CC BY
79
DOI: 10.23868/201811030
геномная хирургия митохондрий человека
И.О. Мазунин
Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта, Калининград, Россия human mitochondrial genome surgery
!.О. Маzunin
Immanuel Kant Baltic Federal University, Kaliningrad, Russia e-mail: IMazunin@kantiana.ru
Патогенные мутации митохондриальной ДНК (мтДНК) зачастую находятся в состоянии гетероплазмии. Нарастание количества мутантных мтДНК приводит к усугублению симптоматики митохондриальных заболеваний с возрастом, а также является характерным признаком старения организма. Манипулирование уровнем гетероплазмии считается наиболее перспективным направлением в генной терапии этой группы заболеваний. Стратегия манипулирования заключается в использовании молекулярных конструкций, которые специфически связываются с определенной нуклеотидной последовательностью мтДНК и вносят в нее двухцепочечные разрывы. В настоящем обзоре описаны генетические конструкции, предназначенные для сдвига уровня гетероплазмии мутантной мтДНК. Широко используемые конструкции представлены белковыми машине-риями (т^оРЕБ, т^сСТЫ, тйоТА_Е№), однако им на смену приходят более гибкие системы, включающие помимо белков молекулу РНК (тйоРСЕ№). Обозначен круг задач, которые могут быть решены с использованием таких систем.
ключевые слова: митохондрии, редактирование мтДНК, тйоР8Е№.
Pathogenic mitochondrial DNA (mtDNA) mutations are often in a state of heteroplasmy. The increasing mtDNA mutation load with age generally related to aggravation of symptoms and is also a one of the main sign of organism aging. Heteroplasmy shifting which can alleviate mitochondrial functionality is most perspective approach to fight mitochondrial diseases. Molecular machines to shift heteroplasmy level recognize mutant mtDNA and cut them. In general the molecular machines could be divided into two groups: mitochondria-targeted protein-only nucleases such as mitoREs, mitoZFNs, mitoTALENs, and RNA-protein systems such as mitoR-GENs. The latest seem to be more flexible and offer perspective due to their reliance on Watson-Crick interactions for specific mtDNA site recognition. We discuss also some application area for the mi-toRGEN systems.
Keywords: mitochondria, mtDNA editing, mitoRGENs.
Введение
Исследования в области митохондриальной биологии в последнее время становятся все более актуальными. Прежде всего, это связано с расширением понимания роли митохондрий в развитии, дифференцировке и функционировании клеток организма как в норме, так и в патологическом состоянии [1]. Оказалось, что геном митохондрий (мтДНК) более емкий с информационной точки зрения, нежели считалось ранее: помимо общепризнанных 37 генов [2], в геноме митохондрий человека могут быть закодированы функциональные пептиды [3, 4], длинные некодирующие РНК [5, 6] и даже несколько микроРНК [7]. Несмотря на относительно небольшое количество генов в мтДНК, мутации в них ассоциированы как с наследственными заболеваниями, так и процессом старения организма [8-10]. Все это привело к развитию так называемой митохондриальной медицины — отдельному направлению исследований в области выявления пациентов с дефектными митохондриями и разработке методов терапии [11]. Тем не менее, подавляющее большинство митохондриальных заболеваний не поддается лечению, а практикующие врачи вынуждены лишь купировать симптоматические проявления заболеваний.
До настоящего времени единственным подходом к устранению мутаций мтДНК в клеточных линиях человека является использование сайт-специфических нуклеаз [12]. В частности, это направляемые в митохондрии клеток человека эндонуклеазы рестрикции, TAL-эффекторные нукле-азы и нуклеазы типа «цинковые пальцы». Перечисленные подходы базируются на использовании принципа узнавания белковой молекулой специфической нуклеотидной последовательности мтДНК, внесения в нее двухцепочечного разрыва и последующей элиминацией мтДНК ферментами репликативной машины. Технологии, основанные на системах CRISPR [13], в этом контексте являются более гибкими и перспективными, поскольку используют РНК для узнавания ДНК по принципу Уотсона-Крика. Особенно интересны
новейшие системы, не привязанные к формированию двух-цепочечных разрывов как промежуточного шага в ходе редактирования ДНК [14-16]. Поскольку система СИБРП представляет собой продукт естественной эволюции генетического кода микроорганизмов (бактерии и археи), созданные генно-инженерные конструкции на основе СИБРП мы будем обозначать как РНК-направляемые эндонуклеазы (П1\А-дЫСеС епСопис^аэеБ, п6е1\1б). Ограничением повсеместного использования таких систем в отношении мтДНК является их двухкомпонентная природа: ПОЕ№ представлены белковой и РНК структурами. Успешная доставка молекул РНК в митохондрии во многом остается под вопросом, хотя существуют доказательства такого импорта [17]. Представленный обзор посвящен имеющимся в настоящее время технологиям манипуляции с геномом митохондрий человека (табл. 1).
Белковые системы редактирования
В этой главе будут описаны белковые системы редактирования, созданные для элиминации определенных гапло-типов мтДНК (рис. 1). В более широком варианте супрессия мутаций может быть достигнута также компенсацией работы дефектного гена как на уровне белка, так и ДНК, а также подавлением репликации мутантной мтДНК. Далее по тексту мы описываем только технологии, позволяющие физически вмешиваться в структуру генетического кода.
