CC BY
63
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
УДК 616.831—005..1—07:616.155.1—07:575.191
ГЕНОТИПЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С РАЗЛИЧНОМ СКОРОСТЬЮ NAVLr-ПРОШВОТРАНСПОРТА В МЕМБРАНЕ ЭРИТРОЦИТА
Нияз Рустемович Хасанов2, Дина Рустемовна Хасанова', Эльвира Маратовна Мухутдинова3, Владимир Николаевич Ослопов2, Петр Андреевич Сломинский4
' Кафедра неврологии и нейрохирургии ФПК и ППС (зав. — проф. В.И. Данилов),2 кафедра пропедевтики внутренних болезней (зав. — проф. В.Н. Ослопов) Казанского государственного медицинского
университета, 3Межрегиональный клинико-диагностический центр (ген. директор — канд. мед. наук Р.Н. Хайруллин) МЗ РТ, г. Казань,4Институт молекулярной генетики РАН (директор — чл.-корр. РАНН, проф. С.В. Костров), г. Москва, e-mail: [email protected]
Реферат
Выявлены ассоциации полиморфных маркеров ряда генов с диапазонами скорости пассивного трансмембранного ионотранспорта в мембране эритроцита у обследованных этнических татар. С учётом известного сочетания высокой скорости пассивного трансмембранного ионотранспорта с худшим неврологическим и функциональным дефицитом у больных ишемическим инсультом определена группа риска неблагоприятного течения данного заболевания.
Ключевые слова: полиморфизм генов, скорость пассивного трансмембранного ионотранспорта, ише-мический инсульт, татары.
Острая ишемия ткани головного мозга приводит к запуску большого комплекса генетических программ, часть из которых включается немедленно, принимая участие в ранней реакции клеток на ишемию, другие — позже, определяя механизмы отсроченной гибели клеток и последующих репаративных процессов. Известна способность генов раннего реагирования активировать экспрессию генов отсроченного реагирования, например отвечающих за программированную смерть клеток — апоптоз [4]. Доказана генетическая обусловленность течения ишемического повреждения головного мозга. При этом имеют значение не отдельно взятый ген, а эффект суммы полиморфизмов различных генов, их взаимовлияние и сочетание с другими генетически заданными особенностями организма, в том числе с факторами риска развития ишемическо-го инсульта, что, кроме того, может по-разному проявлять себя в разных возрастных группах [24]. Таким образом, многие работы посвящены изучению вклада комбинаций полиморфизмов различных генов — благоприятных и неблагоприятных —
на развитие ишемического инсульта и не исключают возможности влияния на течение ишемического инсульта какого-либо одного гена в большей степени, чем других (например, ген, кодирующий фос-фодиэстеразу 4D — PDE4D) [14, 23].
Выявлено, что для носителей определенных полиморфизмов генов рецептор-ного пути индукции апоптоза (для гена FADD полиморфизм G/G по сравнению с носителями A/A и A/G генотипов, для гена Fas полиморфизм 1677G/A) характерно развитие обширного инфаркта мозга, более тяжелое течение заболевания независимо от локализации сосудистого поражения [14]. Носительство DD генотипа ангиотензинпревращающего фермента достоверно повышает риск гемодинами-чески значимых стенозов магистральных артерий головы вне зависимости от наличия у пациентов ишемического инсульта [10]. Установлена высокодостоверная зависимость объема инфаркта головного мозга от Ваm HI полиморфизма одного из важнейших регуляторов апоптоза, гена белков теплового шока р53 [12, 13]. Корреляционный анализ между полиморфизмом в первом интроне гена медиатора глутаматовой токсичности PARP1 (поли (ADP( АДФ)-рибоза )-полимераза) — rs3219023 и ИБС, а также клиническими характеристиками инсульта выявил статистически достоверные корреляции с объемом инфаркта мозга и тяжестью состояния больных на разных сроках заболевания, определяя вариант более легкого течения инсульта. Генотип А/А по гену PARP1 ассоциирован с развитием и прогрессированием инсульта и представ-
7
ляет собой вариант тяжелого течения заболевания у больных, проживающих на территории России [15]. Обнаружено, что аллель С по 1УБ9-675СЛ полиморфизму гена фактора, индуцируемого гипоксией 1а типа — НШ-1Л, и генотипы С/С и С/А являются факторами повышенного риска развития ишемического инсульта в московской популяции [16].
