CC BY
91
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.873.21:575.174.015.3
СтарковаД.А.1, МокроусовИ.В.1, Вязовая А.А.1, Журавлев В.Ю.,2 Оттен Т.Ф.2,
Вишневский Б.И.2, Нарвская О.В.1
геномный полиморфизм штаммов MYCOBACTERIUM AVIUM subsp.
HOMINISSUIS
1Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г. Санкт-Петербург, 197101; 2Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии, г Санкт-Петербург,
191036
Нетуберкулезные микобактерии Mycobacterium avium subsp. hominissuis (MAH) способны вызывать микобактериоз у человека. В данной работе приведены результаты первого в России комплексного исследования геномного полиморфизма клинических штаммов MAH с использованием схемы типирования по 13 локусам MATR-VNTR (TR292, TRX3, TR25, TR47, MATR-1, MA-TR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16), содержащим тандемные повторы нуклеотидов, и К1245-К^ЪР-типирования. Изучены 90 штаммовMAH, выделенных в 2008-2011 гг. от эпидемиологически не связанных больных микобактериозом легких (включая ВИЧ-инфицированных). Выявлена неоднородность штаммов МАН (36 вариантов профилей по 13 локусам MATR-VNTR). Большинство (68,8%) изученных штаммов входили в состав 8 кластеров MATR-VNTR; наиболее крупный кластер включал 37 штаммов с 13-значным числовым профилем 2222223145443'. В нуклеотидной последовательности локуса MATR-16 (3') выявлена протяженная деле-ция (GenBank accession no. KF479191). Штаммы MAH, входящие в состав кластеров MATR-VNTR, были неоднородны по маркеру IS1245. Метод MATR-VNTR-типирования по 13 локусам целесообразно использовать для предварительной дифференциации российских штаммов MAH с последующим анализом кластеров MATR-VNTR методом IS1245-RFLP-типирования. Ключевые слова: микобактериоз; Mycobacterium avium; MATR-VNTR-типирование; IS1245-RFLP-типирование.
Нетуберкулезные микобактерии вида Mycobacterium avium, типичные обитатели окружающей среды, способны вызывать микобактериоз - инфекционное заболевание животных, птиц и человека с преимущественным поражением легких. В настоящее время с учетом антигенных свойств и экологических характеристик микроорганизма принято выделять несколько подвидов M. avium: subspp. avium, silvaticum, paratu-berculosis и hominissuis, представители которых поражают в основном птиц, диких и домашних животных [1, 2]. Инфекционный процесс, вызываемый бактериями M. avium subsp. hominissuis (MAH) (серотипы 4-6, 8-11 и 21) у человека, характеризуется поражением легких у иммунокомпетентных лиц и носит, как правило, диссеминированный характер у ВИЧ-инфицированных [3-5].
Для оценки штаммовой вариабельности MAH, обусловленной полиморфизмом кодирующих и неко-дирующих последовательностей генома, используют комплекс молекулярно-генетических методов: VNTR (Variable Number Tandem Repeats) - типирование и IS1245-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - типирование [6, 7].
Метод VNTR-типирования является относительно недорогим, воспроизводимым и простым в исполнении. Полиморфизм локусов VNTR, отражающий ми-
Для корреспонденции: Старкова Дарья Андреевна (Starkova Daria Andreevna); e-mail: dariastarkova13@gmail.com
For correspondence: starkova Daria Andreevna; e-mail: dariastarko-va13@gmail.com
кроэволюцию генома, возникает в результате любых изменений мини-сателлитных последовательностей ДНК - коротких (10-100 п.н.) тандемных повторов (Tandem Repeat - TR), расположенных, как правило, между структурными генами [8]. Мультилокусный числовой профиль штамма определяется числом тан-демных повторов в каждом локусе.
До недавнего времени для дифференциации изоля-тов M. avium использовали 8 локусов VNTR (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32), которые первоначально были описаны у M. avium subsp. para-tuberculosis К10 [6]. Учитывая невысокую степень вариабельности большинства из 8 локусов VNTR для типирования штаммов M. avium subsp. hominissuis, японские исследователи предложили 15-локусную схему, которая включала локусы MATR (Mycobacterium Avium Tandem Repeats): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Анализ in silico выявил высокую гомологию последовательностей TRX3 и MATR-3, TR292 и MATR-2, TR10 и MATR-9, что позволяет оптимизировать схему MATR-VNTR-типирования MAH [9, 10].
