CC BY
21
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Бароян О.В. Холера Эль-Тор. - М: «Медицина», 1971,- 2. Механизмы и диапазон изменчивости холерных вибрионов. - Ростов н/Д, 1981. - 3. Шагинян И.А., Мара-куша Б.И. // ЖМЭИ. - 1983. - № 7. - С. 92-96. - 4. Balak-rish G.N. et al. II J. Clin. Microbiol. - 2002. - P. 3296-3299. -5. Faruque S.М., Albert М., Mekalanos J.J.//Microbiol. Mol. Rev. - 1998. - Vol. 62. - P. 1301-1314. - 6. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein М., Chang Y. et al. II Infect. Immun. - 1992. - Vol. 60. - P. 472^78. - 7. Hase CiC., Barquera B. // Biochem. Biophys. Acta. - 2001. - Vol. 1505. -P. 169-178. - 8. Hitchcock P.I., Brown T.M.//J. Bacteriol.-1983,- Vol. 154. - P: 269-277. - 9.Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A.K. et al. II FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1998. - Vol. 20. - P. 201-207. - 10. Laemmli U.K. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685. - 11. Rashid M.H. et al. II FEMS Microbiol. Lett. - 2004. - Vol. 230, N 1. - P. 105-113.- 12. Suraia Nusrin et al. II J. Clin. Microbiol. - 2004. -P. 5854-5856. - 13. Yildiz F.H., Schoolnik G.K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. .- Vol. 96. - P. 4028^1033. -
14. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E. et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - Vol. 99. - P. 3129-3134.
N.D.Issayev, Yu.V.Lozovsky, S.P.Zadnova, N.I.Smirnova
Populational Heterogeneity of Natural Vibrio cholerae Strains of Classical Biovariant: Coordinated Changes, in Colony Morphology, Motility, Toxigenicity, : and Enzymatic Characteristics
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov
Analysis of populational composition of 76 natural V. cholerae strains classical biovar, permitted the detection of 20 strains capable of forming typical transparent and atypical opaque colonies. The latter group contained 5 vibrio strains whose morphologic variability correlated with the altered properties of motility and the modified production of exopolysaccharide, cholera toxin and soluble hemagglutinin/protease.
Поступила 18.03.05
УДК 616.932(571)
К.С.Нефедов, А.В.Осин, Н.И.Смирнова
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ПАНДЕМИЧЕСКИХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ БИОВАРА ЭЛЬТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ НА ТЕРРИТОРИИ ЮГО-ВОСТОЧНОЙ АЗИИ
5- ' ' ' „ ) I
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов \
Посредством ПЦР-тестирования 20 генов, входящих в состав мобильных генетических элементов (профаги СТХф и КБ 1 (р, острова патогешгости УР1-1 и УР1-2, острова пандемичности УБР-1 и У8Р-2, остров персистен-ции), а также коровой части хромосомы (ЬарА, юхЯ, пхА, а»/?5), получены генные «портреты» 62 штаммов, выделенных из различных источников на территории Юго-Восточной Азии. 70 % клинических штаммов характеризуются высоким уровнем стабильного наследования генов вирулентности, 8,7 % были лишены профага СТХ, либо его гена с1хА. Вирулентных штаммов, утративших лишь ген 1срА, было 3,5 %. Нестабильность'других МГЭ с генами вирулентности колебалось от 1,0% (для Я81ф) до 12,3 % (для У8Р-1). В целом клинические штаммы, выделенные на территории разных стран, в 30 % случаев лишены какого-либо из тестируемых генов, связанных с вирулентностью. Эти данные свидетельствуют о том, что популяция штаммов, выделенная от инфицированных людей, генетически неоднородна.