Направляемые в митохондрии
эндонуклеазы рестрикции (mitoREs)
Впервые направленный сдвиг уровня гетероплаз-мии мтДНК был проведен на клеточных линиях человека (293Т) в 2001 году командой исследователей из университета Майами [18]. Авторы исследования использовали генетическую конструкцию, кодирующую эндонуклеазу рестрикции Pst\ с последовательностью митохондриальной локализации гена COX8A. В геноме митохондрий человека содержатся два близко расположенные сайта узнавания
Таблица 1. Технологии редактирования митохондриальных ДНК
Инструмент редактирования
Область применения
Ограничения метода
Ссылка
Направляемые в митохондрии эндонуклеазы рестрикции (тйоПЕз)
Митохондриальные нуклеазы типа цинковые пальцы (тйо7Р№)
Митохондриальные ТА1_-эффекторные нуклеазы (тлШТА1_Е№)
Митохондриальная система ПЭЕМ/ 8рСаз9 (mitoRGEN/SpCas9)
Митохондриальная система RGEN/ AsCpf1(mitoRGEN/AsCpf1)
Митохондриальные системы редактирования оснований (mitoRGEN/SpCas9BE4-GAM и mitoRGEN/SpCas9ABE 7.10)
m.8993T>G
1Т1.8993Т^ основная делеция
m.3243A>G
m.8344A>G
m.9176T>C
m.13513G>A
m.14459G>A
основная делеция
создание делеции
Уменьшение количества копий мтДНК
Импорт нуклеазы в митохондрии и модификация направляющих РНК
Импорт нуклеаз в митохондрии
Ограниченное количество мутаций создают уникальный сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции
Трудоемкость в конструировании, большой размер конструкции
Трудоемкость в конструировании, большой размер конструкции (исключение — mitoTev-TA_E)
Неэффективный импорт молекул РНК в митохондрии
[18, 22, 23]
[24-27]
[29-34]
[40, 50, 51]
[60]
[63]
РэЬ\, в связи с чем планировалось увидеть «вырезание» фрагмента мтДНК между рестрикционными сайтами, а также исследовать возможность процесса рекомбинации с вовлечением делетированной мтДНК. Было показано, что импорт РвЬ\ приводил к деградации мтДНК ферментами матрикса митохондрий. Кроме того, авторам исследования не удалось зафиксировать факт соединения концов мтДНК молекулы после действия РвЬ\. Подобные результаты намного позже подтвердили другие исследователи, используя ту же эндонуклеазу рестрикции [19]. Вывод очевиден — быстро делящиеся клетки как правило не накапливают делеции в мтДНК. Формирование делеции между сайтами РвЬ\ удалось показать только на мышиных моделях в терминально дифференцированных клетках [20, 21].
Рис. 1. Направляемые в митохондрии нуклеазы, узнающие специфический сайт мтДНК посредством белок-ДНК взаимодействия: mitoREs — митохондриальные эндонуклеазы рестрикции; mitoTA_ENs — митохондриальные TA_-эффекторные нуклеазы; mitoZFNs — митохондриальные нуклеазы типа «цинковые пальцы». Из [45] с изм.
Появление в геноме митохондрий мутации m.8993T>G приводит к формированию уникального сайта узнавания эндонуклеазой рестрикции Бта\. Для сдвига уровня гетероплазмии по данной мутации в сторону мтДНК дикого типа в цитоплазматической гибридной линии клеток (цибриды) была использована модифицированная митохондриальным сигнальным пептидом Бта\ [22]. Дальнейшие работы с использованием изо-шизомера этой рестриктазы Хта\ показали, что для эффективной элиминации мутации m.8993T>G необходимо до пяти раундов трансфекции цибридов конструкцией, кодирующей модифицированную рестриктазу [23].
На сегодняшний день — это единственные примеры использования модифицированных для импорта в митохондрии клеток человека эндонуклеаз рестрикции. Отсутствие других примеров связано с редкостью формирования уникального сайта узнавания рестриктазой при появлении патогенной мутации в мтДНК.
Митохондриальные нуклеазы типа
цинковые пальцы (mitoZFNs)
Одним из решений ограничения использования mitoREs в отношении патогенных мутаций мтДНК является создание нуклеаз, специфически связывающихся с определенной последовательностью ДНК и импортируемых в митохондрии. Пионерской работой в этой области стало исследование возможности импорта внутрь митохондрий нуклеазы типа «цинковые пальцы» (mitoZFNs) [24]. Было показано, что нуклеаза типа «цинковые пальцы», слитая с митохондриальной детерминантой импорта, а также с метилтрансферазой DNMT3a, способна селективно модифицировать сайт с мутацией m.8993T>G, препятствуя репликации мутантной мтДНК. Следующее поколение mitoZFNs позволило специфично элиминировать мтДНК с мутацией m.8993T>G, однако все еще сохранялась токсичность для клеток [25]. Дальнейшие модификации системы mitoZFNs увеличили специфичность к мутантной мтДНК и снизили токсичность [26]. В частности, авторы исследования интегрировали в генетическую
кассету, кодирующую митохондриально-модифицирован-ные «цинковые пальцы» тетрациклин-зависимый рибо-зим. Добавление в культуру клеток тетрациклина позволило регулировать количество транслируемой мРНК, тем самым сократив время восстановления клеток после каждого раунда трансфекции и сдвига уровня гетероплазмии мутации m.8993T>G. Кроме мутации m.8993T>G система mitoZFNs была использована для сдвига уровня гетероплазмии основной делеции мтДНК [27].