Таким образом, многие исследования раскрывают вклад генотипа в процессы ишемического повреждения вещества головного мозга и доказывают генетическую детерминированность течения ише-мического инсульта.
Структурно-функциональное состояние плазматической мембраны, а именно состояние катионтранспортной функции также является генетически детерминированным признаком для клеток всего организма. Увеличение скорости пассивного трансмембранного ионотранспорта, характеризующегося нарушением диффузии одновалентных катионов и кальция, сопровождается снижением мембранного потенциала клетки, повышением проницаемости потенциалзависимых Са2+-кана-лов и приводит соответственно к увеличению потока Са2+ внутрь клетки [9]. А так как Са2+ играет ключевую роль в реакциях глутамат-кальциевого каскада, то изменение его концентрации не может не сказываться на интенсивности, выраженности ишемического повреждения, а также на количественных показателях поражения, выявляемых с помощью нейровизуализа-ционных методов.
Для оценки пассивного трансмембранного ионотранспорта использовался его лабораторный маркер — скорость №+/ Ы-противотранспорта (МЬС) в мембране эритроцита [19], определяемая по методу МХ. СапеББа й а1. [22]. Применение квар-тильного анализа распределения величины скорости МЬС обусловлено тем, что кривая распределения скорости МЬС в популяции асимметрична, что свидетельствует об участии не одного, а множества генов в создании данного фенотипа.
Выявлена ассоциативность ряда других заболеваний с уровнем скорости МЬС. Так, найдена связь генетически заданных мембранных свойств клеток с особенностями течения гипертонической болезни [9], язвенной болезни желудка, особеннос-8
тями проявления синдрома вегетативной дисфункции [17, 18], рассеянного склероза [8], заболеваниями дыхательной системы [7], сахарного диабета [2], а также реакцией на терапию при данных заболеваниях [21]. Также определена корреляция между значениями №+/Ы+-противотранспор-та и частотой, интенсивностью возникновения цереброваскулярных заболеваний у больных васкулитом и сахарным диабетом [5].
В ранее проведенных нами исследованиях была определена взаимосвязь выраженности неврологического и функционального дефицита у пациентов в острейшем и остром периодах ишемическо-го инсульта на момент поступления и к концу наблюдения от величины скорости №+/Ы+-противотранспорта. Было показано, что высокая скорость МЬС сочетается с худшим неврологическим и функциональным дефицитом к концу наблюдения (на 21-е сутки) и ассоциировалась с более значимыми диффузионными изменениями в зоне ишемии по данным Б^Е МРТ [18, 19]. Это может дать основание для предикции тяжести течения инсульта с учетом возможного совокупного вклада генетических ассоциаций.
В работе А.А. Курмышкина и др. [6] выявлено, что русские и татары имеют достаточно близкую генетическую дистанцию. Вместе с тем в исследовании М.Г. Андреевой [1] показаны различия в развитии артериальной гипертонии у русских и татар казанской популяции носителей генотипа МТ в 174-м положении гена ангиотензиногена, что демонстрирует значимость выбора этнически однородной популяции при проведении генетических исследований.
Целью настоящего исследования было изучение особенности полиморфизма генов, белковые продукты которых принимают участие в реализации программ реакции клеток на ишемию, в квартилях распределения скорости №+Щ+-про-тивотранспорта в мембране эритроцита исходя из положения о том, что высокие скорости пассивного ионного транспорта более дизадаптивны.
В исследовании принимали участие 225 человек, относящихся к татарскому этносу. У всех обследованных изучали особенности полиморфизма генов:
G603A гена транспортёра глутамата EAAT; 2) rs545098 G/A гена ионотропно-го рецептора глутамата GLUR1 (АМРА1); 3) rs9307959 C/T гена ионотропного рецептора глутамата GLUR2 (АМРА2); 4) rs189994 C/T гена апоптозиндуцирующего фактора AIF; 5) rs1052576 G/A гена каспа-зы 9 CASP9; 6) rs3219023 A/G гена медиатора глутаматовой токсичности PARP1.
Для типирования полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов были использованы препараты ДНК, полученные из 5 мл венозной крови обследуемых. ДНК из клеток крови человека выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Полиморфизм генов определяли методом ПЦР на амплификаторе фирмы "ДНК-технология" (Россия). Для анализа фрагментов ДНК, получаемых в ходе ПЦР, проводили вертикальный электрофорез в 6% полиакриламидном геле. Для обнаружения наличия сайта рестрикции выполняли рестрикционный анализ соответствующими рестриктазами.