Введение
Изучение закономерностей эволюционных преобразований возбудителя холеры эльтор свидетельствует о том, что в их основе лежит горизонтальный перенос чужеродных генных блоков, размещенных на мобильных генетических элементах или МГЭ (профагах, островах пандемичности, пер-систенции), полученных этим патогеном от неизвестных доноров [5]. Внедрение указанных блоков генов в коровую часть обеих хромосом обеспечило появление вирулентных клонов не только с пандемическим потенциалом, но и наделенных способностью выживать как в инфицированном макроорганизме, так и в окружающей внешней среде. Более того, присутствие на малой хромосоме интег-ронного острова позволяет, по-видимому, этому возбудителю захватывать полезные для себя гены с помощью описанных ранее генетических механизмов [8].
Высокий уровень пластичности генома возбудителя 7-й пандемии холеры, обусловленный наличием в нем разных по структуре и функции МГЭ,
определяет генетическое разнообразие генома,этого патогенного микроба. Однако, несмотря на принятые в последнее время меры по расширению, исследований в этом направлении [3], пока отсутствует полная информация о геномных вариациях этого патогена, которая весьма необходима как для адекватного мониторинга за этим патогеном с целью усовершенствования эпидемиологического надзора за особо опасными инфекциями, так и для совершенствования диагностикумов и вакцин.
Поскольку вторжение холеры эльтор во многие государства началось с азиатского континента, мы сочли необходимым провести анализ геномных вариаций V. ско1егае, выделенных на территории Юго-Восточной Азии, тем более, что многие страны из этого региона являются пограничными с Территорией России.
Цель работы - оценить уровень генетического разнообразия штаммов V. с1го1егае биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Юго-Восточной Азии, с помощью ПЦР-тестирования 20 различных генов, входящих в состав МГЭ и коровой части хромосом.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В работе использовано 62 штамма V. с hole гае биовара эльтор, выделенных от больных людей и из объектов внешней среды в период 1950-1993 гг. на территории Югог Восточной Азии (Государственная коллекция патогенных бактерий Российского научно-исследова-тельского противочумного института «Микроб», Саратов).
Из всего указанного количества штаммов 57 были клиническими изолятами, которые выделены в разные периоды 7-й пандемии холеры (1962-1969, 1973 и 1993 гг.). Кроме того, было исследовано 5 штаммов, изолированных из воды открытых водоемов. Культивирование штаммов проводили на LB-агаре (pH 7,2) на протяжении 18 ч при 37 °С в аэробных условиях.
ПЦР проводили в микропробирках объемом 600 мкл на программируемом термостате «Терцик». Препараты тотальной ДНК получали кипячением на водяной бане взвеси 10 м.к./мл в дистиллированной воде в течение 30 мин и после центрифугирования при 1000 об/мин использовали для реакции амплификации, которая проводилась согласно описанным ранее условиям. Выявление фрагментов 20 различных генов в хромосомах изучаемых штаммов осу-щёствляли с использованием олйгонуклеотидных праймеров, описанных ранее [4]. Праймеры синтезировали в НПФ «Литех» (Россия) на автоматическом синтезаторе ДНК «ACM-102U». Продукты ПЦР фракционировали в 2 % агарозном геле (Bio-Rad) и регистрировали в ультрафиолетовом свете. О наличии в геноме штаммов различных МГЭ судили на основе ПЦР-тестирования генов, входящих в их состав: ctxA, zot и асе, включенных в коровую область генома профага СТХ; rstC, локализованного в профаге RSI; aldA, тор, tcpA, toxT и hell760, rianH, rep1803, расположенных в центральных и краевых фрагментах, соответственно VPI-1 и VPI-2; deo0175, tnp0183 и рго0490, рго0496 - генов краевых фрагментов, соответственно VSP-1 и VSP-2.
