CC BY
34
УДК 616.98:378.828HIV]-06:616-022.5-078 http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2019-21 -7-49-53
ГЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЁЗА У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЁЗОМ В СОЧЕТАНИИ С ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ
Пшеничникова-Пеленёва И.М., Ширинкина А.Е., Азизулла Х.
ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера», г. Пермь, Российская Федерация
GENOTYPIC AND PHENOTYPIC MARKERS OF DRUG RESISTANCE OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS OF PATIENTS WITH TUBERCULOSIS IN COMBINATION WITH HIV INFECTION
Pshenichnikova-Pelenyova I.M., Shirinkina A.E., Azizulla H.
Perm State Medical University n.a. E.A. Vagner, Perm, Russian Federation
Аннотация. Представлены данные по микробиологической диагностике туберкулёза и лекарственной устойчивости возбудителя у лиц, живущих с ВИЧ. Объектом исследования стали 32 больных туберкулёзом в сочетании с ВИЧ-инфекцией и 30 пациентов с туберкулёзом без ВИЧ-инфекции, получавших стационарный этап лечения в Пермском краевом фтизиопульмоноло-гическом медицинском центре. При анализе характера бактериовыделения при различном иммунном статусе установлено, что КУМ в мокроте чаще определялись в лицах с низким иммунным статусом. ДНК МБТ в мокроте обнаруживалась с той же закономерностью, как и при куль-туральных методах, подтвердились те же особенности обнаружения МБТ при низком уровне СД4. Мутации, обусловливающие устойчивость МБТ к рифампицину, найдены примерно с одинаковой частотой во всех группах наблюдения. Доля МЛУ и ШЛУ, диагностируемая культураль-ными методами, соответствовала результатам ПЦР-диагностики. Отмечен высокий уровень лекарственной устойчивости к пиразина-миду, множественной и широкой лекарственной устойчивости МБТ, а также несовпадений между различными микробиологическими методами. Результаты исследования лекарственной устойчивости МБТ культуральными методами исследования имеют большее значение при выборе тактики химиотерапии, молекулярно-генетиче-ские методы позволяют раньше определить генетические маркеры МЛУ МБТ, но нуждаются в подтверждении культуральными методами с последующей коррекцией химиотерапии. Показано, что интенсивность бактериовыделения у больных с ко-инфекцией связана со дефектом регуляции иммунного ответа Т-лимфоцитами, уменьшением способности клеточного иммунитета к
Annotation. Data on microbiological diagnosis of tuberculosis and drug resistance of the pathogen of people living with HIV are presented. The object of the study were 32 patients with tuberculosis combined with HIV infection and 30 patients with tuberculosis without HIV infection who received inpatient stage of treatment in pulmonol-ogy Perm regional medical center. In the analysis of the nature of the discharge at different immune status is established that AFB in sputum was more frequently identified in individuals with low immune status. MBT DNA in sputum was detected with the same regularity as in cultural methods, confirmed the same features of MBT detection at a low level of CD4. Mutations causing MBT resistance to rifampicin were found with approximately the same frequency in all groups of observations. The proportion of MDR and XDR diagnosed by cultural methods corresponded to the results of PCR diagnosis. A high level of drug resistance to pyrazinamide, multiple and broad drug resistance of MBT, as well as mismatches between different microbiological methods were noted. The results of the study of drug resistance of MBT by cultural methods of research are more important when choosing chemotherapy tactics. It is shown that the intensity of bacterial excretion of patients with co-infection is associated with a defect in the regulation of the immune response by T-lymphocytes, a decrease in the ability of cellular immunity to limit the reproduction and spread of Mycobacterium tuberculosis.
ограничению размножения и распространения микобактерий туберкулёза.
Ключевые слова: туберкулёз, ВИЧ-инфекция, микобактерии туберкулёза, лекарственная резистентность
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Torheim J.A., Dooley K.E. Tuberculosis associated with HIV Infection // Micobiol. Spectr.- 2017.-N 1/- doi: 10.1128/microbiolspec.TNM17-0028-2016
[2] Cohen T., Becerra M.C., Murray M.B. Isoniazid resistance and the future drug-resistance tuberculosis // Microb. Drug. resist.2004. Vol. 10, N 4. Р. 280-285
[3] Вишневский Б.И. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулёза. Лекция // Медицинский альянс.- 2017.- № 1.- С. 29-35
[4] Приказ Министерства здравоохранения РФ от 29 декабря 2014 г. № 951 "Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулёза органов дыхания" URL: http://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/7074 9840/#ixzz5JtBRx3Da (доступ 30.06.2018)
[5] Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулёза органов дыхания с множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя. -Москва.- 2014. - 72 с.