Митохондриальные TAL-эффекторные
нуклеазы (mitoTALENs)
Другим примером использования сайт-специфической нуклеазы являются митохондриальные TAL-эффекторные нуклеазы. Впервые система TALEN [28] была модифицирована для эффективного импорта в митохондрии с целью сдвига уровня гетероплазмии по мутации m.14459G>A и основной делеции [29]. В другом исследовании система mitoTALENs позволила снизить уровень гетероплазмии по мутациям m.8344A>G и m.13513G>A [30]. Разработанный подход был успешно перенесен на мышиные модели, где также удалось изменить соотношение мутантной и дикого типа мтДНК. В той же работе авторы показали принципиальную возможность использования системы mitoTALE для элиминации мутаций m.14459G>A и m.9176T>C в реконструированных яйцеклетках [31]. Уровень гетероплазмии по мутации m.3243A>G был снижен в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК), полученных из фибробластов пациента с болезнью MELAS [32]. В том же исследовании система mitoTALENs была использована для элиминации патогенного мтДНК гаплотипа в искусственно созданной яйцеклетке свиньи путем добавления в нее на стадии метафазы II цитоплазмы клеток ИПСК c m.3243A>G. Были предприняты попытки конструирования mitoTALENs для сдвига уровня гетероплазмии m.8993T>G, однако авторы исследования констатировали факт неудачи, показав невозможность использования системы для этой мутации [26]. В другом оригинальном исследовании удалось уменьшить структуру системы mitoTALENs путем объединения TAL-эффектора и GIY-YIG хоуминг нуклеазы фага T4 [33]. Разработанная система mitoTev-TALE позволила уменьшить количество мутантной мтДНК m.8344A>G на 15-20 %.
Неожиданным применением системы mitoTALENs в отношении к мтДНК стало ее использование для формирования делеций в геноме митохондрий человека [34]. Авторы исследования импортировали в митохондрии клеток человека четыре таких рекомбинантных белка. Два белка связались с одной из цепей в области ND5 и ATP8 генов, тогда как два других в области гена ND4 на расстоянии, позволяющем объединиться двум доменам нуклеазы FokI и вносить одноцепочечный разрыв в мтДНК. Вероятно, мтДНК деградировала в разные стороны от ника до мест связывания с первыми двумя белками, что привело к формированию делеции, имитирующей распространенную у человека основную делецию.
Несмотря на то, что настоящий обзор посвящен технологиям манипуляции уровнем гетероплазмии мтДНК митохондрий человека, отдельно стоит отметить недавний значительный прогресс в работе с модельными животными [35, 36]. Ожидаем, что системы mitoTALEN и mitoZFN в ближайшее время найдут свое применение в практике для лечения митохондриальных заболеваний, ассоциированный с мутациями в мтДНК [37].
RGEN системы, импортируемые в митохондрии
Как было отмечено ранее, двухкомпонентные системы RGENs являются более гибкими технологиями,
поскольку для узнавания последовательности ДНК используют молекулу РНК. С одной стороны — это позволяет в более сжатые сроки модифицировать систему для узнавания новой мутации, так как не требует перекодирования белковой части машинерии для редактирования (в частности, нуклеаза Cas9 всегда остается одинаковой]. С другой стороны, двухкомпонентная система требует сборки в функциональную машину внутри клетки, а в нашем случае, внутри митохондрий. Это значит, что каждый раз в митохондрию должны быть импортированы как белковая часть системы, так и ее РНК часть.
MitoRGEN/SpCas9
Система RGEN/SpCas9 [38] является основным инструментом в редактировании ядерных геномов различных организмов [13, 39]. К настоящему времени существует только одно опубликованное исследование, касающееся функционирования системы RGEN/ SpCas9 внутри митохондрий [40, 41]. Следует однако отметить, что результаты экспериментов по импорту RGEN/SpCas9 противоречивы, а некоторые процедуры, описанные в исследовании, не воспроизводятся [42]. Отсутствие функциональной системы, названной mitoRGEN, подогревается периодическими публикациями о том, почему такой системы до сих пор нет и возможно ли создать ее в принципе [12, 17, 26, 30, 43-49].