Результаты и обсуждение
В отличие от других инфекционных болезней, которым не свойственны географические границы, холера! отличается своей локализацией и даже стабильностью на азиатском континенте, в частности, в его индо-пакистанском очаге. Тем не менее начиная с 1961 г. холера эльтор начала свое вторжение в другие страны из Индонезии, на территории которой до этого периода регистрировались имеющие ограниченный характер небольшие эпидемии и вспышки этой болезни [1, 6]. Продолжая свое продвижение на запад, холера прежде всего проникает в страны Юго-Восточной Азии - Индокитай, Филиппины, Пакистан, Иран, Афганистан, Ирак, Индию.
Отсутствие к настоящему времени полных сведений об особенностях структуры генома возбудителя холеры эльтор, циркулирующих на указанных территориях, побудили нас получить генные «портреты» имеющихся в нашем распоряжении 62 штаммов, выделенных от больных и из воды открытых"
водоемов в эпидемически опасный период.
В результате ПЦР-тестирования 4 клинических штаммов, выделенных на территории Филиппин (1961 г.) лишь два штамма (34 Филип, и М-538) имели в геноме все тестируемые гены вирулентно-. ста (табл. 1). В то же время у 2 штаммов (31 и М-537) присутствовал дефектный профаг СТХф, лишенный гена гої, одного из трех токсинов, входящих в его состав (рисунок, дорожки 5, 9). Кроме того, в геноме одного из этих штаммов (31) содержался неполноценный ОП УРІ-2, утративший ген папН, а также отсутствовал ген коровой части хромосомы ПхА, входящий в оперон генов, кодирующих ИТХ-токсин (табл. 1). Характерной особенностью клинических штаммов, выделенных в 1962— 1993 гг. в Индокитае, было отсутствие у 31,5% штаммов (у 6 из 19 изученных) гена коровой части хромосомы ііхА, принимающего участие в биосинтезе дополнительного фактора патогенности токсина КТХ. Кроме того, 2 штамма (В-1728 и 317) имели неполноценный ОП УРІ-2, лишенный гена папН, а 1 штамм (128/64) был нетоксигенный, поскольку нес неполноценный профаг СТХср, лишенный генов сІхА и асе (табл. 1; рисунок, дорожка 8). В то же время 68,5 % штаммов содержали все выявляемые гены. Клинические изоляты 1964-1967 гг., циркулировавшие среди больных в Пакистане, также были генетически не однородны. Из 6 проверенных 1 штамм (ПК-10-20СВ) утратил все три гена сіхАВ, асе, юг, кодирующие продукцию токсинов из прог фага СТХф, а второй (5/66) — утратил профаг ЯБІф, острова пандемичности У5>Р-1 и УБР-2 и сохранил лишь дефектный ОП УРІ-1 без генов ісрА, кодирующих основную субъединицу токсин-корегули-руемых пилей, основного фактора колонизации. Также характерная черта, свойственная штаммам из Индокитая; отмечалась у клинических штаммов, выделенных на территории Ирака (1966 г.) и Ирана (1965 г.) - у 37,7 % изученных штаммов (у 3 из 8 тестированных) в коровой области хромосомы отсутствовали гены токсина КТХ. К тому же 1 штамм (5/65) был лишен полноценного профага СТХф, а у другого штамма (12) в хромосоме присутствовал неполноценный ОП УРІ-2 без гена папН (табл. 1).
8 !) 10 U 12
•zot (947 п.п.)
tcpA (471 іі.н.)
ctxA (564 пл) * аст (289 п.н.)