У всех обследованных оценивали уровень скорости пассивного трансмембранного ионотранспорта по максимальной скорости №+Щ+-противотранспорта в мембране эритроцита [22]. Скорость NLC определяли путём измерения обмена внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации. Для этого Na+ замещали в эритроцитах на Li+ путем прединкубации (в течение 3 ч) в среде, содержащей изоосмотическую смесь концентрации LiCl при блокированной уаба-ином №+-К+-АТФазы. О скорости Na+/Li+ обмена судили по разности выхода Li+ (через 60 мин инкубации) в среду, содержащую изоосмотическую концентрацию NaCl, и среду, содержащую изоосмотичес-кую смесь MgCl2 и сахарозы. Кинетику выхода лития из клеток регистрировали методом атомной абсорбционной спектро-фотометрии в эмиссионном режиме. Диапазон скорости NLC у обследованных варьировал в пределах от 159 до 487 мкмоль Li/л кл. в 1 ч. Клинические ассоциации изучали по диапазонам скорости NLC, определяемых с применением квантиль-ного метода с квартильным (кв.) распределением значений NLC. При делении на квартили, лежащего в основе принципа группирования обследованных, исполь-
зовались результаты ранее проведенных популяционных исследований. Соответственно к I кв. отнесены значения до 203 (в мкмоль Ы/л кл. в 1 ч), ко II кв. — от 204 до 271, к III кв. — от 272 до 345, к IV кв. — от 346 [3].
Статистическую обработку данных производили с помощью пакета программ Ыс^аИБИеБ 4,0. Рассчитывали средние величины, средние стандартные ошибки и доверительный 95% интервал. Сравнение распределения частот аллелей и генотипов в обследованных группах проводили с использованием точного критерия Фишера. Различия считали статистически достоверными при р<0,05.
Распределение полиморфных вариантов изучаемых генов по квартилям МЬС у обследуемых представлено в табл. 1.
Таблица 1
Распределение частот генотипов в квартилях скорости
Генотипы Квартили скорости
I II III IV
EAAТ
exon 5 G603A
GG 0,18 0,09 0,04 0,05
AG 0.54 0,36 0.50 0,68
AA 0,29 0,55 0,46 0,26
CASP9
rs 1052576, G\A
GG 0,46 0,43 0,62 0,37
AG 0,43 0,5 0,35 0,42
AA 0,11 0,07 0,04 0,21
PARP1
rs3219023, A\G
GG 0,18 0,23 0 0,26
AG 0,32 0,32 0,58 0,53
AA 0,5 0,45 0,42 0,21
AIF
rs189994 C\T
TT 0,46 0,25 0,19 0,26
TC 0,21 0,41 0,15 0,26
CC 0,32 0,34 0,65 0,47
GLUR 1
rs545098, G\A
GG 0,86 0,82 0,85 0,84
AG 0,11 0,02 0,04 0,11
AA 0,04 0,16 0,12 0,05
GLUR2
rs9307959 C\T
TT 0,07 0,11 0,04 0
TC 0,21 0,41 0,23 0,26
CC 0,71 0,48 0,73 0,74
Анализ частоты встречаемости изучаемых генотипов в квартилях МЬС выявил достоверные различия (р<0,05), представленные в табл. 2.