Поскольку RGEN/SpCas9 включает два компонента, ну-клеазу SpCas9 и направляющую ее молекулу РНК, оба этих компонента должны быть модифицированы для успешного импорта и сборки функционального комплекса SpCas9-gRNA внутри митохондрий (рис. 2]. К настоящему времени нуклеаза SpCas9 нами была успешно модифицирована (названа mitoSpCas9] для эффективного импорта внутрь митохондрий [42], а плазмидный вектор, кодирующий mitoSpCas9, защищен патентом на изобретение (патент РФ № 2634395, приоритет изобретения от 01.12.2015]. Модификация направляющей нуклеазу mitoSpCas9 молекулы РНК (названная gRNA-HF) также была представлена нами ранее [50]. Остановимся подробнее на дизайне gRNA-HF. Кристаллическая структура комплекса SpCas9-gRNA указывает на отсутствие взаимодействия четырех крайних нуклеотидов в петлях tetraloop и stem loop 2 направляющей РНК с нуклеазой SpCas9 [51]. Этот факт способствовал развитию технологии активации ядерных генов
RNA import
Modified sgRNA
рис. 2. Система mitoRGEN/SpCas9: нуклеаза SpCas9 модифицирована митохондриальным сигнальным пептидом; направляющая ее РНК модифицирована детерминантами импорта РНК в митохондрии (MRP, RP, HD или HD), расположенными вместо структур tetraloop и stem loop 2; PAM — мотив, принадлежащий к протоспейсеру. Из [45] с изм.
с использованием системы RGEN/SpCas9, направляющие РНК которой были модифицированы аптамерами, привлекающими факторы транскрипции [52]. Очевидно, что вместо аптамеров в структуру направляющей РНК могут быть интегрированы любые другие последовательности, формирующие шпилечные структуры. На сегодняшний день известны пять детерминант импорта молекул РНК в митохондрии человека, названные MRP и RP [53], HF и HD [54]. Как и предполагалось, добавление этих детерминант в структуру направляющей РНК не меняет активности всего комплекса [50], а также 5S [55]. Оказалось, однако, что не все детерминанты одинаково эффективно импортируют направляющую РНК внутрь митохондрий. Судя по нашим предварительным данным, лишь детерминанта HF, клонированная вместо tetraloop в структуру направляющей РНК, эффективно импортирует последнюю внутрь митохондрий, где вместе с нуклеазой SpCas9 элиминирует мтДНК. В перспективе необходимо увеличить количество вариантов модифицированных детерминантами импорта молекул направляющих РНК путем комбинаторной перестановки пар известных детерминант. Вероятно, это приведет к более эффективному импорту направляющих РНК в митохондрии.
В предложенном нами варианте система mitoRGEN/ SpCas9 является по своей сути «проверкой концепции» ("proof-of-concept"). В дальнейшем изменение 20 пар оснований в плазмидном векторе, кодирующем gRNA-HF, позволит направлять комплекс SpCas9-gRNA на конкретные патогенные мутации мтДНК. Однако, создавая такие системы стоит быть уверенным в специфичности разрезания именно мутантной мтДНК. В частности, при возникновении мутаций m.3243A>G и m.8993T>G в последовательности мтДНК появляется сочетание NGG, которые выступают в качестве PAM для SpCas9. Установлено, что PAM является критическим для дальнейшего плавления цепи ДНК и формирования гибридного дуплекса РНК-ДНК, а также конформационных изменений нуклеазы SpCas9 [56, 57]. Очевидно, что в таком случае mitoRGEN/SpCas9 должна элиминировать только мутантный гаплотип.
Описанный подход позволяет лишь уменьшать количество копий всего пула мтДНК, либо мтДНК определенного гаплотипа в общем пуле за счет элиминации молекул, в которые был внесен двухцепочечный разрыв. Во многом остаются открытыми вопросы о природе репарации двух-цепочечных разрывов в мтДНК, однако существует мнение, что в отсутствие матрицы такие разрывы губительны для митохондрий, поскольку приводят к элиминации разорванных молекул нуклеазами матрикса [58, 59].