Определение присутствия генов ctxA, асе, zot и tcpA с помощью мультиплексной ПЦР в геноме штаммов V. cholerae биовара эльтор:
1 - маркер молекулярных масс GeneRulerTMSObp DNA Ladder;
2 - М-308; 3 - М-309; 4 - 34-Каюм; 5 - 31; б - 6/67; 7 - М-657;
8 - 128/64; 9 - М-537; 10 - контаминационный контроль (реакционная смесь без ДНК-матрицы); 11 - положительный контроль (V. cholerae биовара эльтор 28 Афг.); 12 - маркер молекулярных масс GeneRuIerTM50bp DNA Ladder
• ' Таблица /
Результаты изучения геномов пандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных на территории Юго-Восточной Азии, с использованием моно- и мультилокусной ПЦР.со специфическими праймерами
Штамм Год вы- СТХф RSlíp VPI-1 VPI-2 VSP-I VSP-2 ЕРІ attRS toxR rtxA hap /
деления ctxA асе zot rstC tcpA toxT aid A mop hell760 папН гер1803 deo0175 tnpOl85 рго0490 рго0496 rnshA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
31 1961 + + + + + + Клинические штаммы Филиппины + + - + + + *К + + + + +
34 Филип. 1961 + + . + + + * + ' + + + + + + + + + + + + + +
М-537 1961 + + - + + + + ' ‘ + + + + + + + + + ’ + + + +
М-538 1961 ‘ + + + + + ‘ + + + + + + .+ + + + + + + +
В-1654 1962 + + + ' + + + + Индокитай + + ' + + + + + . + + + + +
В-1728 1962 + + + + + + + ' + + . + + + + + + + + - +
Malacca 1 1963 > + + + + + + + + + + + + - + + + + + + +
Malacca 2 1963 + + + + + + + + + + + + ’ + + + + + + + +
Malacca 3 . 1963 і. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
І/64к 1964 + + + + + + + + + + + + + + + + + + ' + +
119/64 1964 . + + + • + + + .+ ’ + + + + + + + + + + + +
128/64 1964 - - + + + + + . + + + + + .+ + + + + + +
8/65 1965 + + + + + „ + + + + + + + + + + + + + і +
ID/З 1968' + + + + + + + + V + + + + + + + + + • + +
22/Зк 1968 + + + + + -f + ' + + + + + + + + + + - +
v.c.o.3035 1981 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
v.c.o.3561 1981 + + + + + +' + + + • + + + + + + . + + + + ; ) +
V.с.O.3603 1981 + + + + + + + + + + + + + + + + . + / .. + +
v.c.o.3609 1981 + + + + + , + + + + + + ' + + + + + + + + +
v.c.o.3670 1981 + , + -І- ' +. + + + + + + + + + + + + + + і + +
ЗП 1993 + + + + + + + + + + + ' + + + + + + + .: + +
317 1993 + + + + + - + + + + - + + + + + + + + Iі +
370 1993 + + + .+ + + + + + + + + + + + + + +1 +.
28 Афг. 1965 + ' + + + + + ' + + Афганистан + . + + + + + + + + + і ' +. +
М-308 1965; + + + + + + + ч- ■ -ъ + + + + + + + + + +
М-309 1965 ' +’ + + + + + + +, + . + + + + + + + + , + +.
34 Каюм 1966 - - + + + + + + + + - - - + + + + +
4/64 1964 + + + + + + + + Пакистан . + + . + + + + + + + + + +
П/64 1964 + + , + + + + + + + + + + + + + + + + t+; +
5/66 1966 + + + - +. + + + + + _ - - - + + + + . +
15/66 Korat 1966 + + + • + + + + + + + + + + + + + + + + +
М-656 1969 + + + + + , + + + + + + + + + + + + +
ПК-10-20СВ 1973 - - - + + + + + + + + + + + + + + + + +
5/65 1965 + + + + + + Иран + + + + + + + + + + + +
12 1966 + + ■ + + . + + + Ирак + + + + + + + + + +
32 1966 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
406 1966 + + + + + + + + + + + + + + + + + +. + +
606 1966 + + + . + + + + + + + + + + + + + + - +
632 1966 + + - + + + + + + + + + + + . + + + + + - +
774 1966 + + + + + + + + + + + і * + + „ + + + + + + +
819 1966 + + + + + + + + + + + ’ + + + + + + + !+ +
1/67 1967 + + + + + + + + Индия + + + ' + + + + + + . + + +
6/67 1967 ■ - + + - + + + +- + + + - - - + - + + +
9/67 1967 + + + . + + + + + + + + + + + + + + + :+ +
13/67 1967 + + + + + + + + + + + + + + . + + + + + +
14/67 ■ 1967 + + + + + + +. + + .+ + + + + + + ,+ + + +
М-657 1967 - - - + + + + + + + + + + + + + “ + + + +
673/67 1967 + + + + + + + + + + + + . + + + + + + + * +,