В геноме MAH присутствуют мобильные элементы - инсерционные последовательности (Insertion Sequence - IS). Так, мобильный элемент IS1245 (427 п.н.) представлен, как правило, множественными копиями, что отражает геномные перестройки, обусловленные его транспозицией. Метод IS1245-RFLP-типирования позволяет проводить тонкую дифференциацию штаммов MAH путем оценки количества и взаимного расположения фрагментов в паттернах рестрикции IS1245 [7]. К числу недостатков данного метода можно отнести длительность и трудоемкость анализа, особые требования к качеству и количеству бактериальной ДНК. Сложность интерпретации результатов IS1245-RFLP-типирования связана с определенной долей субъективности при оценке мультибендовых паттернов, содержащих более 20 фрагментов рестрикции IS1245.
Ранее на основе 8-локусного VNTR-типирования нами выявлена генетическая неоднородность штаммов M. avium subsp. hominissuis - возбудителя мико-бактериоза человека [11]. Целью настоящего исследования явилось изучение геномного полиморфизма клинических изолятов MAH с использованием MA-TR-VNTR- и IS1245-RFLP-типирования.
Материалы и методы
Изучены 90 штаммов M. avium, выделенных в 2008-2011 гг. в Санкт-Петербургском НИИ фтизиопульмонологии от жителей Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Из них 72 штамма M. avium были получены от эпидемиологически не связанных больных микобактериозом легких (включая 27 ВИЧ-инфицированных), 18 выделены однократно от пациентов с подозрением на туберкулез.
383197 М.avium 104 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCTCATCGAGTTCGGT
Strain 5122 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCTCATCGAGTTCGAT <->
59 bp
383256 M.avium 104 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCTCATCGAGTTCGGT
Strain 5122 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCTCATCGA-TTCGA-<->
57 bp
383315 M.avium 104 GCGATCGCAAGCGCGGCGCTTGTCGCCGGGCGCAGCGGGTCGCCCGGATCGATTCG
Strain 5122 ............................GGCGCAGCGGGTCGCCCGGATCGATTCG
<--->
28 bp
Рис. 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей локуса MATR-16 (3') штаммов МАН M. avium 104 (GenBank accession no.
NC008595) и № 5122 (GenBank accession no. KF479191).
Нуклеотидные позиции локуса и наименования штаммов приведены слева. Делеции нуклеотидов обозначены точками.
Чистые культуры микобактерий, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена, были идентифицированы до вида M. avium (с помощью тест-системы GenoType®Mycobacterium CM/ AS, Hain Lifescience, Германия) и отнесены к подвиду hominis-suis с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) для детекции инсерционных элементов IS901, IS900 [3, 11].
Образцы ДНК выделяли из чистых культур МАН с использованием стандартного метода [12].
Аллельный полиморфизм штаммов MAH оценивали методом MATR-VNTR-типирования по 15 вариабельным локусам MATR-: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 с использованием фланкирующих праймеров T. Inagaki и соавт. [9]. Продукты ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Маркеры молекулярной массы: 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис», Москва) и 50 bp (GE Healthcare, США) служили для определения «размера» продуктов амплификации. Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей BioRad «GelDoc» (США). Число тандемных повторов в локусах рассчитывали согласно таблице молекулярных масс ам-пликонов [8].
Прямое секвенирование (по Сенгеру) амплифицированного фрагмента локуса MATR-16 (3') осуществляли c использованием анализатора ABI Prism 3130. Полученные данные анализировали с помощью пакета программ Unipro UGENE 1.12.
