CC BY
18
Original articles
Оригинальные статьи
Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet 2022, vol. 12, no. 1, pp. 59-68
Инфекция и иммунитет 2022, Т. 12, № 1, с. 59-68
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА, ВЫДЕЛЕННЫХ У РЕЦИПИЕНТОВ СОЛИДНЫХ ОРГАНОВ
ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия
Резюме. Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) остается одной из главных проблем современного здравоохранения. Она относится к категории социально и экономически значимых инфекций, поражает как детей, так и взрослых, характеризуется полиморфизмом клинических проявлений и многообразием путей и факторов передачи. Серьезной проблемой является заражение цитомегаловирусом (ЦМВ) реципиентов крови и органов. Следует отметить, что несмотря на большую медицинскую и социальную значимость инфекции система эпидемиологического надзора и контроля за ЦМВИ в том виде, в котором она существует применительно к другим актуальным инфекциям, в РФ отсутствует. Цель исследования — провести поиск оптимальных вариантов генотипирования цитомегаловирусов и оценку генотипового разнообразия российских изолятов ЦМВ, выделенных у пациентов, перенесших трансплантацию солидных органов. В статье представлены результаты исследования образцов крови, лейкоцитарной массы, слюны, мочи и слезного отделяемого, взятых у 160 пациентов отделения трансплантологии Приволжского окружного медицинского центра ФМБА в возрасте от 22 до 64 лет, перенесших трансплантацию печени и почек. Для тестирования образцов применялись молекулярно-биологические и серологические методы. Генотипирование проводили путем NGS-секвенирования фрагментов ДНК ЦМВ. Установлена высокая частота выявления ДНК ЦМВ у пациентов, перенесших трансплантацию солидных органов. У 41,8±3,8% пациентов была обнаружена ДНК цитомега-ловируса в образцах слюны и мочи, а у 18,1±3,04% из них — в образцах крови. У 98,8±3,2% пациентов диагноз «Цитомегаловирусная инфекция» был подтвержден серологически. По результатам анализа литературы проведена оценка различных методических подходов к генотипированию клинических изолятов ЦМВ. В результате был подобран и апробирован на клинических образцах вариант типирования, основанный на определении генотипов по двум вариабельным генам — И55 ^В), И73 Определены спектры и долевое распределение gB- и gN-генотипов ЦМВ, циркулирующих среди взрослых. Установлено, что в группе пациентов, перенесших трансплантацию солидных органов, превалируют генотипы gB2, gN4c, gN4a и gN1. В некоторых случаях обнаружена смешанная инфекция, обусловленная ассоциацией двух и трех генотипов ЦМВ. Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов UL55 и И73 свидетельствует о генетической гетерогенности российских изолятов ЦМВ, выделенных у взрослых пациентов группы риска.
Ключевые слова: цитомегаловирус, цитомегаловирусная инфекция, трансплантация солидных органов, генотипирование, частота встречаемости.
Адрес для переписки: Contacts:
Ванькова Ольга Евгеньевна Olga E. Vankova
603950, Россия, Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, 71, 603950, Russian Federation, Nizhny Novgorod,
ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии Malaya Yamskaya str., 71, Blokhina Scientific Research Institute
им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. of Epidemiology and Microbiology.
Тел.: 8 920 022-63-80. Phone: +7 920 022-63-80.
E-mail: voe0@mail.ru E-mail: voe0@mail.ru
Для цитирования: Citation:
Ванькова О.Е., Бруснигина Н.Ф. Генотипирование клинических изолятов Vankova O.E., Brusnigina N.F. Genotyping clinical cytomegalovirus isolates
цитомегаловируса, выделенных у реципиентов солидных органов // In solid-organs-transplant recipients // Russian Journal of Infection
Инфекция и иммунитет. 2022. Т. 12, № 1. C. 59-68. doi: 10.15789/2220- and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2022, vol. 12, no. 1, pp. 59-68.
7619-GCC-1653 doi: 10.15789/2220-7619-GCC-1653
© Ванькова О.Е., Бруснигина Н.Ф., 2022 DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-GCC-1653
О.Е. Ванькова, Н.Ф. Бруснигина
GENOTYPING CLINICAL CYTOMEGALOVIRUS ISOLATES IN SOLID-ORGANS-TRANSPLANT RECIPIENTS
Vankova O.E., Brusnigina N.F.
Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian Federation
Abstract. Cytomegalovirus infection remains one of the leading problems in contemporary healthcare. It belongs to socially and economically significant infections with a high incidence both in children and adults, characterized by polymorphic clinical manifestations and a variety of routes and factors for infection transmission. CMV infection of blood and organ recipients is a serious problem. It should be noted that, despite the great medical and social significance, in the Russian Federation there is no system of CMV epidemiological surveillance and control as it was traditionally developed for other topical infections. The aim of this study is to search for optimal method of cytomegalovirus (CMV) genotyping and estimate geno-typic diversity of CMV isolates in Russia for patients underwent solid organ transplantation. The research presents the data after examining blood samples, leukocytes, saliva, urine and lacrimal discharge collected from 160 patients at the Transplantation Department of the Privolzhsky District Medical Center of the FMBA, aged 22 to 64 years, after liver and kidney transplantation. Molecular biological and serological methods were used for testing. Genotyping was carried out by the NGS sequencing of CMV DNA fragments. A high prevalence of CMV was found in patients undergoing solid organ transplantation. For 41.8+3.8% patients, cytomegalovirus DNA was detected in saliva and urine samples, and for 18.1+3.04% of them — in blood samples. In 98.8+3.2% of patients, the diagnosis of Cytomegalovirus infection (CMVI) was confirmed serologically. Based on a summary of reported data, estimation of various methodological approaches for genotyping of clinical CMV isolates was carried out. As a result, a typing option based on genotype determining for two variable genes UL55 (gB) and UL73 (gN) was selected. The spectra and proportional distribution of gB and gN CMV genotypes circulating among adults were determined. It was found that genotype prevalence in the group of patients who underwent solid organ transplantation was as follows: gB2, gN4c, gN4a, gN1. In some cases, a mixed infection was found due to the association of two and three CMV genotypes. The performed phylogenetic analysis of UL55 and UL73 gene nucleotide sequences indicates the genetic heterogeneity found for Russia-wide CMV isolates from in adult patients in the risk group.
Key words: cytomegalovirus, cytomegalovirus infection, solid organ transplantation, genotyping, prevalence.
Введение
Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) остается одной из главных проблем современного здравоохранения. Она относится к категории социально и экономически значимых инфекций, поражает как детей, так и взрослых и характеризуется полиморфизмом клинических проявлений и многообразием путей и факторов передачи. Одной из областей с высоким риском поражения цитомегаловирусом (ЦМВ) является трансплантация органов, поскольку фактором передачи инфекции служит не только перелитая кровь, но и пересаживаемый орган. Пациенты, перенесшие трансплантацию органов, нуждаются в приеме иммуносупрессивных препаратов, что повышает риск инфицирования ЦМВ и развития инфекции. По данным литературы, частота выявления цитомегало-вируса у пациентов, перенесших трансплантацию печени, варьирует от 23 до 85%, при этом у 15—40% из них развивается активная форма ЦМВИ [2, 9, 11].
Исследования зарубежных авторов свидетельствуют о том, что штаммы ЦМВ человека являются близкородственными. Гомология ДНК различных штаммов составляет 90—95%. Генетические различия среди ЦМВ-штаммов равномерно распределены по всему геному, но в отдельных регионах наблюдается высокий уровень мутаций. Эти области находятся
в строго определенных участках вирусного генома, что гарантирует существование четких геномных вариантов, или «генотипов» [4].
