CC BY
32
МИКРОБИОЛОГИЯ
Кроме того, рекомбинантные культуры синтезируют только протективный компонент токсина. Это делает возможным получение высоко очищенного продукта без реактогенных примесей отечного и летального факторов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Barnard J., Friedlander A. // Infect. Immun. -1999.-Vol. 67.-P. 562-567.-2. Cohen S., Mendelson L., Altbouml Z. et al. II Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, N 8. -p. 4549^558. - 3.Coulson N.. Fulop M., Titball R. // Vaccine. - 1994. - Vol. 12. - P. 1395-1401. - 4. Farchaus J., Ribot Wl, Jendrek S. et al. H J. Applied Microbiol. - 1998. -Vol. 64. -i P. 982-991. - 5. Ivins B., Welkos S. // Infect. Immun. - 1986.- Vol. 54, N2. - P. 537-542. - 6. Vodkin M., Leppla S. // Cell. - 1983. - Vol. 34. - P. 693-697.
O.M.Kudryavtseva, N.I.Mikshis, L.V.Novikova, M.F.Bolotnikova, D.V.Shulepov, Yu.A.Popov
Selection of Stabile and Efficient Recombinant Strains
Overproducing Bacillus anthracls Protective Antigen
Russian Anti-Plague Research Institue «Microbe», Saratov
Stability of inheritance of genetic information was studied in vivo and in vitro in recombinant bacillary strains containing cloned pag gene determining the synthesis of the anthrax pathogen protective antigen. Stable clones were selected among the transformants that were capable of producing higher levels of the biologically important antigen as compared to those determined for the original vaccine strains. The bacillary overproducing strains were shown to synthesize only the protective component of Bacillus anthracis toxin being avirulent due to the absence of pXOl and pX02 replicons.
Key words: Bacillus anthracis, anthrax agent protective antigen, gene-engineering strains overproducing protective antigens.
Поступила 17.07.05.
УДК 616.932:575:546.212
Т.А.Кулыпань, А.В.Топорков, Н.И.Смирнова
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ БИОВАРА ЭЛЫОР ПРИ ИХ ОБИТАНИИ В ВОДНОЙ СРЕДЕ
I Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
I
1
| В результате экспериментального моделирования установлено, что при попадании из организма хозяина в водную среду геном эпидемически опасных штаммов может утрачивать профаг СТХ или ряд генов его коровой области при сохранении других мобильных генетических элементов, несущих гены вирулентности, пандемичности и персистенции. Показано, что потеря токсигенных свойств не сопровождается изменением гемолитической активности штаммов, одного из основных фенотипических маркеров возбудителя текущей 7-й пандемии холеры. Представленные данные свидетельствуют в пользу предположения, что штаммы с1хА 1срА+, нередко выделяемые в природных популяциях, появляются в результате адаптивного изменения генома вирулентных штаммов, получивших ранее в процессе эволюции весь необходимый набор чужеродных генных блоков патогенности.
I Ключевые слова: возбудитель холеры эльтор, экспериментальное моделирование, реорганизация генома, профаг СТХ, гемолитическая активность.
Напряженная эпидемиологическая ситуация по холере в Российской Федерации обусловлена постоянной опасностью завоза этой инфекции из эндемичных очагов, локализованных на территории Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки, в ¡связи с огромными по масштабу международными миграционными процессами населения [5(]. Возбудитель холеры имеет в геноме приобретенные в процессе эволюции мобильные генетические элементы (МГЭ) с генами вирулентности, персистенции и пандемичности (профаги СТХ, RS1; острова патогенности VPI-1 и VPI-2; острова пандемичности VSP-1 и VSP-2; остров персистенции в окружающей среде EPI), удачная комбинация которых обеспечивает возможность его пребывания в двух разных экологических нишах - в организме хозяина с развитием инфекционного процесса и в водной экосистеме [9, 17]. Для существования в разных условиях окружающей среды холерные вибрионы используют две основные стратегии выживания - переход вегетативных форм в | некультивируемое состояние (НС) и/или формирование биопленки [3, 10, 11, 14, 15]. Вместе
с тем, при попадании вирулентных клонов из организма хозяина в водную среду модульная организация их генома может, видимо, обусловить его реорганизацию, выражающуюся в потере ряда МГЭ, несущественных для выживания в новых условиях. Основанием для такого предположения служат сведения о выделении из внешней среды нетоксигенных вибрионов, сохранивших острова патогенности, пандемичности и персистенции, но утративших профаг СТХ, содержащий гены сгхАВ, го1, асе, кодирующие, соответственно, биосинтез термолабильного холерного токсина - основного фактора патогенности, а также двух дополнительных токсинов и Асе [12, 17]. В то же время нельзя исключить, что указанные выше нетокси-генные штаммы никогда не приобретали профаг в процессе эволюции. Для того чтобы сделать выбор между двумя гипотезами о происхождении таких нетоксигенных штаммов были проведены исследования, направленные на выявление и анализ генетических и фенотипических изменений вирулентных штаммов после пребывания их в водной среде.