179/67 Ш 1967 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Продолжение таблицы 1
4 . ' 5 6
10 И 12 13
14
15' 16 17 18 19 20 21 22
173 CRC [ 1967 + + + + + + + + + + + + + " + + + + + + +
158/67 ; 1967 + + +. . ■ + + + . + . + + + ■+ + + +; + + + + + +
CRC 579/67 i 1967 + + - + + -+ + + - + + + + - - + - -+ + * ' + ■ + - + + +
CR С 1025/67 1967 + + + + + + + + + + + + + . + + + + + + +
CRC 582/67 . 1967 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
CRC ШН 1 583/67 1967 + + + + + + + + + • + ,+ + + + + + + + + +
CRC 1DH , 587/67 1967 + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
CRC ШН 641/67 1967 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
CRC IDH М-118 1950 Штаммы, выделенные из внешней среды в эпидемически безопасный период (Туркмения, Индия) + + + +
34-Д-13 1952 + + + - +
34-Д-18 1952 + • + + +
CW-6 1966 + + Штаммы, выделенные из внешней среды в эпидемически опасный период (Индия) + -- + + + + + + - + - _ + + +
МЕ-7 1966 + + + - + + + + + + - -- - - + + + + +
И, наконец, был получен ответ о генетических особенностях 16 клинических штаммов, выделенных в Индии в 1967 г. Оказалось, что значительная их часть (14 из 16 изученных, что составляет 87,5 %) содержала все изученные гены вирулентности, входящие как в состав МГЭ, так и в коровую часть хромосомы. Тем не менее и в этом эндемичном по холере очаге было изолировано 2 штамма, утратившие либо' все гены профага СТХср (ctxA-, асе", zof; штамм М-657) (рисунок, дорожка 7), либо гены лишь ctxA (ctxA”, асе+, zot+; штамм 6/67) (рисунок, дорожка 6). При этом последний был лишен профага' RSI (rstCT), островов панде-мичности VSP-1 и VSP-2, а также нуклеотидной последовательности attRS l - сайта для внедрения фага СТХф в хромосому.
Анализ проведенных данных указывает, что независимо от географического источника выделения для штаммов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных во время эпидемии холеры с. 1962 по 1993 год в различных странах Юго-Восточной Азии и проверенных с помощью, ПЦР на присутствие (или отсутствие) в их геноме фрагментов 20 различных генов, характерен высокий уровень стабильного наследования генов вирулентности (40 штаммов из 57 проверенных, что составляет 70 %), входящих в состав как МГЭ, так и коровой части хромосомы. Тем не менее эти данные отличаются от ранее полученных нами результатов ПЦР-аналйза 21 клинического штамма, изолированного на территории России .(Поволжье) и Туркменистана, согласно которым они представлены генетически однородной популяцией на основе тестирования 12 различных генов. Выявленные различия, возможно, связаны с отсутствием более глубокого анализа их генома, который приведен в настоящей работе.
Полученные данные о генетическом разнообразии клинических штаммов, циркулирующих во вре-
мя 7-й пандемии холеры на территории Филиппин, Индокитая, Афганистана, Ирака, Ирана, Пакистана и Индии за период с 1962 по 1993 год, могут быть отражением как неодинаковых экологических условий их обитания, так и продолжающейся эволюции их генома. В этой связи, по-видимому, важно выявить уровень стабильности наследования каждого МГЭ с генами вирулентности, поскольку это свойство может оказать влияние на развитие патологических и пандемических процессов при холере (табл. 2), Согласно представленным сведениям 100 % стабильность наследования характерна для хромосомного гена ИарА - видоспецифического гена [7], гена гпбЬА - генетического маркера древнейшего острова персистенции, который необходим вибрионам для выживания во внешней среде. Что касается генов вирулентности, входящих в состав МГЭ, то следует отметить некоторую их нестабильность, хотя ее уровень :не велик.