Полиморфные гены используются как эпидемиологический маркер при изучении циркуляции вируса в человеческой популяции [15]. В ряде работ показано, что геномные варианты ЦМВ-штаммов из различных географических регионов могут быть идентичными, существенно отличаются лишь показатели частоты их встречаемости [3]. Исследования, направленные на определение циркулирующих в Российской Федерации генотипов ЦМВ, необходимы как для получения объективной информации о региональных особенностях распространения, так и для решения различных задач эпидемиологического надзора за ЦМВИ, а также для оценки целесообразности применения разрабатываемых за рубежом вакцин.
Цель исследования — поиск оптимальных вариантов генотипирования цитомегаловиру-сов и оценка генотипового разнообразия клинических изолятов ЦМВ, выделенных у пациентов, перенесших трансплантацию солидных органов.
Материалы и методы
В исследование были включены образцы биологических субстратов (кровь, лейкоцитарная масса, слюна, моча, слезное отделяемое),
поступившие из отделения трансплантологии Приволжского окружного медицинского центра ФМБА от 160 пациентов, перенесших трансплантацию печени и почек. От всех пациентов было получено информированное согласие на участие в исследовании. Отбор и транспортировку клинического материала во ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной проводили сотрудники Приволжского окружного медицинского центра ФМБА России в соответствии с МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории».
Детекцию ДНК ЦМВ осуществляли методом ПЦР в режиме реального времени с применением коммерческих диагностических тест-систем «АмплиСенс CMV-FL» производства ЦНИИЭ (Москва). Выделение ДНК проводили с использованием коммерческих наборов «ДНК-сорб-АМ» и «ДНК-сорб-В» (ЦНИИЭ, Москва) в соответствии с инструкцией по применению. Чувствительность тест-систем согласно паспортным данным составляет 1000 вирионов в 1 мл образца.
Серологические исследования проводили с использованием наборов реагентов для им-муноферментного выявления иммуноглобулинов классов G и М к ЦМВ производства АО «Вектор-Бест» (Новосибирск) ВектоЦМВ-IgG (РУ № ФСР 2012/13834) и ВектоЦМВ-IgM (РУ № ФСР 2012/13931).
Для генотипирования были отобраны 16 образцов ДНК ЦМВ от пациентов, перенесших трансплантацию органов. Секвенирование участков генома ЦМВ выполнено с применением технологии высокопроизводительного секвенирования (NGS) на платформе MiSeq (Illumina, США)
Концентрацию ДНК в образцах определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, Австрия) с использованием набора Qubit DNA HS Assay Kit (Invitrogen, США). Подготовку библиотеки ДНК для секвенирования осуществляли с использованием набора Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (Illumina, США) согласно инструкции производителя. Оценку качества подготовленной библиотеки ДНК для секвенирова-ния определяли с использованием флуориметра Qubit и автоматизированной системы капиллярного гель-электрофореза QIAxcel Advanced System (Qiagen, Германия), набора реагентов для быстрого разделения фрагментов ДНК QIAxcel DNA Fast Analysis Kit (3000) (Qiagen, Германия) и программного обеспечения QIAxcel ScreenGel (Qiagen, Германия). Секвенирование проводили с использованием набора MiSeq Reagent Kit v2 (Illumina, США) на 500 циклов.
Выравнивание и сборку полученных коротких чтений относительно референс-генома осущест-
вляли с использованием встроенного в секвена-тор программного обеспечения. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программу CLC Genomics Workbench 5.5 (CLC bio, США).
В качестве референс-последовательнос-тей были выбраны последовательности генов UL55 (gB), UL73 (gN) штаммов ЦМВ с известными геномами, взятыми из базы данных GenBank: GQ466044, HCU66425, HS5GLYBM, HS5GLYBL, HS5GLYBK, X04606, GQ221975, X17403, BK000394, FJ527563, HS5GLYBI, GQ121041, AY446894, M60929, HCU66425, GQ466044, EU686456, EU686440, AF309995, AF224677, AF390785, AF309993, AF309987, EU686430, AF390802, AF309986, AF309975, AF309974, AF310006, AF309988, AF309980, AF309975, AF309969, GU647095, GU441773, GU376726, GU376725, GU376724, GU376723, GU376721, GU376720. Визуализацию и анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения UGENE Unipro.
Анализ последовательности генов UL55(gB) и UL73(gN) ЦМВ проводили с использованием алгоритма BLAST и пакета программ, представленных на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast). Выравнивание последовательностей осуществляли с помощью программы Clustal X 2.0 (http://bips.ustrasbg.fr/fr/Documenta-tion/ClustalX) [12].
Филогенетический анализ исследуемых нук-леотидных последовательностей генов и построение филогенетических деревьев проводили с использованием программного обеспечения MEGA 10.
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием пакетов статистических программ Stata, Statistica 6.0.
Результаты
Результаты проведенного исследования показали высокую частоту выявления ЦМВ у пациентов, перенесших трансплантацию солидных органов, в различных биологических субстратах. У 67 (41,8+3,8%) пациентов — реципиентов органов обнаружена ДНК цито-мегаловируса в образцах слюны и мочи, а у 29 (18,1+3,04%) — в образцах крови. Следует отметить, что частота выявления ДНК ЦМВ у реципиентов почек была выше, чем у реципиентов печени (46,7+3,9 и 28,6+3,6% соответственно). При этом в 72,4+5,4% случаев из числа позитивных на ЦМВ была зарегистрирована клинически значимая концентрация (105—109 вирусных частиц/мл) ДНК ЦМВ в образцах лейкоцитарной массы. Гендерный анализ частоты обнаружения ЦМВ не выявил различий. Частота обнаружения ЦМВ в крови у мужчин после
пересадки органов составила 20,0%, а у женщин — 20,8%, в образцах слюны и мочи у мужчин — 44,0%, у женщин — 41,5%.
Диагностика ЦМВИ должна быть комплексной и включать как молекулярно-генетические методы индикации ЦМВ, так и серологические методы исследования. Диагноз ЦМВИ был подтвержден серологически: антитела класса G выявлены у 98,8+3,2% пациентов, перенесших пересадку солидных органов. Антитела класса М были выявлены у 12,2+3,4% пациентов, при этом ДНК ЦМВ обнаружена у 36,6+14% IgM-позитивных пациентов. Согласно данным литературы, ЦМВИ относится к инфекциям с нетипичной динамикой антителообразо-вания, при которой наличие специфических ^М не является достоверным и достаточным признаком для определения стадии заболевания [22]. Для дифференциации первичной ин-
Таблица 1. Характеристика праймеров, использованных для генотипирования ЦМВ
Table 1. Characterization of primers used for CMV genotyping
фекции и реинфекции (реактивации) принято использовать индекс авидности IgG в комплексе с другими серологическими маркерами ЦМВИ. В проведенном нами исследовании было показано, что все образцы являются вы-сокоавидными. Низкоавидные анти-IgG были идентифицированы лишь в одном образце.
С целью поиска оптимального алгоритма генотипирования клинических изолятов ЦМВ был проведен анализ данных литературы. В результате были выбраны и апробированы на контрольном штамме ЦМВ AD169 несколько пар праймеров: для гена UL55 — 14 пар, для гена UL73 — 5 пар. Критериями отбора были соответствие праймеров анализируемой области гена, качество нарабатываемого фрагмента, оптимальная температура отжига праймеров, размер получаемого фрагмента. Характеристика последовательностей праймеров для генотипи-рования ЦМВ, опубликованных различными авторами, представлена в табл. 1.
Для проведения генотипирования ЦМВ по генам UL55 (gB) и UL73 (gN) были отобраны праймеры, предложенные Chou S. с соавт. в 1991 г. и Pignatelli S. с соавт. в 2003 г. соответственно [4, 18]. В табл. 2 представлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, отобранных праймеров и 7 референс-штаммов ЦМВ, зарегистрированных в международной базе GenBank.