Степень родства между штаммами MAH оценивали с использованием алгоритма Neighbor Joining (NJ) и графически отображали в виде дендрограммы, построенной с учетом полиморфизма локусов MATR-VNTR на сайте http://www.miru-vntrplus.org
Для дифференцирования штаммов MAH, входивших в состав кластеров MATR-VNTR, использовали метод IS1245-RFLP [13, 14]. Рестрикцию ДНК штаммов MAH проводили с помощью эндонуклеазы PvuII («Fermentas», Литва); фрагменты рестрикции разделяли методом электрофореза в 0,8% агарозном геле в течение 32 ч при постоянном напряжении 42 В. ДНК переносили на мембрану Hybond N+ («Amersham», США), ги-бридизовали (по Саузерну) с DIG-меченным зондом IS1245, который получали путем амплификации ДНК штамма М. avium IWGMT49 со специфическими праймерами Р1 и Р2 [7]. Продукты гибридизации визуализировали на мембране с помощью конъюгата анти-ЭЮ-щелочной фосфатазы, нитротетразолия синего и бром-хлор-индолилфосфата [13, 14]. Полученные профили IS1245-RFLP анализировали с использованием пакета программ BioNumerics®5.1 («Applied Maths», Бельгия). Степень родства между штаммами MAH графически отображали в виде дендрограммы, построенной с использованием иерархического алгоритма связывания UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Averages) и коэффициента Дайса.
Для количественной оценки вариабельности локусов MATR-VNTR и дискриминирующей способности схем MATR-VNTR- и IS1245-RFLP-типирования рассчитывали индекс разнообразия
Хантера-Гастона (Hunter Gaston Discriminatory Index - HGDI) [15] с помощью алгоритма, приведенного на сайте http://www. hpa-bioinformatics.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl.
Результаты и обсуждение
Изоляты микобактерий (n=90) были отнесены к виду M. avium с использованием тест-системы GenoType®Mycobacterium CM/AS и подвиду hominis-suis на основании анализа продуктов амплификации инсерционных элементов IS907 и 1S900, как описано ранее [11].
Сопоставление результатов типирования изученных штаммов MAH по 15 локусам MATR и 8 локусам VNTR выявило одинаковое число повторов в парах локусов TRX3 и MATR-3, TR292 и MATR-2, TR10 и MATR-9, что согласуется с данными японских исследователей [9, 10]. Таким образом, для типирования штаммов российской популяции МАН целесообразно использовать 12 из 15 локусов MATR-: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16.
Таблица 1
Аллельный полиморфизм локусов MATR 90 штаммов MAH
Локус Число повторов HGDI
0 1 2 3 4 5 6
MATR-1 4 7З 6 7 0,З1б
MATR-4 16 70 4 0,З6б
MATR-5 5 S 77 0,242
MATR-6 l 79 l 9 0,222
MATR-7 2 7б S б l 0,264
MATR-S l 16 l 72 0,З0З
MATR-11 1З з lS S9 0,5З1
MATR-12 S9 l 0,022
MATR-B 9l 0,000
MATR-14 l 22 б7 0,Зб7
MATR-15 22 l б7 0,Зб7
MATR-16 ll 79* 0,З2б
Примечание. * 72 из 79 штаммов имели «усеченный» локус MATR-16.
Рис. 2. Дендрограмма профилей MATR-VNTR 90 штаммов MAH.
ШУ+ - ВИЧ-инфицированные; 3' - условное обозначение «усеченного» локуса МАТЯ-16; • - штаммы, выделенные однократно. Кластеры штаммов с идентичными числовыми профилями выделены прямоугольниками.
Рис. 3. Филогенетическое древо профилей рестрикции IS1245 59 штаммов MAH, построенное с использованием алгоритма
UPGMA.
Шкала в верхней части рисунка показывает степень (в %) генетического родства штаммов. Наименование, профиль MATR-VNTR штаммов и ВИЧ-статус (HIV+) пациентов указаны справа. Кластеры штаммов с идентичными профилями рестрикции IS1245 выделены прямоугольниками.