[6] Федеральные клинические рекомендации по профилактике, диагностике и лечению туберкулёза у больных ВИЧ-инфекцией.- Москва, 2016.- 42 с.
[7] Пшеничникова-Пеленёва И.М., Шурыгин А.А., Милкова А.В. Сопоставление генотипических и фенотипических признаков лекарственной устойчивости МБТ в клинической практике // Журнал научных статей Здоровье и образование в XXI веке.- 2018.- Т. 20.- № 7.- с. 75-79.
Keywords: tuberculosis, HIV infection, Mycobacterium tuberculosis, drug resistance
REFERENCES
[1] Torheim J.A., Dooley K.E. Tuberculosis associated with HIV Infection // Micobiol. Spectr.- 2017.- N 1/- doi: 10.1128/microbi-olspec.TNM17-0028-2016
[2] Cohen T., Becerra M.C., Murray M.B. Isoniazid resistance and the future drug-resistance tuberculosis // Microb. Drug. resist.2004. Vol. 10, N 4. P. 280-285.
[3] Vishnevskij B.I. Lekarstvennaya ustojchivost' mikobakterij tuberkulyoza. Lekciya // Medicinskij al'yans.- 2017.- № 1.- S. 29-35
[4] Prikaz Ministerstva zdravoohraneniya RF ot 29 dekabrya 2014 g. № 951 "Ob utverzhdenii metodicheskih rekomendacij po sovershenstvovaniyu diagnostiki i lecheniya tuberkulyoza organov dyhaniya" URL: http://www.garant.ru/prod-ucts/ipo/prime/doc/70749840/#ixzz5JtBRx3 Da (dostup 30.06.2018)
[5] Federal'nye klinicheskie rekomendacii po di-agnostike i lecheniyu tuberkulyoza organov dyhaniya s mnozhestvennoj i shirokoj le-karstvennoj ustojchivost'yu vozbuditelya. -M.-Tver': OOO «Izdatel'stvo «Triada», 2014. - 72 s.
[6] Federal'nye klinicheskie rekomendacii po profilaktike, diagnostike i lecheniyu tu-berkulyoza u bol'nyh VICH-infekciej.- Moskva, 2016.- 42 s.
[7] Pshenichnikova-Pelenyova I.M., SHurygin A.A., Milkova A.V. Sopostavlenie genotipich-eskih i fenotipicheskih priznakov lekarstven-noj ustojchivosti MBT v klinicheskoj praktike // ZHurnal nauchnyh statej Zdorov'e i obra-zovanie v XXI veke.- 2018.- T. 20.- № 7.- s. 75-79.
Введение. Сочетание туберкулёза с ВИЧ-инфекцией является одной из актуальнейших медико-социальных проблем глобального масштаба [1]. В Пермском крае в 2018 г на фоне снижения заболеваемости туберкулёзом без ВИЧ-инфекции случаи сочетания туберкулёза и ВИЧ находится на уроне в 2.6 раз превышающем среднероссийский. Среди жителей Пермского края впервые взятых на учет с ко-инфекцией возрос до 37%. Данная сочетанная патология характеризуется не просто особой социальной зависимостью, но и особенностями симптоматики, течения заболевания и неблагоприятным клиническим прогнозом. Другой актуальной проблемой является рост заболеваемости лекарственно устойчивыми формами
туберкулёза [2, 3]. В Пермском крае в 2018 г МЛУ/ШЛУ туберкулёз составил 40,7% среди впервые выявленных больных, что в 1,4 раза выше среднероссийского уровня. Обе проблемы характеризуют эпидемическую ситуацию по туберкулёзу неблагоприятной и определяют особые требования к бактериологической диагностике лекарственной резистентного туберкулёза в сочетании с ВИЧ-инфекцией.
Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение различных методов обнаружения микобактерий туберкулёза и их лекарственной резистентности у больных с ВИЧ инфекцией в зависимости от степени снижения иммунитета.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования стали 32 больных с ко-инфекцией и 30 пациентов с туберкулёзом без ВИЧ-инфекции, получавших стационарный этап лечения в Пермском краевом фтизиопульмонологическом медицинском центре. Проводилось срезовое исследование, критериями включения в которое явились: впервые выявленный и утверждённый диагноз туберкулёза в 2018 г, микробиологическая верификация туберкулёза с проведением исследований на лекарственную чувствительность МБТ. Критерии исключения: самовольный уход, нежелание лечиться и обследоваться. Среди пациентов с ВИЧ-инфекцией большинство больных были мужского пола (83,3%), находились в возрасте от 31 до 40 лет (69,4%), употребляли наркотики в большинстве случаев (83%). Во всех случаях ВИЧ-инфекция была выявлена раньше, чем туберкулёз. 94,4% пациентов имели 4В стадию ВИЧ-инфекции, при чем АРВТ перед заболеванием туберкулёзом проводилась только 13,9% больных. У двух третей пациентов ВИЧ-инфекция была диагностирована и объявлена от 2 до 7 лет назад (66,6%). Средний уровень СД4 на момент выявления туберкулёза составил 207 клеток на мкл крови. При это диагноз туберкулёза был установлен в виде следующих форм: туберкулёз ВГЛУ - 50%, диссеминированный туберкулёз лёгких - 25%, инфильтративный туберкулёз - 16,7%, генерализованный туберкулёз с поражением лёгких и периферических лимфоузлов - 8,3% случаев.
Среди пациентов без ВИЧ-инфекции мужчины составили 75% выборки, средний возраст - 41 год. Основными клиническими формами были инфильтративный туберкулёз легких (73%) и диссеминированный туберкулёз легких (15%). В остальных случаях: 6% - ФКТ, 3% - казеоз-ная пневмония, 3% - туберкулёз бронха с бронхолегочным поражением. То есть, клиническая структура заболеваемости при туберкулезе с ВИЧ и без ВИЧ имеет существенные различия (р<0,05, х2).
Для уточнения характера бактериовыделения в зависимости от глубины поражения иммунной системы все пациенты были разделены на 3 группы: СД4 на мкл крови менее 100 - 16 человек (1 группа), от 100 до 350 - 9 пациентов (2 группа), более 350 - 12 случаев (3 группа). Больные туберкулёзом без ВИЧ составили группу сравнения (группа 4).
При поступлении в стационар всем больным проводилось комплексной клинико-лабора-торное и рентгенологическое обследование [4, 5, 6]. Трехкратно забиралась мокрота для бактериологического исследования. В каждой порции мокроты определялись КУМ методом люминесцентной микроскопии, производились посевы на плотные питательные среды, однократно - посев на жидкие питательные среды в системе BACTEC MGIT 960, двукратно применялись молекулярно-генетические методы идентификации возбудителя - мультиплексная ПЦР real time (CFX-96) и генетических маркеров лекарственной устойчивости возбудителя ри-фампицину. При культуральных методах исследования применялись следующие виды идентификации МБТ: мазок культуры с окраской по Циль-Нильсену, экспресс иммунохроматогра-фия на чипе для дифференциации туберкулёзных и нетуберкулёзных микобактерий. Определение фенотипических признаков лекарственной устойчивости МБТ на плотных средах
производилось методом абсолютных концентраций и позволило оценить ЛУ возбудителя к препаратам первого ряда (изониазид - Н, рифампицин - R, этамбутол - E), за исключением стрептомицина, так как в Пермском крае высокий уровень устойчивости МБТ к нему; к препаратам второго ряда (канамицин - Km, этионамид - Еа, офлоксацин - Ofl, аминосалициловая кислота - PAS). В системе BACTEC для теста лекарственной чувствительности МБТ использовался метод пропорций с определением ЛУ к препаратам первого ряда (изониазид - Н, рифампицин - R, этамбутол - E, пиразинамид - Z), препарату второго ряда офлоксацину - Ofl.
Для обработки фактического материала и подтверждения различий в информативности методов идентификации и ЛЧ МБТ использованы следующие статистические подходы: коэффициент углового преобразования Фишера (ф*) и критерий распределения х2 для качественных признаков.
Результаты исследования. Комплексное микробиологическое обследование лиц с ко-инфекцией показало, что ДНК МБТ определялись у 84,4% больных, люминесцентный метод подтвердил бактериовыделение в 87,5% случаев, посев на жидкие питательные среды -76,9%, посев на плотные среды - 84,4%. Генетические маркеры МЛУ (мутации к R) определялись в 81,5% случаев от ДНК+ и в 68,8% случаев от всех бактериовыделителей, культураль-ными методами множественная лекарственная устойчивость МБТ подтверждена у 76,9% бактериовыделителей по BACTEC и в 85,7% случаев на плотных средах (табл.).