Таблица 2. Сравнение отобранных праймеров для генов UL55 (gB) и UL73 (gN) с нуклеотидными последовательностями семи референсных штаммов ЦМВ
Table 2. Comparison between the selected primers for the genes UL55 (gB) and UL73 (gN) and the nucleotide sequences from 7 reference CMV strains
Последовательность праймеров Primer sequence Источник Source
gB up1 5'-tggaactggaacgtttggc-3' gB lo1 5'-gcaccttgacgctggtttgg-3' gB lola 5'-gaaacgcgcggcaatcgg-3' [6]
gB up2 5'-gatctcctgggatatacaggacg-3' gB lo2 5'-gaatygctgarggyttgatcttg-3' gB up3 5'-acrttctgggaagcctcggaacg-3' gB lo3 5'-gagttccttgaagacctctag-3' [1]
gB up4 5'-cctcatcgctgctggatt-3' gB lo4 5'-tgactcccaccacatctc-3' gB up5 5'-atttggcccgcgacgaacat-3' gB lo5 5'-ctccgtacttgagggtagtg-3' [21]
gBNF 5'-ggatctggtgcctggtagtc-3' gBNR 5'-cgaataagatccgtaccctg-3' CLZ F 5'-tgttctggcaaggtatcaagaa-3' CLZ R 5'-gtgaactgcagctgggcgta-3' [10]
gB1 forward 5'-tcaccattcctctcrtacgac-3' gB1 reverse 5'-caccatggctgaccgtttgg-3' gB2 forward 5'-ctttaaggtacgggtctaccaa-3' gB2 reverse 5'-gaactgtagcattgggcaaact-3' gB3 forward 5'-ccggtgtgaactccacgcg-3' gB3 reverse 5'-gattcgctttcargygacagg-3' gB4 forward 5'-tcgtgcaacttctactcataatg-3' gB4 reverse 5'-cgttacgcgttgagaggagat-3' [7]
gB F 5'-tggaactggaacgtttggc-3' gB R 5'-gcaccttgacgctggtttgg-3' [4]
gN up 5'-tggtgtgatggagtggaac-3' gN lo 5'-tagcctttggtggtggttgc-3' [13]
gN 105672F 5'-cgcgacagtaccagttgaga-3' gN 106306R 5'-ctacacctacgtcaccatc-3' gN 105672F 5'-cgcgacagtaccagttgaga-3' gN106179R 5'-cttaccccgccggaacac-3' [10]
gNF 5'-ttgggtcggtcaacatcgtaag-3' gNR 5'-ggtggttgcagtaaagttctgga-3' [18]
Праймер gB Primer gB tggaactggaacgtttggc gcaccttgacgctggtttgg
fix-bac tggaactggaacgtttggc gcaccttgacgcttgtttgg
toledo tggaactggaacgtttggc gcaccttgacgcttgtttgg
ad169 tggaattggaacgtttggc gcaccttgacgctggtttgg
towne tggaactcgaacgtttggc gcaccttgacgctggtttgg
merline tggaactcgaacgtttggc gcaccttgacgctggtttgg
tr-bac tggaactcgaacgtttggc gcaccttgacgctggtttgg
davis tggaactcgaacgtttggc gcaccttgacgctggtttgg
Праймер gN Primer gN tggtgtgatggagtggaac gcaaccaccaccaaaggcta
fix-bac tggtgcgatggagtggaac gcaaccaccaccaaaggcta
toledo tggtgcgatggagtggaac gcgaccaccaccaaaggcta
ad169 tggtgtgatggagtggaac gcaaccaccaccaaaggcta
towne tggtgtgatggagtggaac gcaaccaccaccaaaggcta
merline tggtgtgatggagtggaac gcgaccaccaccaaaggcta
tr-bac tggtgtgatggagtggaaa gcaaccaccaccaaaggcta
davis tggtgtgatggagtggaac gcaaccaccaccaaaggcta
На рис. 1 и 2 представлены результаты сравнения референсных нуклеотидных последовательностей ДНК фрагментов генов UL55(gB) и UL73(gN). Отобранные участки генов характеризуются высоким уровнем вариабельности, что позволяет разделить изоляты на генотипы, при этом в местах отжига праймеров количество замен минимально.
Анализ результатов секвенирования фрагментов гена UL55 позволил выявить следующее распределение gB-генотипов ЦМВ, циркулирующих среди пациентов, перенесших пересадку солидных органов: gB2, gB1, gB3, gB4, при этом доминировал генотип gB2 (57%). У одного пациента была обнаружена инфекция, обусловленная
одновременным присутствием изолятов ЦМВ, принадлежащих к двум генотипам: §Б3 и §Б4.
Анализ результатов секвенирования фрагментов гена UL73 клинических изолятов ЦМВ, выделенных у реципиентов солидных органов, позволил выявить следующие генотипы: §N40 §№а, §N1, §N413, gN3b, при этом доминировали три генотипа — §N40 (38,4%), §Ша (23%) и §N1 (23%).
Следует отметить, что у некоторых пациентов была обнаружена ЦМВ-инфекция, обусловленная одновременным присутствием нескольких §^генотипов ЦМВ. Так, у реципиентов печени определены ассоциации генотипов §N40, §N41 и §N31, и §N1, а у двух реципиентов
почек — и §N1, §N40 и §Жа.
_10_20_30_40_И
CMV genotype gB7 KF021605 TGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGCTCCAGTCTGAATCTTACTCATAGT50
CMV genotype дВ4 strain С194А TGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGTTCCAGTCTGAATCTTACTCATAGT50
CMV genotype gB1 Towne FJ610205 Dolan TGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGCTCCAGTCTGAATCTTACTCATAAT50
CMV genotype gB5 strain MK157 465.1 TGGAATTAGAACGTTTAGCCAATAGCTCTGGTGTAAACGCTACGCGT . . .SO
CMV genotype gB6 strain HANRTR6 KY49007 TGGAACTGGAACGTTTGGCCAATAGCTCCGGTGTGAACTCCACGCGT . . .51
CMV genotype gB3 HS5GLYBM TGGAACTGGAACGTTTGGCCAATAGCTCCGGTGTGAACTCCACGCGT . . .51
CMV genotype gB2 strain AD109X17403 TGGAATTGGAACGTTTGGCCAATCGATCCAGTCTGAATATCACTCAT ■ ■ .50
00 70 00 90 100
CMV genotype gB7 KF021605 AGAACCAAAAGAAGTGCAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAGCAT 100
CMV genotype gB4 strain C194A AGAACCAGAAGAAGTACAGATGGCACCAATGTAACTCATTTATCTAATAT 100
CMV genotype gB1 Towne FJ616265 Dolan AGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACAT 100
CMV genotype gB5 strain MK157 465.1 AGAAGCAAGAGAAGCACAAA. . . CAATACGACTACCCTATCGCTGGAGAA 100
CMV genotype gB6 strain HANRTR8 KY49007 AGAACCAAGAGAAGTACGGG . . . CAATACGACTACCCTGTCGCTTGAAAG 100
CMV genotype gB3 HS5GLYBM AGAACCAAGAGAAGTACGGG. . . CAATACGACCACCCTGTCGCTTGAAAG 100
CMV genotype gB2 strain AD169X17403 AGGACCAGAAGAAGTACGAGTGACAATAATACAACTCATTTGTCCAGCAT 100
G G A A T С G G T G С A С A A T С T G G T С T A С { S С с с A G С т G С А G Т Т с А С с T А т G А С А
G G A G T С G G T G С A С A A T с T G G T С T A С < 1 с с с A G С т G С А G Т т с А С с T А Т G А С А
CMV genotype gB7 KF021605
CMV genotype gB4 strain C194A GGACTCGGTACACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGTTCACCTACGACA 150
CMV genotype gB1 Towne FJ616285 Dolan GGAGTCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGTTCACCTATGACA 150
CMV genotype gB5 strain MK157 465.1 CGATTCGGTACGAAGTGTGCTTTACGCCCAGCTGCAGTTTACCTACGACA 150
CMV genotype gB6 strain HANRTR6 КГ49007 CGAATCTGTACGAAATGTTCTCTACGCTCAGCTGCAGTTCACCTATGATA 150
CMV genotype gB3 HS5GLYBM CGAATCTGTACGAAATGTGCTCTACGCTCAGCTGCAGTTCACCTATGATA 150
CMV genotype gB2 strain AD169X17403 GGAATCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGTTCACCTATGACA 150
_160_170_180_190_200
CMV genotype gB7 KF021605 CATTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGG 200
CMV genotype gB4 strain C194A CGTTGCGCGGCTACATCAACCGGGCGTTGACACAAATCGCAGAAGCCTGG 200
CMV genotype gB1 Towne FJ616205 Dolan CGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGG 200
CMV genotype gB5 strain MK157 465.1 CGTTGCGCAACTACATTAACCGGGCGCTGGCACAGATCGCCGAAGCCTGG 200
CMV genotype gB6 strain HANRTR6 KY49007 CGTTGCGCAGCTACATCAATCAGGCGTTGGCGCAGATCGCCGAGGCCTGG 200
CMV genotype gB3 HS5GLYBM CGTTGCGCAGCTACATCAATCGGGCGTTGGCGCAGATCGCCGAGGCCTGG200
CMV genotype gB2 strain AD169X17403 CGTTGCGC_TTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGG 200
_210_220_230_240_
TGTGTGGATCAACGGCGCAGCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTCAGCAAGAT 250
CMV genotype gB7 KF021605 CMV genotype gB4 strain C194A CMV genotype gB1 Towne FJ616205 Dolan CMV genotype gB5 strain MK157 465.1 TGCGTGGATCAACGG
CMV genotype gB6 strain HANRTR6 KY49007 TGTGTGGATCAACGG CMV genotype gB3 HS5GLYBM TGTGTGGATCAACGG
CMV g
nAD169X17403
TGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTC1 TGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTC1
CGCACTCTAGAGGTT1 CGCACCCTAGAGGTC1 CGCACCCTAGAGGTC!