Материалы и методы
В работе использовали 10 штаммов Vibrio cho-lerae биовара эльтор, выделенных в эпидемически опасный период (1970-1975 гг.) на территории Астраханской области (табл. 1). Штаммы хранились в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (Саратов) в лиофилизированном состоянии.
Таблица 1
Использованные в работе штаммы холерного вибриона биовара эльтор, выделенные на территории Астраханской области в эпидемически неблагоприятный период
Штамм Серовар Год выделения Источник выделения Потребность в факторах роста на голодной среде
М887 Инаба 1970 Больной Прототроф
М888 Инаба 1970 Больной Прототроф
М892 Инаба 1970 Больной Прототроф
М893 Иваба 1970 Больной Прототроф
М943 Инаба 1970 Больной Прототроф
М641 Инаба 1975 Вибрионоситель Прототроф
Р3644 Инаба 1970 Вода Pur'
Р3646 Инаба 1970 Вода Прототроф
М961 Инаба 1972 Вода Прототроф
М962 Инаба 1972 Вода Прототроф
Определено авторами.
Для изучения генетической и фенотипической изменчивости холерных вибрионов в водной среде из агаровой культуры каждого вирулентного штамма готовили 1 млрд/мл взвесь, по 0,5 мл которой помещали затем в 50 мл автоклавированной речной воды, физиологического раствора и дистиллированной воды. Пробы с речной водой и физиологическим раствором хранили при комнатной температуре (18-20 °С) и в условиях холодильника (4 °С), с дистиллированной водой - при 18-20 °С. Высевы на агаровые среды до получения изолированных колоний производили по 0,1 мл каждые четыре дня.
Продукцию растворимой гемагглютинин/про-теазы (ГА/П) выявляли путем посева культур на агар, содержащий 10 % обезжиренного молока [13]. Количество продуцируемого фермента устанавливалось по размеру зоны протеолиза вокруг макроколонии. Гемолитическую активность определяли на плотной питательной среде с добавлением 3 % бараньих эритроцитов. Размер зоны гемолиза вокруг макроколонии свидетельствовал о количестве продуцируемого гемолизина. Питательные потребности штаммов идентифицировали путем посева колоний методом реплик на голодную плотную среду без и с добавлением различных аминокислот, оснований, витаминов. Для определения подвижности изолированные колонии с помощью реплик помещали на поверхность полужидкого агара (0,6 % ЬВ-агар), которые инкубировали затем при 30 °С в течение 15-16 ч. Сформированные макроколонии были окружены четким ореолом разного размера [16].
Для тестирования различных генов использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) со специфическими праймерами. Препараты тотальной ДНК получали методом кипячения бактериальной взвеси
(107 м.к./мл) в дистиллированной воде в течение 30 мин на водяной бане с последующим центрифугированием при 10000 об ./мин. ПЦР проводили на программируемом термостате «Терцик» (ЗАО «НПД ДНК-Технология», Москва) в микропробирках объемом 600 мкл по ранее описанным условиям [1, 4, 8]. Фрагменты генов патогенности в хромосоме изучаемых штаммов выявляли с использованием олигонуклеотидных праймеров, приведенных в [4, 8]. Праймеры синтезировали в НПФ «Литех» (Россия) на автоматическом синтезаторе ДНК «АСМ-102U». Продукты ПЦР фракционировали в 2 % агарозном геле (BioRad) и регистрировали в ультрафиолетовом свете.
Результаты и обсуждение
Выявление в природных популяциях возбудителя холеры эльтор нетоксигенных клонов и эпидемиологическая значимость этого явления побудила нас выяснить причины их возникновения. Как известно, при резком изменении условий существования (понижении температуры, изменении pH, концентрации NaCl и питательных веществ) вирулентные холерные вибрионы с помощью различных сенсорных и регуляторных механизмов, как правило, перестраивают работу генетического аппарата, что позволяет сохранить им свою жизнеспособность [17]. Вместе с тем, описаны штаммы с неполным набором генов патогенности, но генетические механизмы, лежащие в основе их появления, остаются почти неизвестными. Для изучения этого вопроса была поставлена задача в экспериментальных условиях in vitro выяснить природные факторы индукции реорганизации генома. В качестве объекта исследования были взяты 10 штаммов V. choie гае биовара eltor, выделенные во время эпидемии на территории Астраханской области, из них 5 - клинических, 1 - от вибрионосителя и 4 - из воды открытых водоемов (табл. 1).
