70.
14. Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. М.: Практика; 1999.
15. Савилов Е.Д., Астафьев В.А., Жданова С.Н., Заруднев Е.А. Эпидемиологический анализ: Методы статистической обработки материалов. Новосибирск: Наука-Центр; 2011.
References
1. Rakhmanin Yu. A., Doronina O. D. Strategic approaches to risk management to reduce human vulnerability due to water factor changes. Gigiena i sanitariya. 2010; 2: 8-13. (in Russian)
2. Bukharin O.V., Nemtseva N.V. Microbiology of biocenoses of natural reservoirs Mikrobiologiya biotsenozov prirodnykh vodo-emov. Ekaterinburg: UrO RAN; 2008. (in Russian)
3. Logashova N.B. Ecological and microbiological monitoring of water quality in Saratov [Ekologo-mikrobiologicheskiy monitoring kachestva pit'evoy vody goroda Saratova]. Dis. Saratov; 2009. (in Russian)
4. Nedachin A.Ye., Artemova T.Z., Dmitriyeva R.A., Doskina T.V., Talayeva Yu.G., Ivanova L.V. et al. Problems of epidemic safety of drinking water use by the population of Russia. Gigiena i sanitariya. 2005; 5: 14-8. (in Russian)
5. Savilov E.D., Dolzhenko Y.A., Protod'iakonov A.P., Mamontova L.M., Astafiev V.A., Anganova E.V. et al. Ecological and epidemiological assessment of quality of water the river Lena [Ekologo-epidemiologicheskaya otsenka kachestva vod reki Leny]. Novosibirsk: Nauka; 2006. (in Russian)
6. Makarov Yu. A., Gorkovenko N.E. Microbiological assessment of water of natural reservoirs Zeya-Bureya plain. Elektronnyy nauchnyy zhurnal «Issledovano v Rossii». Available at: http// www. zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2007/123 (in Russian)
7. Zagainova A.V. The development of approaches to the assessment of the risk of bacterial intestinal infection spread by water. Diss. Moscow; 2010. (in Russian)
8. Lartseva L.V., Istelyueva A.A. Geological features of antibiotic-resistant microorganisms inland waterways. Geologiya, geo-grafiya i global'naya energiya. 2011; 3: 180-6. (in Russian)
9. Anganova E.V. Opportunistic Enterobacteriaceae: dominant populations, biological properties, medical and ecological significance. Dis. Irkutsk; 2012. (in Russian)
10. Savilov E.D., Mamontova L.M., Anganova E.V., Astafiev V.A. Opportunistic microorganisms in aquatic ecosystems of East Siberia and their role in the assessment of quality of water. Byul-leten' Sibirskogo otdeleniya Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk. 2008; 1: 47-51. (in Russian)
11. Lisitskaya I.A. Bacterial communities of some components of the ecosystem of the delta of the Volga and the North Caspian. Diss. Astrakhan; 2008. (in Russian)
12. Methodical instructions 4.2.1890-04. Determination of the sensitivity of microorganisms to antibiotics: Guidelines [MU 4.2.1890-04. [Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam: Metodicheskie ukazaniya]. Moscow: Federal'nyy tsen-tr Gossanepidnadzora Minzdrava Rossii; 2004. (in Russian)
13. Krumperman P.H. Multiple antibiotic resistance indexing of Esch-erichia coli to identify high-risk sources of fecal contamination of foods. Appl. Environ. Microbiol. 1983; 46(1): 165-70.
14. Glantz C. Biomedical statistics [Mediko-biologicheskaya statis-tika]: Translation from English. Moscow: Practika; 1999. (in Russian)
15. Savilov E.D., Astafiev V.A. Zhdanova C.N., Zarudnev E.A. The epidemiological analysis: The statistical processing of materials [Epidemiologicheskiy analiz: Metody statisticheskoy obrabotki materialov]. Novosibirsk: Nauka-Tsentr; 2011. (in Russian)
Поступила 14.05.13 Received 14.05.13