TCAAGGAACTTAGCAAGA'
T С A A G G T С A A
А А С T T A А А С T С A
T G T G T
ATCAACGGC
С A С С С T A
TCAGGGAACTCA TCAAGGAACTCA
AGGTCTTCAAGGAACTCA
250
G С A A G A T 250 G С A A G A T 250 G С A A G A T 250 G С A A G A T 250 С A A G A T 250
260
270
280
200
300
CMV genotype gB7KF021605 CAACCCGTCAGCCJ
CMV genotype gB4 strain C194A CAACCCGTCAGCTATTCTCTCGGCCATCTACAACAAACCGATTGCCGCGC300
CMV genotype gB1 Towne FJ616285 Dolan CAACCCGTCAGCTATTCTCTCGGCCATCTACAACAAACCGATTGCCGCGC 300
CMV genotype gB5 strain MK157 465.1 TAACCCGTCAGCCATTCTCTCAGCCATCTACAACAAACCAATTGCCGCGC 300
CMV genotype gB6 strain HANRTR« КГ49007 CAATCCATCAGCCATTCTCTCGGCCATCTACAACAAACI CMV genotype gB3 HS5GLYBM CMV genotype gB2 strain AD169 X17403
CAATCCATCAGCCATTCTCTCGGCCATCTACAACAAACC CAACCCGTCAGCCATTCTCTCGGCCATTTACAACAAACC
ATTGCCGCGC 300 GATTGCCGCGC 300 GATTGCCGCGC 300
CMV genotype gB7 KF021605 CMV genotype gB4 strain C194A CMV genotype gB1 Towne FJ616285 Dolan CMV genotype gB5 strain MK157 465.1
_310_320_330_340_350
6TTTCAT006T6AT6TCTT660CCT60CCA6CT6C6TGACCATCAACCAA350 GTTTCATGGGTGATGTCCTGGGTCTGGCCAGCTGCGTGACCATTAACCAA 350
G T T T С A T G G T T T С A T G
CMV genotype gB6 strain HANRTR8 KY49007 GTTTCATG
CMV genotype дВЗ HS5GLYBM CMV genotype gB2 strain AD169 Х17403
G T T Т С A T G G
G T G A T G T С С T G G A T G T С С T G GTGATGTTCTG
G G T С ' G G T С ' G G T С '
GTTTCATGGGT
GTGATGTTCTGGGTC
GGCCAGCTGCG GGCCAGCTGTG GGCCAGCTGCG GGCCAGCTGCG
ATGTCTTGGGCCTGGCCAGCTGC
TGACCATTAACCAA 350 TGACCATCAACCAA 350 TGTCCATCAACCAA 350 TGACTATCAACCAA 350 TGACCATCAACCAA 350
CMV genotype gB7KF021605 ACCAGCGTCAAGGTG 365
CMV genotype gB4 strain C194A ACCAGCGTCAAGGTG 365
CMV genotype gB1 Towne FJ616285 Dolan ACCAGCGTCAAGGTG 305
CMV genotype gB5 strain MK157 465.1 ACCAGCGTCAAGGTG 365
CMV genotype gB6 strain HANRTR8 KT49007 ACAAGTGTCAAGGTG 305
CMV genotype gB3HS5GLYBM ACAAGCGTCAAGGTG 305
CMV genotype gB2 strain AD169X17403 ACCAGCGTCAAGGTG 365
Рисунок 1. Сравнение референсных последовательностей ЦМВ разных генотипов gB в анализируемой области
Figure 1. Comparison of CMV reference sequences for diverse gB genotypes in the analyzed region Примечание. Сравнение проведено с использованием пакета программ DNASTAR Lasergene 11 (США, 2018). Note. The comparison was carried out using the software package DNASTAR Lasergene 11 (USA, 2018).