В результате 12-локусного MATR-типирования у 90 штаммов МАН выявлен 31 вариант профилей. Индивидуальные 12-значные числовые профили MATR имели 22 штамма. Остальные 68 (75,5%) штаммов
с идентичными числовыми профилями входили в состав девяти кластеров. Наиболее крупный кластер с числовым профилем 223134532443' включал 38 (42,2%) штаммов, кластеры - 213134532443' и
Таблица 2
Дискриминирующая способность различных схем MATR-VNTR-типирования 90 штаммов MAH
Схема типирования Число профилей Число кластеров Число штаммов в кластере HGDI
8 локусов VNTR 17 8 2-46 0,714
12 локусов MATR 31 9 2-38 0,806
20 локусов MATR-VNTR 36 8 2-37 0,821
13 локусов MATR-VNTR 36 8 2-37 0,821
423132432222 - по 10 (11,1%) и семь (7,7%) штаммов соответственно; остальные кластеры содержали 2-3 штамма.
Особый интерес представлял локус MATR-16. Было замечено, что молекулярная масса продукта амплификации MATR-16, одинаковая у 72 из 90 штаммов, не соответствовала значениям, приведенным T. Inaga-ki и соавт. для различного числа тандемных повторов в данном локусе [9]. Секвенирование амплифициро-ванного фрагмента MATR-16 нескольких штаммов МАН этой группы выявило делецию двух нуклеоти-дов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе, что объясняет уменьшение размера амплифицированного фрагмента MATR-16 у таких штаммов по сравнению со штаммом МАН M. avium 104 (GenBank accession no. NC008595) (рис. 1). Данный «усеченный» аллель (обозначен 3') описан нами впервые (GenBank accession no. KF479191). Остальные 18 штаммов имели 2 или 3 типичных повтора в локусе MATR-16.
Анализ аллельного полиморфизма каждого из 12 локусов MATR продемонстрировал разную степень их вариабельности по числу тандемных повторов (табл. 1). Как видно из табл.1, наиболее выраженным полиморфизмом отличались локусы MATR-1, MATR-4, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16 (HGDI > 0,300).
Принимая во внимание дискриминирующую способность каждого из 8 локусов VNTR [11] и 12 локу-сов MATR (см. табл. 1), была осуществлена оптимизация схемы типирования штаммов российской популяции MAH. Так, сопоставление значений индекса разнообразия Хантера-Гастона для каждого из 20 локусов (12 - MATR и 8 - VNTR) показало, что наиболее «информативными» были 13 локусов, а именно: TR292, TRX3, TR25, TR47, MATR-1, MA-TR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16. Данная схема (13 локусов) MATR-VNTR не отличалась по дискриминирующей способности от 20-локусной (HGDI 0,821), но была более эффективной, чем 8-локусная (HGDl 0,714) и 12-локусная (HGDI 0,806) схемы типирования российских штаммов МАН (табл. 2).
Таким образом, в результате типирования по 13 локусам MATR-VNTR у 90 штаммов МАН было выявлено 36 вариантов профилей. Степень родства между штаммами различных MATR-VNTR-типов отражена на дендрограмме (рис. 2). Как видно из рис. 2, индивидуальные профили MATR-VNTR име-
ли 28 штаммов; 62 (68,8%) штамма с идентичными числовыми профилями были представлены кластерами Ма1-Ма8. Наиболее крупный кластер Ма6 включал 37 (41,1%) штаммов с числовым профилем 2222223145443'; кластеры Ма2 (2422213145443') и Ма8 (2533423124222) включали по 7 (7,7%) штаммов соответственно, остальные содержали 2-3 штамма. При этом в состав кластеров входило большинство штаммов, полученных от больных микобактерио-зом (48 из 72), в том числе ВИЧ-позитивных (18 из 27) (см. рис. 2).
Для оценки генетической однородности 62 штамма MAH, входящих в состав кластеров согласно 13-локусной схеме MATR-VNTR типирования, были подвергнуты дальнейшему генотипированию с использованием метода IS1245-RFLP-типирования. У 59 штаммов были получены мультибендовые профили рестрикции У81245 удовлетворительного качества; один штамм MAH не содержал инсерционного элемента 181245. Несмотря на достигнутый высокий уровень дискриминации (HGDI 0,996), основным недостатком метода IS1245-RFLP по сравнению с MATR-VNTR типированием явилась сложность компьютерной обработки мультибендовых паттернов рестрикции (более 20 фрагментов).