В первую очередь оценим стабильность наследования : основных генов вирулентности - с?х4 и гсрА, входящих в состав профага СТХ или ОП УР1-1. Оказалось, что среди 57 клинических изоля-тов 5 штаммов, что составило 8,7 %, были нетокси-генными в результате утраты либо профага СТХ, либо его генов ахА. Токсигенных штаммов, утративших лишь ген гсрА, свойственных эльтор вибрионам, было 3,5 %.
Одним из основных- вопросов, на который до сих пор нет исчерпывающего ответа, остается вопрос о том, каким образом нетоксигенные штаммы либо штаммы, не имеющие основного фактора колонизации, могли вызвать у инфицированного человека холеру? Одно из возможных предположений СОСТОЩ1 в том, что при отсутствии генов ахА либр начинается эффективная экспрессия других пока неизвестных генов патогенности, которые также вызывают развитие инфекционного процесса.
Результаты анализа генетического разнообразия клинических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных во время седьмой пандемии холеры на территории Юго-Восточной Азии
Таблица 2
Гены Мобильные генетические элементы (МГЭ) Кол-во штаммов с указанным набої dom генов вирулентности
40 3 5 1 2 1 1 1 1 1 1
ctxA + + + _ _ + + + _ +
ace СТХср + + + - - + •+ + + - -
zot + + + - - + - - + + -
rstC RSIcp + + + + + .. - + + - + +
tcpA + + + + + - + + + + +
toxT + + + + + + + + + + +
aldA VP1-1 + + " + + + + + + + + +
mop + + + ■ + + + + + + + +
hell 760 + + + + + + + + + + +
nanH VPI-2 - • + - + - + . * + , + - + . + + +
rep 1803 + + + + + + + + + + +
deoOI75 VSP-1 . + + + - + - + + - + +
tnpO 185 + + + — + - + + - + . +
pro0490 VSP-2 + ■+ + - + - + + - + +
pro0496 + + + + - + + - + +
mshA EPI + + + + + + + + + + +
attRS + + ! + •+ + . + . + + • _ + +
toxR + • + . • ’ + .+ + + ■ + + + + +
rtxA + ; - і - + ■+ ■ ■ - + + - +
hapA : ‘ ■ + , + + + + + + + . + + ’■ +
. % штаммов от общего числа ' 70,2' 5,25 00 оо 1,75 3,5 г 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 .1,75
Нестабильность других МГЭ с генами вирулентности колебалась от 1,0 (для ЬШср) до 12,3 % (для У8Р-1). Отсутствие 100 % стабилизации в хромосоме, в частности, островов пандемичности У8Р-1 и У8Р-2 может быть указанием на то, что эти МГЭ с эволюционной точки зрения могут рассматриваться как самые «молодые», что согласуется и с другими данными [9].
В целом клинические штаммы, выделенные на территории разных стран, в 30 % случаев лишены каких (какого)-либо тестируемых генов, связанных с вирулентностью. Эти данные свидетельствуют о том, что и популяция штаммов, выделенная от инфицированных людей, неоднородна (табл. 1, 2).
Каковы же особенности генома штаммов, выделенных в эпидемически опасный период из окружающей внешней среды? В нашем распоряжении оказались только 2 штамма - С\У-6 и МЕ-7, изолированные в Индии. Пребывание их в воде открытых водоемов отразилось, видимо, на структуре генома. Оставаясь токсигенными, оба штамма утратили профаг 1 (шС~), острова пандемичности У8Р-1 и
У8Р-2. Кроме того, С\¥-6 имел дефектный ОП УР1-1, лишенный гена ¡срА, а МЕ-7 - неполноценный ОП УР1-2, утративший его дистальную часть, обозначенную как гер1803 (табл. 1).