CMV genotype gN4c Isolate РМ AF310006 CMV genotype gN1 isolate HRAF309974 CMV genotype gNla isolate BD AF309980 CMV gerotype g№ Isolate DL AF30997S CMV genotype gN3b isolate N8a EU686430 CMV genotype gN4a isolate Can10AF3099 CMV genotype gN4blsolate Towne AF22467
TGGTGTGATGGAGTGGAACACACTAGTATTAGGTCTTTTGGTTTTATCGG50 T G G T G T G A T G G A G T G G А А С А С А С T A G T A T T A G G T С T T T T A G T T T T A T С G G 50 T G G T G T G A T G G A G T G G А А А А С A G T G A T А С T A G G T С T T T T T G T T T T A T С G G SO T G G T G T G A T G G A G T G С А А А А С А С T G G T G С T A G G С С T T T T G A T T A T A T С G G 50 T G G T G T G A T G G A G T G G А А С А С А С G A G T А С T A A G T T T T T T G G T T T T A T С G G 50 TGGTGTGATGGAGTGGAACACACTAGTACTGGGTCTTTTGGTTTTATCGG50 TGGTGTGATGGAGTGGAACACACTAGTATTAGGTCTTTTGGTTTTATCGG50
CMV genotype gN4c isolate PM AF310006 CMV genotype gN1 Isolate HRAF309974 CMV genotype gN3a ieolate BD AF309980 CMV genotype gN2 isolate DL AF309975 CMV genotype gN3b Isolate N8a EU686430 CMV genotype gN4a Isolate Can10AF3099 CMV genotype gN4b isolate Towne AF22467
TAGTGGCA ■ - - AGTTCCAACAATA - - -CGTCGACTGCTAGCACACCGCGT94
T A G T G G С A G A G A G T T С T G G T А А С A A T T С A T С С А С G T С А А С С T С Т G С А А С Т 100
Т G G С A G С G G G G A G Т Т С Т G G Т А А С A G С Т С А Т С С А С G Т С А А С С Т С С G С А А С Т 100 CGGTAACAGGGAGCTCTAGCAGCAACTCGTCCACGTCAACGTCTTCAACT100
Т G G С G G С A G G G A G Т Т А Т G G Т А А С A G С Т С А Т С Т А С G Т С А А С С Т С Т G С A A G Т 10«
TAGCGGCG ■ ■ -AGTTCCAATAATA - ■ -CGTCGACTGTTAGCACACCGAGT94
TAGCGGCA ■ - - AGTTCCAACCATA - - -CGTCGACTGCTAGAACACCGAGT94
CMV genotype gN4c Isolate РМ AF31000C CMV genotype gNI isolate HR AF309974 CMV gerotype gN3a isolate BD AF309980 CMV genotype gN2 isolate DL AF309975 CMV genotype gN3b isolate NBa EU686430 CMV genotype gN4a isolate Can10AF3099 CMV genotype gN4b Isolate Towne AF22467
CCCTCTAGTTCTACT - - - CACGCCTCAACAACCGTGAAGGCAACGACTGT141 А С A T С A A A G T С T T С T A - С T A G С G T A T С А А С T А С С А А А С T А А С А А С A G T 147 ACGTTAAAATCGT CAGTTCTAGCGTGTCAACAAGCAAATTGACGACAAC150
ACACCAAGTCCT......TCTAGTGTGTCAACGAGTAAACCAACTACGAG144
ACACCGAGTCCTCCTAGTTCTAGTGTATCAACGGGAAAATCGACTACCAG150 С С С T С Т A G С Т С Т А С Т - - - С G С А С С Т Т А А С А А С С G Т G A A G G С А А С С А С А А С 141 CCCTCTAGCTCTACT ■ ■ - CACACCTCAACAACCGTGAAGGCAACGACTAC141
CMV genotype gN4c isolatePMAF31000G CMV genotype gN1 isolate HRAF309974 CMV genotype gN3a Isolate BD AF309980 CMV genotype g№ ieolate DL AF309975 CMV genotype gN3b isolate NOa EU686430 CMV genotype gN4a Isolate Can10AF3099 CMV genotype gN4b isolate Towne AF22467
_160_170_180_190_200
TGCGACAACTAGTACAACTACGGCGACAAGTAC- ■ ■ TTCATCGACGACTA188
T G С А А С А А С T T С T G С А А С А А С T А С G А С G А С T А С G А С С T T А Т С G А С А А С Т А 197
Т G С А А С А А ■ ■ ■ Т А С G А С А А С Т А С G А Т G A G Т А С G А С С Т С А Т С G А С А А С Т А 197
С G Т А А С А А С С Т С С А С G А С А А С Т А С G А С А А С Т А С А А С Т А С А Т С А А С А А С Т А 194
С G Т А А С А А С С Т С С А С А А С А С С T А С G А С G А С С А С А А С С А С A T Т А А С G А ■ ■ -197
Т G С А А С А А С Т Т С Т А С А А С А А С Т А С G A G G A G С А С G А С С Т С А Т С G А С А А С Т А 191 TGCGACAACTAGTACAACTACGGTGACAAGTACGACTTCATCAACGACTA191
CMV genotype gN4c isolatePMAF31000G CMV genotype gN1 isolate HRAF309974 CMV genotype gNla isolate BD AF309980 CMV genotype gN2 Isolate DL AF309975 CMV genotype gN3b isolate N8a E J686430 CMV genotype gN4a isolate Can10AF3099 CMV genotype gN4b Isolate Towne AF22467
GTGCCAAACCTGGTTCCACTACTCACGACCCCAACGTGATGAGACCACAT238 G С А С T А А А С T С A G T T С T А С С А С С С А С G А Т С С Т А А Т G Т G А Т G A G А С G А С А Т 247 С С А С Т А А А С С A A G Т Т С С А С С А С Т С А С G А С С С Т А А Т G Т G А Т G А А А С G А С А Т 247 GCACTAGGCTCAGTTCCACTACCCACGACCCTAATGTAATGAGACGACAT244 G Т А С Т А А А С С A G G Т Т С Т А С С А С Т С А С А А С С С Т А А Т G Т G А Т G А А А С G А С А Т 247 G Т А С Т А А А С Т С A G Т Т С С А С С А С С С А С G А С С С Т А А Т G Т G А Т G A G А С G А С А Т 241 GTACCAAACCCGGTTCCACCACTCACGACCCCAATGTGATGAGACCACAT241
CMV genotype gN4c isolate РМ AF31Q006 CMV genotype gNI isolate HR AF309974 CMV genotype gN3a Isolate BD AF309980 CMV genotype gN2 isolate DL AF30997S CMV genotype gN3b isolate NSa EU686430 CMV genotype gN4a isolate Can10AF3099 CMV genotype gN4b isolate Towne AF22467
GCTCACAATGATTTTTACAATGCGCATTGTACATCGCATATGTATGAGCT28! G С G А А С G A T G A T T T T T А С A A G G С G С A T T G С А С A T С G С A T A T G T A T G A G С T 297 G С T С А С G A T G A T T T T T А С A A G G С А С A T T G С А С A T С G С A T A T G T A T G A G С T 297 G С T А А С G A T G A T T T T T А С A A G G С А С A T T G С А С A T С G С A T A T G T А С G A G С T 294 G A T С А С G A T G A T T T T T А С A A T G С А С A T T G С А С A T С G С A T A T G T A T G А А С T 297 G С T А А С G A T G A T T T T T А С A A G G С G С A T T G С А С A T С А С A T A T G T A T G A G С T 291 GCTCACAATGATTTTTACAAGGCGCATTGTACATCGCATATGTATGAACT291
CMV genotype gN4c Isolate PM AF310406 CMV genotype gN1 isolate HRAF309974 CMV genotype gN3a isolate BD AF309980 CMV genotype gN2 Isolate DL AF30997S CMV genotype gN№ isolate N8a E J686430 CMV genotype gN4a isolate Can10AF3099 CMV genotype gN4b isolate Towne AF22467
TTCACTGTCCAGCTTTGCAGCCTGGTGGACTAT С T С А С T G T С С A G С T T T G С G G С С T G G T G G А С T A T T T С А С T G T С С A G С T T С G С G G С С T G G T G G А С T A T С T С А С T G T С С A G С T T T G С G G С С T G G T G G А С T A T С T С А С T G T С С A G С T T T G С A G С С T G G T G G А С T A T С T С А С T G T С С A G С T T T G С G G С С T G G T G G А С T A T TTCTCTGTCCAGCTTTGCGGCCTGGTGGACTAT
_MO_350
GCTTAACGCTCTCATTC338 G С T T A A T G С T С T A A T T С 347 G С T T А А С G С T С T С A T T С 347 G С T T A A T G С T С T T A T T С 344 G С T С A A T G С T С T С A T T С 347 G С T T A A T G С T С T С A T T С 341 GCTTAATGCTCTCATTC341
CMV genotype gN4c isolate PM AF310006 CMV genotype gN1 Isolate HRAF309974 CMV genotype gN3a ieolate BD AF309980 CMV genotype gN! isolate DL AF309975 CMV genotype gN3b isolate N8a EU686430 CMV genotype gN4a Isolate Can10AF3099 CMV genotype gN4t> isolate Towne AF22467
TGATGGGAGCTTTTTGTATCGTATTACGACATTGCTGCTTCCAGAACTTT388 T С A T G G G A G С T T T T T G T A T T G T А С T А С G А С A T T G С T G С T T С С A G А А С T T T 397 T С A T G G G A G С T T T T T G T A T С G T А С T А С G А С A T T G С T G T T T С С A G А А С T T T 397 T С A T G G G A G С T T T T T G T A T С G T А С T А С G А С A T T G С T G С T T С С A G А А С T T T 394 T G A T G G G A G С T T T T T G T A T С G T А С T А С G А С A T T G С T G С T T С С A G А А С T T T 397 T С A T G G G A G С T T T T T G T A T T G T А С T А С G А С A T T G С T G С T T С С A G А А С T T T 391 TCATGGGAGCTTTTTGTATCGTACTACGACATTGCTGTTTCCAGAACATT391
CMV genotype gN4o Isolate PM AF310006 CMV genotype gNI Isolate HRAF309974 CMV genotype gN3a isolate BD AF309980 CMV genotype gN2 isolate DL AF309975 CMV genotype gN3b isolate N8a EU686430 CMV genotype gN4a isolate Can10AF3099 CMV genotype gN4b Isolate Towne AF22467
ACTGCAACCAC А С T G С А А С С А С ACTGCAACCAC ACTGCAACCAC ACTGCAACCAC ACTGCAACCAC ACTGCAACCAC
CACCAAAGGCTA С А С С A A A G G С T A CACCAAAGGCTA С А С С A A A G G T T A С А С С A A A G G T T A CACCAAAGGCTA CACCAAAGGCTA
411 420 420 417 420 414 414
Рисунок 2. Сравнение референсных нуклеотидных последовательностей ЦМВ разных генотипов gN
Figure 2. Comparison of CMV reference nucleotide sequences for diverse gN genotypes Примечание. Сравнение проведено с использованием пакета программ DNASTAR Lasergene 11 (США, 2018). Note. The comparison was carried out using the software package DNASTAR Lasergene 11 (USA, 2018).