MitoRGEN/AsCpf1
Альтернативой нуклеазе Cas9 в системе CRISPR выступает нуклеаза Cpf1 [60]. Ее особенностью является формирование липких концов после разрыва в отдаленной от PAM последовательности [61]. Как уже было сказано ранее, в терминально дифференцированных клетках после действия на мтДНК нуклеазой рестрикции PstI, оставляющей липкие концы, формировались делеции в мтДНК между сайтами узнавания PstI [21]. Стоит отметить, что два сайта узнавания эндонуклеазой рестрикции, находящиеся между точками начала репликации мтДНК — это скорее исключение, нежели правило. Создать другие де-леции в структуре мтДНК, которые были бы похожи на де-леции, возникающие в клетках человека, представляется маловероятным, используя известные эндонуклеазы рестрикции. Альтернативным решением создания делеций в мтДНК является система mitoTALE, о которой уже было сказано ранее [34]. Но зачем нам нужны линии клеток с запланированными делециями в мтДНК? Начнем с того, что делеции в мтДНК являются одной из основных причин
многих наследственных заболеваний и процесса старения пост-митотических тканей [62]. Клеточные линии от пациентов с делециями могут быть использованы для изучения физиологии дефектных митохондрий и тестирования новых генно-терапевтических препаратов. Далее, имеется ряд сложностей в получении стабильных линий с разными делециями в мтДНК, но одинаковым ядерным геномом. Наличие таких линий позволило бы пролить свет на динамику мтДНК с делециями. Делеции в мтДНК различной длины наблюдаются, например, при болезни Паркинсона в клетках Черной субстанции [63, 64]. Система mitoRGEN/ AsCpf1 как раз и дает нам возможность вносить запланированные делеции в структуру мтДНК (рис. 3). Для этого необходимо доставить внутрь митохондрий помимо нукле-азы AsCpf1 также две направляющих РНК, формирующие в результате двухцепочечных разрывов комплементарные липкие концы. Как и в случае с системой mitoRGEN/ SpCas9, направляющие РНК для AsCpf1 должны быть модифированы детерминантами импорта. Поскольку они имеют более короткую длину и узнают последовательность ДНК как бы «задом наперед», детерминанту импорта стоит интегрировать на 3'-конце гена, кодирующего ее [65]. Далее, по аналогии с эндонуклеазой рестрикции РвЬ\, мы будем наблюдать формирование мтДНК с делецией между выбранными сайтами. Несмотря на то, что мы все равно «привязаны» к PAM в процессе выбора направляющих РНК, существует несколько модификаций нуклеазы AsCpf1, что увеличивает множество вариантов для формирования нужной делеции в мтДНК [66, 67]. Эксперимент по созданию линии клеток с запланированной делецией в общих чертах выглядит следующим образом. Мы выбираем последовательности двух направляющих РНК, которые будут «оставлять после себя» комплементарные липкие концы. Гены, кодирующие такие направляющие РНК с соответствующими детерминантами импорта, а также нуклеаза AsCpf1, интегрируются в iPS клетки. Важно отметить, что активация двух направляющих РНК и нуклеазы AsCpf1 должна быть индуцибельная и не производиться на стадии iPS клеток. Альтернативным вариантом может быть использование специфических промоторов, функционирующих только в дифференцированных клетках. После дифференцировки iPS клеток в терминально дифференцированные клетки (нервные или мышечные), активируется экспрессия нуклеазы и двух направляющих РНК из ядра.
Рис. 3. Система mitoRGEN/AsCpfl: нуклеаза AsCpfl модифицирована митохондриальным сигнальным пептидом; направляющая ее РНК модифицирована детерминантами импорта РНК в митохондрии (MRP, RP, HD или HD), расположенными на 3'-конце молекулы; PAM — мотив, принадлежащий к протоспейсеру. Из [45] с изм.
В полученной линии вероятно будет наблюдаться смесь мтДНК дикого типа и с запланированной делецией, то есть состояние гетероплазмии, характерное для человека в ходе заболевания или естественного старения.
Вариант системы mitoRGEN/AsCpfl с одной молекулой направляющей РНК может быть использован как альтернатива системе mitoRGEN/SpCas9 для сдвига уровня гетероплазмии патогенных мутаций. Нуклеаза AsCpfl нами была успешно модифицирована для эффективного импорта в митохондрии клеток человека [60], а генетическая конструкция, кодирующая mitoAsCpfl защищена патентом на изобретение (патент РФ № 2662994, приоритет изобретения от 14.10.2016).
Системы редактирования оснований mitoRGEN/
SpCas9BE4-GAM и mitoRGEN/SpCas9ABE 7.10
Новейшие системы RGEN/SpCas9-BE4-GAM [15] и RGEN/SpCas9ABE 7.10 [16] являются инженерными конструкциями, позволяющими редактировать основания в молекуле ДНК, исключая стадию двухцепочечного разрыва. Такой подход кажется нам весьма перспективным в отношении исправления патогенных мутаций в геноме митохондрий. Так, конструкция RGEN/SpCas9-BE4-GAM позволяет исправить мутацию C:G на T:A, тогда как конструкция RGEN/SpCas9ABE 7.10 позволяет исправлять более частные замены A:T на G:C. Нами были модифицированы нуклеазы SpCas9-BE4-GAM и SpCas9ABE 7.10 для успешного импорта в митохондрии клеток человека [68], и вместе с модифицированной направляющей РНК gRNA-HF в дальнейшем могут быть использованы для редактирования патогенных мутаций в мтДНК.
Основными ограничениями применения систем SpCas9-BE4-GAM и SpCas9ABE 7.1 0, на наш взгляд, является отсутствие точности в исправлении мутации — редактирование основания ДНК происходит в некотором «окне» узнающей последовательности. Кроме того, описанные системы построены на нуклеазе SpCas9, что накладывает ограничение на выбор редактируемой мутации относительно PAM последовательности. С другой стороны, известны как другие нуклеазы, которые можно было использовать вместо SpCas9 [13], так и технологии изменения узнавания PAM сайта [69, 70].
Заключение
Термином «геномная хирургия» часто называют манипуляции молекулами ДНК с использованием систем RGENs в качестве инструмента, называя сам инструмент при этом «молекулярными ножницами». Несмотря на то, что прямого отношения к хирургии данная процедура не имеет, аналогия кажется вполне разумной. И если дальше развивать эту аналогию, то митохондриальная геномная хирургия — задача далеко не тривиальная.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Spinelli J.B., Haigis M.C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature cell biology 2018; 20(7): 745-54.
2. Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G. et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 1981; 290(5806): 457-65.
3. Hashimoto Y., Ito Y., Niikura T. et al. Mechanisms of neuroprotection by a novel rescue factor humanin from Swedish mutant amyloid precursor protein. Biochemical and biophysical research communications 2001; 283: 460-8.
4. Lee C., Kim K.H., Cohen P. MOTS-c: a novel mitochondrial-derived peptide regulating muscle and fat metabolism. Free Radical Biology and Medicine 2016; 100: 182-7.
5. Mercer T.R., Neph S., Dinger M.E. et al. The human mitochondrial transcriptome. Cell 2011; 146: 645-58.
6. Rackham O., Shearwood A.M.J., Mercer T.R. et al. Long noncoding RNAs are generated from the mitochondrial genome and regulated by nuclear-encoded proteins. RNA 2011; 17(12): 2085-93.
7. Bandiera S., Ruberg S., Girard M., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PloS one 2011; 6(6): e20746.
Представьте операцию на сердце человека — сложная операция, но делается многими. Это аналогия использования систем ПЭЕМ в отношении ядерной ДНК. А теперь представьте операцию на сердце плода в утробе матери. Работа более филигранная — и это аналогия с использованием системы ПЭЕМ в отношении мтДНК.
В настоящее время единственным подходом к предотвращению наследования мутантной мтДНК является процедура цитоплазматической замены [71], которая была успешно проведена в Мексике и опубликованы первые результаты [72]. Однако, как отмечают авторы, после цитоплазматической замены в полученной яйцеклетке наблюдали 5,7 % мутантной мтДНК, а после рождения ребёнка в его тканях 2,36-9,23 °%. Проблема восстановления дефектных митохондрий была известна до этого: 1 5 % линий эмбриональных стволовых клеток человека, полученных из эмбриона после цитоплазматической замены, полностью восстанавливали пул дефектных митохондрий, что значительно превышает 1 %, ожидаемый при генетическом дрейфе [73]. Перенос ядерного материала в яйцеклетку с удаленным ядром совмещен с захватом митохондрий клетки-реципиента ядерного материала и в настоящее время процедуры их удаления не существует. Также не известен механизм восстановления определенной субпопуляции митохондрий в процессе эмбриогенеза [74]. Одним из подходов к преодолению несовершенства технологии цитоплазматической замены, связанной с восстановлением дефектных митохондрий, может быть использование систем т1ШП0Е№, направленных на элиминацию перенесенных вместе с ядерным материалом дефектных мтДНК.
Таким образом в настоящее время системы редактирования митохондриального генома находятся только в самом начале своего развития, однако, не вызывает сомнения, что появление таких систем приведет к значительному прогрессу в терапии митохондриальных заболеваний и пониманию фундаментальных процессов функционирования мтДНК.
Благодарности
Автор благодарен всем сотрудникам лаборатории мо-лекулярно-генетических технологий Института живых систем БФУ им. И. Канта за продуктивную работу в области редактирования генома митохондрий человека, а также К.Е. Орищенко (лаборатория клеточных технологий ИЦИГ СО РАН) за помощь в экспериментальной работе и постоянные обсуждения технологий редактирования и геномной инженерии. Отдельная благодарность сотрудникам отделения эмбриологии Клиники репродуктивной и пренатальной медицины Европейского медицинского центра ЕВ. Юткину и И.В. Володяеву за обсуждение перспектив использования систем ЯБЕМ в процедуре цитоплазматической замены.
8. Gorman G.C., Chinnery P.F., DiMauro S. et al. Mitochondrial diseases. Nat. Rev. Dis. Primers. 2016; 2:16080.
9. Khrapko K., Turnbull D. Mitochondrial DNA mutations in aging. In: Progress in molecular biology and translational science. Academic Press; 2014: 29-62.
10. Zhang D., Keilty D., Zhang Z.F. et al. Mitochondria in oocyte aging: current understanding. Facts, views & vision in ObGyn 2017; 9: 29.
11. Rahman J, Rahman S. Mitochondrial medicine in the omics era. Lancet 2018; 391(10139): 2560-74.
12. Bacman S.R., Pereira C.V. Moraes C.T. Targeted Mitochondrial Genome Elimination. In: Mitochondrial Biology and Experimental Therapeutics. Springer; 2018: 535-63.
13. Komor A.C. Badran A.H. Liu D.R. CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes. Cell 2017; 168: 20-36.
14. Komor A.C., Kim Y.B., Packer M.S. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 2016; 533(7603): 420-4.
15. Komor A.C., Zhao K.T., Packer M.S. et al. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Science advances. 2017; 3(8): eaao4774.
16. Gaudelli N.M., Komor A.C., Rees H.A. et al. Programmable base editing of A-T to G-C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 2017; 551(7681): 464-71.
17. Weber-Lotfi F., Dietrich A. Targeting Therapeutic Nucleic Acids into Mitochondria: A Long Challenge. In: Mitochondrial Biology and Experimental Therapeutics. Springer; 2018: 565-92.