Таблищ 2
Популяционные различия генотипов в квартилях скорости трансмембранного ионотранспорта
Ген апоптоз индуцирующего фактора (AIF rs189994 C/T ) Большая частота встречаемости Меньшая частота встречаемости
генотип ТТ генотип СС генотип ТС I кв. - 0,46 Ш кв. - 0,65 II кв. - 0,41 Ш кв. - 0,19 I кв. - 0,32; II кв.- 0,34 III кв. - 0,15
Ген транспортера глутамата (ЕААТ exon 5 G603A )
генотип АА генотип AG II кв. - 0,55 IV кв. - 0,68 I кв. - 0,29; IV кв. - 0,26 II кв. - 0,36
Ген ионотропных рецепторов глутамата (GLUR2 rs9307959 C/T)
генотип СС I кв. - 0,71; Ш кв. - 0,73 II кв. - 0,48
Ген медиатора глута-матовой токсичности (PARP1 rs3219023 A/G )
генотип GG генотип AG I кв. - 0,18 II кв. - 0,23 IV кв. - 0,26 III кв. - 0,58 III кв.- 0,00 II кв. - 0,32
В настоящей работе получены доказательства неравномерности сцепления некоторых генов с интервалами скорости (квартилями) МЬС. Установлены статистически значимые корреляции частоты встречаемости полиморфизмов гена Л1Б для следующих квартилей: для I квартиля характерно преобладание генотипа ТТ, статистически значимо отличающегося от III квартиля (0,46 и 0,19; р<0,05), для которого, в свою очередь, получены достоверно более высокие значения частоты генотипа СС по сравнению с таковыми в I и II квартилях (0,65 соответственно к 0,32 и 0,34; р<0,05). Во II квартиле частота встречаемости генотипа ТС превышала частоту встречаемости в III квартиле (0,41 и 0,15; р<0,05). Для гена ЕЛЛТ характерным было преобладание генотипа АА во II квартиле по сравнению с I и IV квартилями (0,55 соответственно к 0,29 и 0,26; р=0,05) и генотипа ЛО в IV квартиле по сравнению со II квартилем 10
(0,68 и 0,36; р<0,05). Распределение генотипа гена GLUR2 показало статистически значимо меньшие показатели для генотипа СС во II квартиле по сравнению с I и III (частота — 0,48 соответственно к 0,71 и 0,73; р<0,05). Генотип GG гена PARP1 не был выявлен ни у одного пациента в III квартиле, что статистически значимо отличалось от I, II и IV квартилей (0,00 по сравнению с 0,18, 0,23 и 0,26 соответственно; р<0,05). В то же время в III квартиле значимо преобладал генотип AG по сравнению со II квартилем (0,58 и 0,32; р<0,05). Не выявлены достоверные ассоциации частоты встречаемости генов GLUR1, CASP9 со шкалой распределения скорости NLC (р>0,05).
Сочетание комбинаций генотипов разных генов в пределах одного квартиля может быть благоприятным или неблагоприятным, что требует дальнейшего изучения на большей популяции пациентов с ишемическим инсультом с использованием молекулярно-генетических методов исследования структуры генотипов.
Таким образом, ранее выявленные особенности течения ишемического инсульта у больных с различной квартиль-ной принадлежностью по распределению скорости пассивного трансмембранного ионотранспорта могут стать основой для дальнейшего комплексного исследования значений генетических факторов в реализации тяжести течения острого нарушения мозгового кровообращения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андреева М.Г. Роль полиморфизма Т174М гена ан-гиотензиногена в формировании предрасположенности к артериальной гипертензии, особенностях ее течения и выборе гипотензивного препарата в зависимости от генотипа: Автореф. дисс.... канд.мед.наук. — Казань, 2003. — 101с.
2. Балаболкин М.И., Белоярцева М.Ф. Роль Na+H+обменника в патогенезе сахарного диабета 2 типа [Электронный ресурс] // Сахарный диабет. — 2001. — №2: сайт.- URL:http://www.tatmedia.com/fs/wrlk_ opisanie_smi/89_fieldfullim/kazmed_pravila. doc
3. Богоявленская О.В., Ослопов В.Н., Набиуллина Р.Р. и др. Особенности взаимосвязи состояния мембранной проницаемости эритроцитов по натрию и развития артериальной гипертензии у женщин в популяции // Росс. кардиол. журн. — 2004. — № 5. — С. 51—57.
4. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. — М.: Медицина, 2001. —328 с.
5. Заббарова А.Т., Ослопов В.Н. Клинико-нейрови-зуализационные и ион-транспортные особенности со-
судистых многоочаговых поражений головного мозга различной этиологии // Вестн. МКДЦ. — 2003. — № 1. — С. 83—88.
6. Курмышкин А.А., Исмагилов М.Ф., Тананов А.Т. HLA-антигены у лиц со склонностью к частым симпато-адреналовым пароксизмам./Генетика человека и патология. Мат. II итоговой конф. — Томск, 1992. — С. 114—116.
7. Пикуза О.И, Кораблева А.А, Ослопов В.Н., Вахи-тов Х.М. Функциональная характеристика клеточных мембран при бронхообструктивном синдроме у детей// Росс. педиатр. журн. — 2004. — № 6. — С. 10—13.
8. Попова Н.А, Матвеева Т.В., Ослопов В.Н. Состояние ионной проницаемости мембран у больных рассеянным склерозом на примере Na/Li противотранспор-та// Вестн. МКДЦ. — 2004. — № 1. — С. 44—47.