Результаты RFLP-типирования представлены на дендрограмме (рис. 3), отражающей степень генетического родства между штаммами MAH на основании оценки сходства профилей рестрикции У81245, которые различались как по количеству, так и по молекулярной массе фрагментов. Число фрагментов рестрикции, соответствующее числу копий У81245, варьировало от 9 до 33.
Всего у 59 штаммов MAH в результате RFLP-типирования выявлен 51 тип профилей рестрикции У81245 (см. рис. 3). Как видно из рисунка, 47 типов были индивидуальны, а остальные представлены кластерами Mav1-Mav4, в состав которых входили 2-3 штамма. Таким образом, из 59 штаммов MAH, входящих в кластеры MATR-VNTR, лишь 9 входили в состав 4 кластеров RFLR
Кластеры Mav1 и Mav2 включали по 2 штамма MAH ВИЧ-позитивных пациентов. Кластер Mav4 представлен двумя штаммами больных микобак-териозом, один из которых был ВИЧ-позитивным; Mav3 объединял 3 штамма MAH ВИЧ-негативных пациентов.
Теоретически результаты IS1245-RFLP-типирова-ния штаммов MAH могут свидетельствовать о наличии общих источников и факторов передачи возбудителя в группах больных, чьи штаммы входили в состав кластеров Mav1-Mav4, однако эпидемиологические исследования не выявили связей между случаями заболевания. Полученные данные согласуются с общепринятым мнением о роли объектов окружающей среды в качестве источника инфицирования (в том числе внутрибольничного) человека нетуберкулезными микобактериями.
Использование независимых генетических маркеров - тандемных повторов и инсерционных элементов, обладающих разной скоростью и механизмами эволюции, позволило провести комплексную оценку геномного полиморфизма штаммов MAH, достигая различной степени их дискриминации в зависимости
от задач исследования. В этой связи для предварительной дифференциации российских штаммов MAH целесообразно использовать типирование по 13 локу-сам MATR-VNTR с последующим анализом MATR-VNTR-кластеров методом IS1245-RFLP для установления эпидемиологических связей между случаями заболевания.
Сведения об авторах:
Старкова Дарья Андреевна (Starkova Daria Andreevna) - ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Служебный адрес: 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира д. 14; e-mail: dariastarkova13@gmail.com
Мокроусов Игорь Владиславович (Mokrousov Igor Vladislavovich) - e-mail: imokrousov@mail.ru
Вязовая Анна Александровна (Vyazovaya Anna Aleksandrovna) - e-mail: annavyazovaya@pasteurorg.ru;
Журавлев Вячеслав Юрьевич (Zhuravlev Vyacheslav Yurievich)
Оттен Татьяна Фердинандовна (Otten Tatiana Ferdinandovna) - ФГБУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии, служебный адрес: 193063, Санкт-Петербург, Литовский просп., д. 2-4; e-mail: ottentf@mail. ru
Вишневский Борис Израилевич (Vishnevskiy Boris Izrailevich)
Нарвская Ольга Викторовна (Narvskaya Olga Vikto-rovna) - e-mail: onarvskaya@gmail.com
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Turenne C.Y., Wallace R., Behr M.A. Mycobacterium avium in the postgenomic era. Clin. Microbiol. Rev. 2007; 20 (2): 205-29.
2. Mijs W., de Haas P., Rossau R., Van Der Laan T., Rigouts L., Portaels F., van Soolingen D. Molecular evidence to support a proposal to reserve the designation Mycobacterium avium subsp. avium for bird-type isolates and M. avium subsp. hominissuis for the human/porcine type of M. avium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002; 52: 1505-18.
3. Bartos M., Hlozek P., Svastova P. et al. Identification of members of Mycobacterium avium species by Accu-Probes, serotyping, and single IS900, IS901, IS1245 and IS901-flanking region PCR with internal standards. J. Microbiol. Methods. 2006; 64: 333-45.
4. Otten T.F., Vasiliev A.V. Micobacterioz. Sankt Petersburg: Meditsin-skaya pressa; 2005. (in Russian)
5. Litvinov V., Makarova M., Krasnova M. Netuberkulezniye micobac-terii. Мoscow: MNPCBT; 2008. (in Russian)
6. Thibault V. C., Grayon M., Boschiroli M. et al. New Variable-Number Tandem-Repeat Markers for Typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M. avium strains: Comparison with IS900 and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism Typing. J. Clin. Microbiol. 2007; 45 (8): 2404-10.