С целью определения эволюционного разнообразия исследуемых клинических изолятов ЦМВ, выделенных у реципиентов солидных органов, был проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов UL55 и UL73. Для сравнительного анализа из международной базы данных ОепБапк были отобраны нуклеотидные последовательности гена UL55 (gB) 49-ти референс-штаммов и клинических изолятов, циркулирующих в разных странах Европы (Италии, Испании, Бельгии, Великобритании), США, Китае, Мексике, Индии, Египте, а также последовательности гена UL73 ^Щ) 46-ти референс-штаммов и клинических изолятов, циркулирующих в странах Европы (Италии, Испании, Великобритании), США, Китае, Индии.
На рис. 3 представлены дендрограммы ну-клеотидных последовательностей гена UL55
(gB) и гена UL73 ^Щ) исследуемых и депонированных в базе данных ОепБапк/КСБ1 изолятов ЦМВ, выделенных у реципиентов солидных органов, построенные с использованием метода максимального правдоподобия.
Обсуждение
Проведенные исследования позволили выявить широкую распространенность цитомега-ловирусной инфекции у пациентов, перенесших трансплантацию солидных органов. Так, ДНК ЦМВ была обнаружена у 46,7+3,9% пациентов, перенесших пересадку почки, и у 28,6+3,6% реципиентов печени, что согласуется с данными аналогичных исследований [9, 11, 16, 23]. Следует отметить, что уровень серопозитивнос-ти у подавляющего большинства реципиентов солидных органов был достоверно высоким
CMV genotype gB6 KY490076.1 UK CMV genotype gB3 HS5GLYBK Chou CMV genotjpe gB3 HS5GLYBL
■ gB3
S6(2)gB CMV genotyp 4.4(21 oR
CMV genotjpe gB2 X04606 8(3)gB
gB Chin USA 2017 isolate UCSF-la r- CMV genotjpe gB2 HS5GLYBI 0L- gB Gonzalez-Sanchez Merico 2014 UASLP2404110 gB Mohamed Egypt 2014 isolate 3 25(2) gB 6(2) gB
genotjpe gB2 strain JP GQ221975 48(2) gB 48 gB 6gB
CMV gB4 strain C194A HS5GLYBD Chon 144 gB
CMV gB4 strain С128А HS5GLYBB C'hon
I-CMV gBl Tome GQ121041 Cui
"I I-CMV gBl Tonne FJ616285 Dolan
557Lr ?B Nelson USA 2018 isola,e 32 Ыо<к1
!шГ gB Gonzalez-Sanchez Merico 2014 UASLP2403710 157B consensus
gB Hage E UK 2016 strain HANChild4 gB Sijmons Belgium 2015 strain BE412011
gB2
• gBl
—£
160N consensus 1 100N de novo 1
48N de novo
CMV isolate RCMV2084 UK 2018 complete genome 152N de novo
CMV isolate 3cCMV gpN (UL73)Spain 2015 CMV genotype gN4c K141 EU686456 2008 UK CMV genotype gN4c GU376724 2011 China CMV genotype gN4c PM AF310006 2001 Italy _J
CMV genotype gN4b RL AF309995 20011taly 48N de novo 1
_ gN4c
5, - CMV genotype gN4b isolate Towne AF224677 2001Italy
_|- CMV isolate Han79 UL73 China 2010
IT*" CMV genotype gN4b GU376723 2011 China
gN4b
-t
Í
150N de novo 1
CMV genotype gN4a isolate CanlO AF309988 2001 Italy
CMV isolate SR gpN UL73 Italy 2000
CMV genotjpe gN4a isolate HDu AF309993 2001 Italy
CMV genotype gN4a GU376721 2011China
CMV strain K57 gpN (UL73) UK 2008
160N consensus
m'490073.1:106523-l06592 HCMVstrain HAXRTR1A AF390796.1:l-70 HCm' isolate TR UL73 gene CMV genotype gN2 GU376725 2011 China
. gN4a
W. £ S
r-C
iCMV genotjpe gNl isolate LN AF309969 2001 Italy CMV genotjpe gNl GU441773 2011 China CMV strain VRFiso3 UL73 gene India CMV strain HANRTR1A UK complete genome 100N de novo
- 150N de novo 2
CMV isolate UXCA Merck UNC USA 2016
CMV genotjpe gN3b isolate A8-27F AF390802 2001 Italy
150N de novo
CMV isolate R2r UL73 UK 2003 partial cds CMV genotjpe gN3b isolate N8a EU686430 2008 UK CMV genotjpe gN3b GU376720 2011 Chba 152N de novo 2
CMV genotjpe gNl isolate HR AF309974 2001 Italy
gN3b
"gNl
Рисунок 3. Дендрограммы нуклеотидных последовательностей генов UL55 (gB) и UL73 (gN) исследуемых и депонированных в базе данных GenBank/NCBI изолятов ЦМВ, построенные с использованием метода максимального правдоподобия
Figure 3. Phylogenetic analysis for the genes UL55 (gB) and UL73 (gN) from CMV isolates studied and deposited in the GenBank/NCBI database, the phylogenetic tree was constructed using Maximum Likelihood method Примечание. Цифры в узлах дерева обозначают уровень поддержки, полученный с помощью метода rapid bootstrap. Note. The numbers in the tree nodes represent the support level obtained using the rapid bootstrap method.
и составил 98,8+3,2% (р < 0,05). Антитела класса 1§М были выявлены у 12,2+3,4%, при этом среди 1§М-позитивных пациентов не у всех была обнаружена ДНК вируса. Установлено, что все 1§0-антитела в исследуемых образцах от реципиентов органов являлись высокоавидными, и лишь у одного пациента были обнаружены низкоавидные 1§0-антитела, что свидетельствовало о наличии у него первичной ЦМВИ.
В данном исследовании был проведен анализ различных подходов к типированию ДНК ЦМВ, предлагаемых в литературе. В результате нами был подобран и апробирован на клинических образцах вариант типирования ДНК ЦМВ, основанный на определении генотипов §Б и Сравнительный анализ частоты встречаемости этих генотипов в странах мира, включая Россию (по результатам наших собственных исследований), представлен в табл. 3.
В настоящее время в зарубежной литературе накоплено большое количество данных о распространенности различных геновариантов ЦМВ, циркулирующих у пациентов, перенесших трансплантацию солидных органов. В России работы по генотипированию ЦМВ до сих пор не проводились, исследования в основном были посвящены клиническим аспектам инфекции среди различных групп населения.