9. Постнов Ю.В, Орлов С.Н. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран. — М.: Медицина, 1987. — 192 с.
10. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А. и др. Полиморфизм гена ангиотензинпревращающего фермента у больных с ишемической болезнью головного мозга // Инсульт. —2001. — № 3. — С. 21—27.
11. Скворцова В.И. Участие апоптоза в формировании инфаркта мозга. // Инсульт. — 2001. — № 2. — С. 12—18.
12. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А. и др. Ассоциация Ват HI RELP полиморфизма гена р53 с объемом инфаркта мозга у пациентов с атеротром-ботическим ишемическим инсультом. // Инсульт. — 2003. — № 8. — С. 24—29.
13. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А. Шетова И.М. Генетические аспекты ишемического инсульта // Росс. мед. журн. — 2006. — № 5. — С. 26—31.
14. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А. и др. Ассоциация полиморфизмов генов рецепторного (FADD, Fas) и митохондриального (PARP-1, р53) путей индукции апоптоза с объемом инфаркта мозга у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом // Журн. неврол. и психиатр. — 2007. — № 19. — 48—55.
15. Тупицина Т.В. Молекулярно-генетический анализ факторов риска коронаросклероза и ишемической болезни мозга: Автореф. дис. ...канд. биол. наук. — М., 2007.
16. Тупицына Т.В., Сломинский П.А., Шадрина М.И. и др. Ассоциация полиморфизма IVS9-675C>A в гене HIF-1a с развитием острого атеротромботического инсульта в московской популяции // Генетика. — 2006. — Т42. —№ 5.— С. 703—705.
17. Хасанова Д.Р. Мембранные основы синдромов вегетативной дисфункции: Автореф.. дисс. ...докт. мед. наук. — Казань, 1999. — 64 с.
18. Хасанова Д.Р., Ибатуллин М.М., Мухутдино-ва Э.М, Данилова Т.В. Особенности нейровизуализаци-онных характеристик в остром периоде ишемического инсульта у больных с различной скоростью пассивного трансмембранного ионотранспорта в мембране эритроцита / I Нац. конгресс. Кардионеврология. — М., 2008. — С. 373.
19. Хасанова Д.Р., Ослопов В.Н., Мухутдинова Э.М. и др. Особенности ишемического инсульта у больных с различной скоростью Na+/Li+ противотранспорта в мембране эритроцита // Практ. мед. — 2007. — №3 (22). — С. 9—11.
20. Хасанова Д.Р., Якупов Э.З., Аглиуллина А.К. и др. Показатели ритма сердца у больных с паническими атаками различной степени тяжести с учетом функционального состояния клеточных мембран // Вестн. МКДЦ. — 2003. — № I. —С. 28—33.
21. Хасанов Н.Р. и др. Скорость Na+/Li+ противотран-спорта в мембране эритроцита — новый подход к ан-тигипертензивной терапии// Вестн. МКДЦ. — 2003. — № I. — С. 131—135.
22. Canessa M.L., Adragna N.C., Solomon H.S. et al. Increased sodium-litium countertransport in red cells of patients with essential hypertension // New England Journal Medicine. —1980. — Vol. 302. — № 14. — P. 772—776.
23. Gretarsdottir S., Thorleifsson G, Reynisdottir S.T. et al. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke // Nature Genetis. — 2003. — Vol. 35. — № 2. — P.131—138.
24. Pezzini A, Grassi M, Del Zotto E. et al. Cumulative effect of predisposing genotypes and their interaction with modifiable factors on the risk of ischemic stroke in young adults. // Stroke. — 2005. — Vol. 36. 3. — P. 533—539.
Поступила 06.03.09.
DIFFERENCES IN GENOTYPES IN SPEED QUARTILES OF NA+/LI-COUNTER-TRANSPORT IN ERYTHROCYTE MEMBRANES IN THE TATAR POPULATION
N.R. Khasanov, D.R. Khasanova, E.M. Muhutdinova, V.N. Oslopov, P.A Slominsky
Summary
Established were the associations of polymorphic markers of several genes with speed ranges of passive transmembrane ion transport in erythrocyte membranes in the examined ethnic group of Tatars. Given the well-known combination of high-speed passive transmembrane ion transport with neurological and functional deficits in patients with ischemic stroke identified was a risk group for a poor prognosis of this disease.
Key words: gene polymorphism, passive transmembrane ion transport, ischemic stroke, the Tatars.