7. Guerrero C., Bernasconi C., Burki D., Bodmer T., Telenti A. A novel insertion element from Mycobacterium avium, IS1245, is a specific target for analysis of strain relatedness. J. Clin. Microbiol. 1995; 33 (2): 304-7.
8. Supply P., Mazars E., Lesjean S., Vincent V., Gicquel B., Locht C. Variable human minisatellite-like regions in the mycobacterium tuberculosis genome. Mol. Microbiol. 2000; 36 (3): 762-71.
9. Inagaki T., Nishimori K., Yagi T., et al. Comparison of a Variable-
Number Tandem-Repeat (VNTR) Method for Typing Mycobacterium avium with Mycobacterial Interspersed Repetitive-Unit-VNTR and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism Typing. J. Clin. Microbiol. 2009; 47(7): 2156-64.
10. Iwamoto T., Nakajima C., Nishiuchi Y. et al. Genetic diversity of Mycobacterium avium subsp. hominissuis strains isolated from humans, pigs, and human living environment. Infect. Genet. Evol. 2012; 12(4): 846-52.
11. Starkova D. A., Otten T.F., Mokrousov I. V., Vyazovaya A. A., Vishnevsky B. I., Narvskaya O. V. Genotypic characteristics of Mycobacterium avium subsp. hominissuis Strains. Russian Journal of Genetics. 2013; 49(9): 909-14.
12. Van Embden J., Cave M., Crawford J. et al. Strain identification on Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 406-9.
13. Van Soolingen D., Bauer J., Ritacco V., Leao S.C., Pavlik I., Vincent V. et al. IS1245 restriction fragment length polymorphism typing of Mycobacterium avium isolates: proposal for standardization. J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 3051-4.
14. Van Soolingen D., da Haas P. E. W., Hermans P. W. M., Van Embden J. D. A. RFLP analysis of mycobacteria. National Institute of Public Health and Environmental Protection. Netherlands: Bilthoven; 1992.
15. Hunter P., Gaston M. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988; 26 (11): 2465-6.
Поступила 31.01.14 Received 31.01.14
THE GENOME POLYMORPHISM OF THE MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP. HOMINISSUIS STRAINS
Starkova D. A.', Mokrousov I. V.', Vyazovaya A. A.', Zhuravlev V. Yu.2, Otten T. F.2, Vishnevskiy B. I.2, Narvskaya O. V.'
1St. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russia; 2St. Petersburg Institute of Phthisiopulmonology, St. Petersburg, Russia
The non-tuberculosis mycobacteria Mycobacterium avium subsp. hominissuis (MAH) are able to cause human mycobacteriosis. In this work, the results of the first comprehensive study of the genome polymorphism of the clinical strains of MAH were reported using the typing scheme by 13 loci MATR-VNTR (TR292, TRX3, TR25, TR47, MATR-1, MATR-4, MATR-5, MATR-6, MATR-8, MATR-11, MATR-14, MATR-15, MATR-16) containing tandem nucleotide sites and IS1245-RFLP-typing sites. A total of 90 MAH strains isolated from patients with lung mycobacteriosis without epidemiological connection (including HIV infected) were tested in 2008-2011. The inhomogeneity of the MAH strains by 36 profiles of 13 loci MATR-VNTR was observed. The majority of the strains (68.8%) were included in the 8 MATR-VNTR clusters; most large cluster contained 37 strains with 13-bitnumerical profile 2222223145443'. The nucleotide sequence of the MATR-16 (3') locus contains the long deletion (GenBank accession no. KF479191). The MAH strains of the MATR-VNTR clusters were found to be inhomogeneous by the IS1245 marker. The MATR-VNTR-typing method by 13 loci is recommended for preliminary differentiation of domestic MAH strains with further analysis of the MATR-VNTR clusters using the IS1245-RFLP-typing method.
Key words: mycobacteriosis, Mycobacterium avium, MATR-VNTR-typing, IS1245-RFLP-typing