Полученные результаты позволили оценить генотиповую структуру популяции российских изолятов ЦМВ. Показано превалирование у пациентов, перенесших пересадку солидных ор-
ганов, четырех генотипов ЦМВ: §Б2, §N40, и §N1, что согласуется с данными литературы [5, 19]. Так, в исследовании СюШ М. и соавт. (2017) установлено, что генотип §Б2 доминировал у реципиентов органов, генотип §Б4 присутствовал только при смешанных инфекциях, а у ВИЧ-инфицированных пациентов наиболее часто встречался генотип §Б1 [5]. Доминирование генотипа §Б2 у пациентов, перенесших пересадку костного мозга, было также показано в исследовании, проведенном в Бразилии [8].
Частота встречаемости инфекции, обусловленной одновременным присутствием ЦМВ разных генотипов, согласно полученным нами результатам варьировала от 13 до 25%. По данным литературы, показатели частоты встречаемости инфекции, обусловленной одновременным присутствием вирусов нескольких (двух и более) генотипов, варьируют от 6 до 59,6% в зависимости от величины выборки обследуемых пациентов. ЦМВ-инфекция, обусловленная вирусами двух разных генотипов, регистрируется у пациентов с иммунодефицит-ными состояниями различного генеза (ВИЧ-инфицированные или пациенты, перенесшие пересадку органа), а также у новорожденных с врожденной ЦМВИ [9, 17].
Проведенный филогенетический анализ гена иЬ55 ^Б) показал, что изоляты ЦМВ, выделенные на территории Нижнего Новгорода, филогенетически располагаются ближе к штаммам, циркулировавшим на территории
Таблица 3. Частота встречаемости различных генотипов ЦМВ в разных странах мира
Table 3. Prevalence of various CMV genotypes in different countries of the world
Пациенты, перенесшие пересадку органов Organ transplant patients Генотип Genotype Частота встречаемости различных генотипов, % Genotypes prevalence, % Страна Country
По данным литературы Published data gB gB3 (37,39%), gB1 (36,52%), gB5 (4,35%), gB2 (2,61%), gB4 (1,74%), mix (17,39%) Китай [24] China
gB1 (39%), gB2 (35%), gB4 (14%), gB3 (6%), mix (6%) Бразилия [8] Brazil
gB1 (30%), gB3 (26%), gB2 (17%), gB4 (4%), mix (17%) Чехия [20] Czech Republic
gB1 (26%), gB2 (10%), gB3 (10%), gB4 (5%), mix (49%) Канада [14] Canada
gB2 (23,4%), gB1 (12,8%), gB3 (4,2%), mix (59,6%) Италия [5] Italy
gN gN3a (16,7%), gN4a (11,7%), gN2 (9,8%), gN1 (5,9%), gN4b (8,8%), gN3b (4,9%), gN4d (2,0%), mix (40,2%) Китай [25] China
gN4c (29,7%), gN1 (24,3%), gN4a (18,9%), gN4b (12,2%), gN2 (5,4%), gN3b (5,4%), gN3a (4,1%) Италия [19] Italy
go gO1 (39%), gO2 (20%), gO3, gO4 Чехия [17] Czech Republic
Результаты собственных исследовании Own research results gB gB2 (50%), gB1 (13%), gB3 (12%), gB4 (12%), mix (13%) Россия Russia
gN gN4c (67%), gN4a (25%), gN1 (25%), gN4b (17%), gN3b (17%), mix (18%)
США в 2017—2018 гг. Следует отметить, что один нижегородский изолят ЦМВ с генотипом §Б3 дивергировал в отдельную ветвь и филогенетически оказался ближе к штаммам ЦМВ, выделенным в Мексике в 2012 г. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена UL73 показал, что нижегородские
клинические изоляты ЦМВ характеризовались филогенетическим родством со штаммами, выделенными на территории различных стран: США, Италии, Испании, Великобритании, Китая в период с 2001 по 2018 г. Необходимо отметить, что нижегородские изоляты ЦМВ gN4a-генотипа дивергировали в отдельную ветвь, и они филогенетически ближе к штаммам ЦМВ, выделенным в Италии в 2001 г.
Согласно полученным данным, циркулирующие на территории России штаммы ЦМВ генотипов §Б и gN филогенетически оказались ближе к штаммам, выделенным в странах Европы и США в период с 2001 по 2018 г. Следует отметить, что в настоящее время за рубежом активно проводится разработка вакцин против ЦМВ, некоторые из них находятся на стадии клинических испытаний. При создании эффективной вакцины следует учитывать наличие широкого спектра генотипов ЦМВ и региональные особенности их циркуляции. В этом плане исследования, направленные на изучение генетического разнообразия циркулирующих штаммов цитомега-ловируса и их молекулярно-генетическую характеристику, а также разработку алгоритмов мониторинга групп риска по ЦМВИ, являются необходимыми для оценки целесообразности применения существующих и разрабатываемых новых вакцин.
Список литературы/ЯеТегепсеБ
Заключение
Таким образом, получен первый опыт ге-нотипирования российских изолятов ЦМВ на примере Нижегородской области. Проведена оценка различных методических подходов к ге-нотипированию клинических изолятов цито-мегаловируса, выделенных от взрослых — реципиентов солидных органов. Выбраны и апробированы на контрольном штамме ЦМВ ЛВ169 несколько пар праймеров: для гена UL55 ^В) — 14 пар, для гена UL73 ^Щ) — 5 пар. Определены спектры и долевое распределение §Б- и генотипов ЦМВ, циркулирующих среди взрослых в Нижнем Новгороде. Установлено, что в группе пациентов, перенесших трансплантацию солидных органов, превалируют генотипы §Б2, §N40, gN4а и §N1. В 25% случаев у пациентов группы риска обнаружена ЦМВИ, обусловленная ассоциацией двух и трех генотипов ЦМВ. Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов UL55 и UL73 свидетельствует о генетической гетерогенности нижегородских изолятов ЦМВ.
Полученные данные о генотипах ЦМВ, циркулирующих в России и, в частности, на территории Нижегородского региона, позволят расширить информационную и методическую базу для эпидемиологического надзора за ЦМВИ и внесут существенный вклад в решение проблемы целесообразности использования на территории России разрабатываемых за рубежом вакцин против этой инфекции. Международная база данных ОепБапк/ЕМБЬ/ DDBJ пополнена нуклеотидными последовательностями генома российских изолятов ци-томегаловируса (мировой уровень внедрения).