Среди ВИЧ-негативных пациентов с деструктивными формами туберкулёза заболевание верифицировано этиологически обнаружением ДНК МБТ в 84,4% случаев, культураль-ными методами - значительно чаще, в 98,9% (табл. 1). При сравнении результатов посевов на жидкие и на плотные питательные среды различий по частоте бактериовыделения и доле МЛУ МБТ не было, поэтому для сравнения с МГМ они объединены в одну совокупность (табл).
Таблица
Результаты молекулярно-генетических и культуральных методов идентификации и определения ЛУ МБТ (%)
Результат Генетические маркеры ЛУ MБT (ПЦР) Посев и фенотипические маркеры ЛУ МБТ (на жидких и плотных средах)
ВИЧ+ ВИЧ- ВИЧ+ ВИЧ-
Положительный (МБТ+) 76 84,4 89 98,9
МЛУ МБТ, от всех бактериовы- 68,8 69,7 84,4* 64,0
делителеи
МЛУ МБТ, от МБТ+ метода 81,5 81,1 84,4* 64,0
ШЛУ(ЛУ к Н+R+Ofl+Km) 23,8* 10,5
ПреШЛУ (ЛУ к Н+R+Ofl или Km) 19,1* 8,3
Примечание: * - различия достоверны при сравнении групп ВИЧ+ и ВИЧ-, р<0,05, ф*
Молекулярно-генетические методы одинаково успешно выявляли генетические маркеры МЛУ в виде мутаций к рифампицину как при ВИЧ+, так и при ВИЧ - (табл.). Культуральные методы чаще подтверждали МЛУ при ВИЧ+ статусе. Вместе с тем, у ВИЧ-позитивных широкая лекарственная устойчивость МБТ более надежно определялась традиционным методом на плотных средах (23,8%), чем на жидких (10,0%) (р<0,05, ф*). В то же время в 22 (24,5%) случаев наблюдались несовпадения результатов МГМ и культуральных методов [7], и 15% несовпадений при выявлении ЛУ МБТ среди культуральных методов. Настораживает высокая частота устойчивости МБТ к пиразинамиду - 35% у ВИЧ+ пациентов и 49,4% случаев среди ВИЧ-негативных больных [7].
При анализе характера бактериовыделения при различном иммунном статусе установлено, что КУМ в мокроте чаще определялись в лицах с низким иммунным статусом (1 группа
в 81,2%, 2 группа - в 100% случаев), чем с СД4 более 350 (66,7%)(p<0,05, ф*). ДНК МБТ в мокроте обнаруживалась с той же закономерностью (1 группа - 68,9%, 2 группа - 100%, 3 группа несколько реже - 58,3% случаев) (p<0,05, ф*). Культуральные методы подтвердили те же особенности обнаружения МБТ при низком уровне СД4 (BACTEC 93,8%, 75,0%, 58,3% соответственно; плотные среды 93,8%, 62,5% и 91,7% соответственно, исключение - 3 группа). Мутации, обусловливающие устойчивость МБТ к рифампицину, найдены примерно с одинаковой частотой во всех трех группах наблюдения (56,3%, 62,5% и 58,3%). Доля МЛУ и ШЛУ, диагностируемая культуральными методами, соответствовала результатам ПЦР-диагно-стики: в системе BACTEC 69,2% в 1 группе, 50% во 2 группе, 57,1% в 3 группе; на плотных средах - 63,0%, 50,0% и 72,5% соответственно. Выводы:
1. Высокая интенсивность бактериовыделения у больных с ко-инфекцией, эффективнее определяется культуральными методами, чем молекулярно-генетическими, связана с дефектом регуляции иммунного ответа Т-лимфоцитами, уменьшением способности клеточного иммунитета к ограничению размножения и распространения микобактерий туберкулёза.
2. Культуральные методы столь же информативны, как молекулярно-генетические и показывают равную частоту МЛУ форм как у ВИЧ+, так и у ВИЧ- пациентов, имеют большее значение для определения ШЛУ МБТ, особенно у ВИЧ+ пациентов.
3. Высокая частота устойчивости к пиразинамиду девальвирует результативность основных режимов химиотерапии независимо от ВИЧ статуса.