Следует отметить, что до начала эпидемий в Индии и Туркмении из воды открытых водоемов были выделены авирулентные штаммы М-118, 34-0-13 и 34-0-18, сохранившие в геноме лишь гены коровой части хромосомы - аПИБ, ГохЯ, кар А, а также пхА лишь у штамма М118, что согласуется с
ранее полученными данными [2]. Кроме того, у всех штаммов присутствовал остров персистенции, так как у них был выявлен фрагмент гена mshA (табл. 1).
Полученные данные о генных «портретах» 62 штаммов, по-видимому, будут служить в качестве фундамента для будущих исследований по созданию баз данных о молекулярно-генетических свойствах как отечественных, так и зарубежных штаммов. Эти знания могут быть использованы для мониторинга за возбудителем холеры в целях усовершенствования эпидемиологического надзора':
Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-1531.2003.4) и гранта РФФИ № 03-04-48438.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. - М., 1971. - 256 с. -
2. Костромитина Е.А. Молекулярно-генетические'свойства штаммов холерного вибриона Эль-Тор с различной эпидемической значимостью: Дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 2004. -161 с. - 3. Монахова Е.В., Писанов Р.В. // Мол. генет. -2005. - №1,- С. 7-18. - 4. Осин A.B., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. // Генетика. - 2005. т Т. 41, № 1. - С. 1-10. - 5. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. // Мол. генет. - 2004. - № 4. - С. 3-13. - 6. Тудор В., ртрати И. Оспа. Холера. - 1981. - 360 с. - 7. Челдышева H.!Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae 01 с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA: Дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 2002.- 173 с. - 8.Heidelberg J.F., Eisen J.A.,:Nelson W.C. et al. II Nature. - 2000. - Vol. 406. - P. 477-483. -9.0’Shea Y.A., Reen F. J., Quirke A.M., Boyd E.F.// I. Clin. Microbiol. - 2004. - P. 4657^671. '
Asia. Seventy percent of the clinical strains were characterized by high stability levels of .virulence genes inheritance, 8.7 % were deprived either of the CTX' prophage, or of its ctxA gene. Virulence genes lacking only tçpA gene formed a portion of 3.5 percent. Instability of other MGE containing virulence genes ranged from 1.0 % (for RStp) to 12.3 (for VSP-1). As a whole, 30 % of the clinical strains isolated’ in the territories of different countries, were lacking one or another of the tested virulence associated genes. These results may be indicative of significant genetical heterogeneity present within the population of V. cholerae strains isolated from infected patients.
; . . Поступила 22.03.05
Т.М.Тараненко, С.М.Дальвадянц, М.Н.Киреев, Н.П.Гусева, В.А.Федорова, З.Л.Девдариани
ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ОСНОВНОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ЧУМНОГО МИКРОБА
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Представлены современные данные о структурной организации, химической природе и иммунобиологических свойствах основного соматического антигена (ОСА) Yersinia pestis, извлекаемого из .клеток экстракцией по Буавену. Будучи серологически активным гликопротеиновым комплексом, ОСА является носителем общей специфичности у родственных чумных и псевдотуберкулезных иерсиний, находящихся в R-форме диссоциации, участвует в инициации иммунного ответа по клеточному типу и входит в состав химической (Ф1+ОСА) чумной вакцины. Предполагается, что ОСА с характерной для, него структурой циклического гетерогликана представляет собой заменяющий О-специфический полисахарид энтеробактериальный общий антиген, не соединенный с «коровой» частью липополисахарида.