18. Srivastava S., Moraes C.T. Manipulating mitochondrial DNA heteroplas-my by a mitochondrially targeted restriction endonuclease. Human molecular genetics 2001; 10: 3093-9.
19. Moretton A., Morel F., Macao B. et al. Selective mitochondrial DNA degradation following double-strand breaks. PLoS One 2017; 12: e0176795.
20. Srivastava S., Moraes C.T. Double-strand breaks of mouse muscle mtDNA promote large deletions similar to multiple mtDNA deletions in humans. Human molecular genetics 2005; 14: 893-902.
21. Fukui H., Moraes C.T. Mechanisms of formation and accumulation of mitochondrial DNA deletions in aging neurons. Human molecular genetics 2008; 18: 1028-36.
22. Tanaka M., Borgeld H.J. Zhang J. et al. Gene therapy for mitochondrial disease by delivering restriction endonuclease Smal into mitochondria. J. Biomed. Sci. 2002; 9: 534-41.
23. Alexeyev M.F., Venediktova N., Pastukh V. et al. Selective elimination of mutant mitochondrial genomes as therapeutic strategy for the treatment of NARP and MILS syndromes. Gene therapy 2008; 15(7): 516-23.
24. Minczuk M., Papworth M.A., Kolasinska P. et al. Sequence-specific modification of mitochondrial DNA using a chimeric zinc finger methylase. PNAS USA 2006; 103: 19689-94.
25. Minczuk M., Papworth M.A., Miller J.C. et al. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic acids research 2008; 36: 3926-38.
26. Gammage P.A., Gaude E., Van Haute L. et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZF-Ns. Nucleic acids research 2016; 44: 7804-16.
27. Gammage P.A., Rorbach J., Vincent A.I. et al. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO molecular medicine 2014; 6(4): 458-66.
28. Cermak T., Doyle E.L., Christian M. et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic acids research 2011; 39(12): e82.
29. Bacman S.R., Williams S.L., Pinto M. et al. Specific elimination of mutant mitochondrial genomes in patient-derived cells by mitoTALENs. Nature medicine 2013; 19(9): 1111-3.
30. Hashimoto M., Bacman S.R., Peralta S. et al. MitoTALEN: a general approach to reduce mutant mtDNA loads and restore oxidative phosphorylation function in mitochondrial diseases. Mol. Therapy 2015; 23: 1592-9.
31. Reddy P., Ocampo A., Suzuki K. et al. Selective elimination of mitochondrial mutations in the germline by genome editing. Cell 2015; 161: 459-69.
32. Yang Y., Wu H., Kang X. et al. Targeted elimination of mutant mitochondrial DNA in MELAS-iPSCs by mitoTALENs. Protein & cell 2018; 9: 283-97.
33. Pereira C.V., Bacman S.R., Arguello T. et al. MitoTev-TALE: a monomeric DNA editing enzyme to reduce mutant mitochondrial DNA levels. EMBO molecular medicine 2018; doi: 10.15252/emmm.201708084.
34. Campbell J.M., Clemente E.P., Ata H. et al. Engineering targeted deletions in the mitochondrial genome. bioRxiv 287342: doi: https://doi. org/10.1101/287342.
35. Bacman S.R., Kauppila J.H.K., Pereira C.V. et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of hetero-plasmic mtDNA mutation. Nat Med. 2018; 24(11): 1696-700.
36. Gammage P.A., Viscomi C., Simard M.L. et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nat Med. 2018; 24(11): 1691-5.
37. Leslie M. 'Old' genome editors might treat mitochondrial diseases. Science 2018; 361(6409): 1302.
38. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337: 816-21.
39. Jiang F., Doudna J.A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annual review of biophysics 2017; 46: 505-29.
40. Jo A., Ham S., Lee G. et al. Efficient mitochondrial genome editing by CRISPR/Cas9. BioMed research international. 2015: doi: 10.1155/2015/305716.
41. Loutre R., Heckel A.M., Smirnova A. et al. Can Mitochondrial DNA be CRISPRized: Pro and Contra. IUBMB Life. 2018; 70(12): 1233-1239.
42. Орищенко К.Е., Софронова Ю.К., Чупахин Е.Г. и др. Импорт нуклеазы Cas9 в митохондрии. Гены и клетки 2016; 11: 100-5.
43. Bacman S.R., Williams S.L., Pinto M. et al. The use of mitochondria-targeted endonucleases to manipulate mtDNA. In: Methods in enzymology. Academic Press; 2014: 373-97.
44. Patananan A.N., Wu T.H., Chiou P.Y. et al. Modifying the mitochondrial genome. Cell metabolism 2016; 23: 785-96.
45. Craven L., Alston C.L., Taylor R.W. et al. Recent advances in mitochondrial disease. Annual review of genomics and human genetics 2017; 18: 257-75.
46. Gammage P.A., Moraes C.T., Minczuk M. Mitochondrial genome engineering: the revolution may not be CRISPR-ized. Trends in Genetics 2017; S0168-9525(17): 30191-9.