1. Barbi M., Binda S., Caroppo S., Calvario A., Germinario C., Bozzi A., Tanzi M.L., Veronesi L., Mura I., Piana A., Solinas G., Pugni L., Evilaqua G., Mosca F. CMV gB genotypes and outcome of vertical transmission: study on dried blood spots of congeni-tally infected babies. J. Clin. Virol., 2001, vol. 21, no. 1, pp. 75-79. doi: 10.1016/s1386-6532(00)00188-8
2. Cannon M.J., Schmid D.S., Hyde T.B. Review of cytomegalovirus seroprevalence and demographic characteristics associated with infection. Rev. Med. Virol., 2010, vol. 20, no. 4,pp. 202-213. doi: 10.1002/rmv.655
3. Chen H.P., Lin J.C., Yang S.P., Lan Y.C., Weng W.S., Tsai C.H., Ho D.M., Liu C.Y., Cho W.L., Chan Y.J. The type-2 variant of human cytomegalovirus glycoprotein N (gN-2) is not the rarest in the Chinese population of Taiwan: influence of primer design. J. Virol. Methods, 2008, vol. 151,pp. 161-164. doi: 10.1016/j.jviromet.2008.03.018
4. Chou S.W., Dennison K.M. Analysis of interstrain variation in cytomegalovirus glycoprotein B sequences encoding neutralization related epitopes. J. Infect. Dis., 1991, vol. 163, no. 6, pp. 1229-1234. doi: 10.1093/infdis/163.6.1229
5. Ciotti M., Cella E., Ritta M., Ciccozzi M., Cavallo R., Perno C.F., Costa C. Cytomegalovirus glycoprotein B genotype distribution in Italian transplant patients. Intervirology, 2017, vol. 60, no. 4, pp. 165-170. doi: 10.1159/000486593
6. De Albuquerque D.M., Costa S.C. Genotyping of human cytomegalovirus using non-radioactive single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. J. Virol. Methods., 2003, vol. 9, no. 110(1), pp. 25-28. doi: 10.1016/s0166-0934(03)00094-6
7. De Vries J.J., Wessels E., Korver A.M., van der Eijk A.A., Rusman L.G., Kroes A.C., Vossen A.C. Rapid genotyping of cytomegalovirus in dried blood spots by multiplex real-time PCR assays targeting the envelope glycoprotein gB and gH genes. J. Clin. Microbiol., 2012, vol. 50, no. 2,pp. 232-237. doi: 10.1128/JCM.05253-11
8. Dieamant D.C., Bonon S.H., Peres R.M., Costa C.R., Albuquerque D.M., Miranda E.C., Aranha F.J., Oliveira-Duarte G., Fernandes V.C., De Souza C.A., Costa S.C., Vigorito A.C. Cytomegalovirus (CMV) genotype in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. BMC Infect. Dis, 2013, vol. 10, no. 13:310. doi: 10.1186/1471-2334-13-310
9. Görzer I., Guelly C., Trajanoski S., Puchhammer-Stöckl E. Deep sequencing reveals highly complex dynamics of human cytomegalovirus genotypes in transplant patients over time. J. Virol., 2010, vol. 84, no. 14, pp. 7195-7203. doi: 10.1128/JVI.00475-10
10. Grosjean J., Hantz S., Cotin S., Baclet M.C., Mengelle C., Trapes L., Virey B., Undreiner F., Brosset P., Pasquier C., Denis F., Alain S. Direct genotyping of cytomegalovirus envelope glycoproteins from toddler's saliva samples. J. Clin. Virol., 2009, vol. 46, no. 4, pp. 43-48. doi: 10.1016/j.jcv.2009.08.018
11. Khalafkhany D., Makhdoomi K., Taghizadeh Afshari A., Motazakker M. Prevalence and genotype distribution of cytomegalovirus UL55 sequence in renal transplant recipients in north west of Iran. J. Med. Virol., 2016, vol. 88, no. 9, pp. 1622-1627. doi: 10.1002/jm v.24509
12. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J., Higgins D.G. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioiformatics, 2007, vol. 23, no. 21, pp. 2947-2948. doi: 10.1093/bioinformatics/btm404
13. Lisboa L.F., Tong Y., Kumar D., Pang X.L., Asberg A., Hartmann A., Rollag H., Jardine A.G., Pescovitz M.D., Humar A. Analysis and clinical correlation of genetic variation in cytomegalovirus. Transpl. Infect. Dis., 2012, vol. 14, no. 2, pp. 132-140. doi: 10.1111/j.1399-3062.2011.00685.x
14. Manuel O., Asberg A., Pang X., Rollag H., Emery V.C., Preiksaitis J.K., Kumar D., Pescovitz M.D., Bignamini A.A., Hartmann A., Jardine A.G., Humar A. Impact of genetic polymorphisms in cytomegalovirus glycoprotein B on outcomes in solid-organ transplant recipients with cytomegalovirus disease. Clin. Infect. Dis, 2009, vol. 15, no. 49(8), pp. 1160-1166. doi: 10.1086/605633
15. Murthy S., Hayward S., Wheelan S., Forman M.S., Ahn J.H., Pass R.F., Arav-Boger R. Detection of a single identical cytomegalovirus (CMV) strain in recently seroconverted young women. PLoS One, 2011, vol. 10, no. 6 (1), pp. 149-159. doi: 10.1371/ journal.pone.001594
16. Navarro-Rodríguez V., Herrera-Munoz A., Castro A., Ramos-Esquivel A. Risk factors for cytomegalovirus disease in seropositive renal transplant recipients; a single-center case-controlled study. J. Nephropathol., 2017, vol. 6, no. 3,pp. 240-247. doi: 10.15171/jnp.2017.39
17. Pignatelli S. Recent knowledge on the linkage of strain specific genotypes with clinical manifestations of human citomegalovirus disease. Recenti. Prog. Med., 2011, vol. 102, no. 1, pp. 5-10.
18. Pignatelli S., Dal Monte P. Epidemiology of human cytomegalovirus strains through comparison of methodological approaches to explore gN variants. New Microbiol., 2009, vol. 32, no. 1, pp. 1-10.
19. Roubalova K. Genetic variability of cytomegalovirus glycoprotein O in hematopoietic stem cell transplant recipients. Transpl. Infect. Dis., 2011, vol. 13, no. 3,pp. 237-243. doi: 10.1111/j.1399-3062.2011.00625.x
20. Roubalová K.O., Strunecky S., Zufanová S., Procházka B., Vitek A. Genotyping of viral glycoprotein B (gB) in hematopoietic stem cell transplant recipients with active cytomegalovirus infection: analysis of the impact of gB genotypes on the patients' outcome. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol., 2010, vol. 59, no. 2, pp. 92-99.
21. Shepp D.H., Match M.E., Lipson S.M., Pergolizzi R.G. A fifth human cytomegalovirus glycoprotein B genotype. Res. Virol., 1998, vol. 149, no. 2, pp. 109-114. doi: 10.1016/s0923-2516(98)80086-1
22. Torii Y., Yoshida S., Yanase Y., Mitsui T., Horiba K., Okumura T., Takeuchi S., Suzuki T., Kawada J.I., Kotani T., Yamashita M., Ito Y. Serological screening of immunoglobulin M and immunoglobulin G during pregnancy for predicting congenital cytomegalovirus infection. BMC Pregnancy Childbirth, 2019, vol. 19, no. 1:205. doi: 10.1186/s12884-019-2360-1
23. Varghese J., Subramanian S., Reddy M.S., Shanmugam N., Balajee G., Srinivasan V., Venkataraman J., Mohamed R. Seropre-valence of cytomegalovirus in donors and opportunistic viral infections in liver transplant recipients. Indian J. Med. Res., 2017, vol. 145, no. 4, pp. 558-562.
24. Wu X.J., Wang Y., Zhu Z., Xu Y., He G., Han Y., Tang X., Fu Z., Qiu H., Sun A., Wu D. The correlation of cytomegalovirus gB genotype with viral DNA load and treatment time in patients with CMV infection after hematopoietic stem cell transplantation. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 2013, vol. 34, no. 2, pp. 109-112.
25. Xia C.S., Zhang Z. Analysis of human cytomegalovirus glycoprotein N genotypes in Chinese hematopoietic stem cell transplant recipients. Arch. Virol., 2011, vol. 156, no. 1,pp. 17-23. doi: 10.1007/s00705-010-0811-0
Авторы:
Ванькова О.Е., старший научный сотрудник лаборатории метагеномики и молекулярной индикации патогенов ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия; Бруснигина Н.Ф., к.м.н., зав. лабораторией метагеномики и молекулярной индикации патогенов ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия.
Поступила в редакцию 15.12.2020 Отправлена на доработку 31.10.2021 Принята к печати 25.12.2021
Authors:
Vankova O.E., Senior Researcher, Laboratory of Metagenomics and Molecular Indication of Pathogens, Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian Federation;
Brusnigina N.F., PhD (Medicine), Head of the Laboratory of Metagenomics and Molecular Indication of Pathogens, Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod, Russian Federation.
Received 15.12.2020 Revision received 31.10.2021 Accepted 25.12.2021