Одним из перспективных направлений в области специфической профилактики чумы является создание препаратов нового типа - бесклеточных вакцин на основе очищенных специфических про-тективных антигенов, лишенных балластных веществ и исключающих нежелательные побочные явления. Конструирование ' чумных химических вакцин антигенного уровня по сути только еще начинается. И хотя в литературе охарактеризовано уже значительное количество антигенов чумного микроба, определены их генетическая детерминированность, молекулярная организация и фармако-биологическая активность [2, 27, 32, 46, 49, 53], в отечественной практике по созданию химической чумной вакцины пока реально используются два антигенных компонента - главный иммуноген, видоспецифический белковый капсульный антиген чумного микроба Ф1 и так называемый основной соматический антиген - комплексный гликопротеи-новый препарат, играющий определенную роль в индукции иммунных реакций при противочумной иммунизации [19, 35].
Указанный углевод содержащий комплексный антиген, извлекаемый из чумного микроба классическим методом Буавена путем экстракции клеток при 4 °С трихлоруксусной кислотой (ТХУ), впервые был назван основным соматическим антигеном (ОСА) в 1966 г. в работе А.АЛопова й В.В.Акимовича, поскольку1 он давал в реакции диффузионной преципитации с гипериммунной лошадиной сывороткой и ее эвглобулином широкую, массивную зону, примыкающую к резервуару с антителами [36].
Невозможность выделения классическим методом Буавена из S- и R-форм чумного микроба полного антигена с эндотоксической активностью еще ранее показали G. Girard [50] и Е.И.Коробкова [31].
Впервые удалось выделить этим методом и охарак-
теризовать по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам препарат Буавена из штаммов, У. резШ, утративших рБга, С.М.Дальвадянцу - из штамма 358/12Р-ІІІ [17] и Е.Э.Бахрах и В.И.Вейн-блату - из ЕУ-2 [6]. Позднее подобный антигенный препарат был выделен и из типичных вакцинных штаммов ЕУ и 17 [7]. Полученный препарат по своей химической структуре и фармако-биологической активности не был идентичен типичному комплексному О-соматическому антигену Б-форм грамотри-цательных бактерий с характерной для него химической структурой и наличием эндотоксической активности. В отличие от типичного ЛПС ОСА оказался совершенно не токсичен для белых мышей и морских свинок [5].
Обычно ОСА выделяют из нативной культуры чумного микроба, выращенной в течение 48 ч при 28 °С на агаре Хоттингера. После двукратного экстрагирования ТХУ при 4 °С из объединенного диализованного экстракта препарат получают в сухом виде путем лиофилизации или осаждения ацетоном [8]. Полученный таким способом ОСА имеет стандартные характеристики. Он хорошо растворим в воде и. солевых растворах, термостабилен и серологически гомогенен [3, 45].
Проведенный на первых порах анализ общего химического состава ОСА показал, что по своей химической природе , он представляет собой глико-протеиновый комплекс [3, 17]. Более тщательный анализ ОСА и особенно, его моносахаридного состава установи, что препарат не содержит липида Айв нем отсутствуют сахара, характерные для оли-госахаридного остова, так называемой «коровой» части ЛПС - альдогептоза и КДО. При этом были идентифицированы гексозы и пентозы такие как галактоза, глюкоза, манноза, ксилоза, рибоза, фуко-за и глюкозамин [42].
I K.S.Nefeodov, A.V.Ossin, N.l.Smimova
Genetic Diversity of Pandemic Vibrio cholerae Biovariant ¡El Tor Strains Isolated from Different Objects i • j in the Territory of South-East Asia
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov
The method of PCR testing of 20 genes involved in mobile genetical elements (CTXcp and RSlcp prophages, pathogenicity islahdsVPI-1 and VPI-2, pandemicity islands VSP-1 and VS.P-2, the persistence island), as well as the core region of the chromosome (hapA, toxR, attRS ) was applied to make genetic “portraits’’ for 62 strains isolated from various-sources in South-East
УДК 616.981.452:576.809.7