47. Pereira C.V., Moraes C.T. Current strategies towards therapeutic manipulation of mtDNA heteroplasmy. Front Biosci (Landmark Ed.) 2017; 22: 991-1010.
48. Rai P.K., Craven L., Hoogewijs K. et al. Advances in methods for reducing mitochondrial DNA disease by replacing or manipulating the mitochondrial genome. Essays in biochemistry 2018; 62(3): 455-65.
49. Vereshchagina N., Nikitchina N., Yamada Y. et al. Future of human mitochondrial DNA editing technologies. Mitochondrial DNA, Part A. 2018: doi: 10.1080/24701394.2018.1472773.
50. Vereshchagina N., Orishchenko K., Shevtsova A. et al. Modified CRISPR/ Cas9 system shifts down mtDNA copy number. In: Mitochondria in life, death and disease; 2017 Oct 9-13, Brindisi, Italy: doi: 10.13140/RG.2.2.20969.80480.
51. Nishimasu H., Ran F.A., Hsu P.D. et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell 2014; 156: 935-49.
52. Konermann S., Brigham M.D., Trevino A.E. et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 2015; 517: 583-8.
53. Wang G., Shimada E., Nili M. et al. Mitochondria-targeted RNA import. In: Mitochondrial Medicine. Humana Press 2015: 107-16.
54. Dovydenko I., Heckel A.M., Tonin Y. et al. Mitochondrial targeting of recombinant RNA. In: Mitochondrial Medicine. Humana Press 2015: 209-25.
55. Loutre R., Heckel A-M., Jeandard D., et al. Anti-replicative recombinant 5S rRNA molecules can modulate the mtDNA heteroplasmy in a glucose-dependent manner. PLoS ONE. 2018; 13(6): e0199258.
56. Anders C., Niewoehner O., Duerst A. et al. Structural basis of PAM-de-pendent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature 2014; 513: 569-73.
57. Palermo G., Ricci C.G., Fernando A. et al. Protospacer adjacent motif-induced allostery activates CRISPR-Cas9. J. Am. Chem. Soc. 2017; 139: 16028-31.
58. Peeva V., Blei D., Trombly G. et al. Linear mitochondrial DNA is rapidly degraded by components of the replication machinery. Nature communications 2018: doi: 10.1038/s41467-018-04131-w.
59. Nissanka N., Bacman S.R., Plastini M.J. et al. The mitochondrial DNA polymerase gamma degrades linear DNA fragments precluding the formation of deletions. Nature communications 2018: doi: 10.1038/s41467-018-04895-1.
60. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell 2015; 163: 759-71.
61. Yamano T., Nishimasu H., Zetsche B. et al. Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA. Cell 2016; 165: 949-62.
62. Damas J., Samuels D.C., Carneiro J. et al. Mitochondrial DNA rearrangements in health and disease — a comprehensive study. Human mutation 2014; 35: 1-14.
63. Reeve A.K., Krishnan K.J., Elson J.L. et al. Nature of mitochondrial DNA deletions in substantia nigra neurons. Am. J. Human Genetics 2008; 82: 228-35.
64. Nido G.S., Dölle C., Fl0nes I. et al. Ultradeep mapping of neuronal mitochondrial deletions in Parkinson's disease. Neurobiology of aging 2018; 63: 120-7.
65. Nikitchina N., Vereshchagina N., Shebanov N. et al. Modification of RGEN/AsCpf1 elements for import and function inside of the human mitochondrion. In: CRISPR 2018 June 20-23, Vilnius, Lithuania: doi: 10.13140/ RG.2.2.35230.43844.
66. Gao L., Cox D.B., Yan W.X. et al. Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities. Nature biotechnology 2017; 35: 789-92.
67. Nishimasu H., Yamano T., Gao L. et al. Structural basis for the altered PAM recognition by engineered CRISPR-Cpf1. Molecular cell 2017; 67: 139-47.
68. Vereshchagina N., Shebanov N., Nikitchina N. et al. Mitochondria-targeted Cas9-BE4-Gam and Cas9-ABE 7.10 base editing nucleases. In: CRISPR 2018 June 20-23, Vilnius, Lithuania: doi: 10.13140/RG.2.2.14258.91844.
69. Kleinstiver B.P., Prew M.S., Tsai S.Q. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature 2015; 523: 481-5.
70. Kleinstiver B.P., Prew M.S., Tsai S.Q., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature biotechnology 2015; 33: 1293-8.
71. Craven L., Tang M., Gorman G.S. et al. Novel reproductive technologies to prevent mitochondrial disease. Human Reproduction Update 2017; 1-19.
72. Zhang J., Liu H., Luo S. et al. Live birth derived from oocyte spindle transfer to prevent mitochondrial disease. Reproductive biomedicine online 2017; 34: 361-8.
73. Kang E., Wu J., Gutierrez N.M. et al. Mitochondrial replacement in human oocytes carrying pathogenic mitochondrial DNA mutations. Nature 2016; 540: 270-5.
74. Wolf D.P., Hayama T., Mitalipov S. Mitochondrial genome inheritance and replacement in the human germline. The EMBO journal 2017; 36(17): 2659.
Поступила: 11.07.2018