На первом этапе работы было определено наличие в геноме изучаемых штаммов профагов СТХ и RS1, островов патогенности (VPI-1 и VPI-2), панде-мичности (VSP-1 и VSP-2) и персистенции (EPI), а также некоторых генов эволюционно древней части хромосомы путем ПЦР-тестирования 21 различного гена. В результате было установлено, что независимо от времени и источника выделения исследуемые штаммы содержали следующие МГЭ: СТХ (ctxA+, zot+, асе+, orfU*), RSI (rstC*), VPI-1 (tcpA+, toxTf, aldA\ mop*), VPI-2 (hell760+, nanff, rep!803+), VSP-1 (deoOl 75*, tnp0185*), VSP-2 (pro0490+, pro0496+), EPI (mshA+), а также гены rtxA, hapA, attRS, toxR. Эта данные подтвердили, что штаммы были вирулентными, имели пандемический потенциал и способность сохраняться в водной среде.
Мы полагали, что при нахождении вирулентных штаммов вне организма хозяина одним из факторов, индуцирующих перестройку генома, может быть голодание клеток по основным источникам питания, а также более низкая температура культивирования. Поэтому в качестве среды обитания холерных вибрионов использовали стерилизованную речную и дистиллированную воду и физиологиче-
I
I
123456 789 10 11 12 13141516 17 1819
ПЦР-тестирование вирулентных штаммов V. cholerae биовара эльтор до и после пребывания их в водной среде на наличие в их геноме генов профага СТХ ctxA, zot, асе:
1 - контаминационный контроль (реакционная смесь без ДНК-матрицы); 2 - М888, исходный; 3 - М888 (физиол. р-р, 18 °С); 4 - М888 (физиол. р-р, 4 °С); 5 - М888 (речная вода, 18 °С); 6 - М888 (дистиллированная вода, 18 °С); 7 - М887 исходный; 8 - М887 (речная вода, 4 °С); 9 - М887 (физиол. р-р, 18 °С); 10- М641 исходный;
11- М641 (физиол. р-р, 4 °С), 12 - М641 (речная вода, 18°С);
13 - Р3544 исходный; 14 - Р3644 (речная вода, 18 °С); 15 - Р3644 (дистиллированная вода, 18 °С); 16 - М962 исходный; 17- М962 (речная вода, 18 °С); 18- М962 (физиол. р-р, 4 °С); 19- маркер ¡ молекул, масс gene ruler TM50bp DNA ladder
I
ский раствор, а температура инкубации посевов составляла 4 и 18 °С. Бактериальные суспензии штаммов, выращенных на полноценных плотных питательных средах, вносили в воду до конечной концентрации 10 кл./мл. Проводя сравнительный анализ структуры генома изолированных колоний, получаемых через каждые 4 дня при высеве суспензии, инкубируемой в речной либо в дистиллированной воде или в физрастворе, на плотные питательные среды было обнаружено, что в популяции 5 различных штаммов из 10 проверяемых появляются клетки, утратившие профаг СТХ. Это заключение
МИКРОБИОЛОГИЯ
было сделано на основании отсутствия в их геноме тестируемых генов профага ахА, гМ, асе, ог$и (табл. 2, рисунок). В то же время потеря этими клонами других 17 указанных выше генов, связанных с вирулентностью, пандемичностью и персистенцией, не наблюдалась.
Одним из важных для нас параметров процесса реорганизации генома является период времени от засева культуры в воду до появления клонов с измененными генетическими свойствами. Оказалось, что периоды времени, в которые формируются штаммы с делегированным геномом, заметно различаются для штаммов М888, М641, М887, М962, Р3644 и составляют, соответственно, 4-7, либо 10, либо 45-210, либо 45-50, либо 75-180 сут (табл. 2). Следует особо выделить клинический штамм М888, клетки которого утрачивали профаг СТХ уже после 4 сут их пребывания в речной воде при 4 °С. Другим штаммом, наиболее нестабильно наследующим этот профаг, оказался М641, выделенный от виб-рионосителя. Независимо от среды и температуры инкубации нетоксигенные клоны в популяции этого штамма были обнаружены через 10 сут (табл. 2). Помимо клонов, нетоксигенность которых связана с утратой профага СТХ, были также выявлены клоны, несущие в геноме дефектные профаги, в коровой области которых сохранились гены ахА и асе, кодирующие ХТ и дополнительный токсин Асе, но утратившие ген го!, определяющий продукцию второго дополнительного токсина Хо1. Клоны с таким генотипом можно было обнаружить в популяции клеток двух штаммов М887 и М962 через весьма длительный период их инкубации в физиологическом растворе и речной воде при 18 °С (табл. 2).
Таким образом, экспериментально установлено, что у значительного числа эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов эльтор при их обитании в водной среде может действительно происходить реорганизация генома, выражающаяся прежде всего в утрате профага СТХ или ряда генов его ко-
i
Таблица 2
Результаты изучения генетической организации вирулентных штаммов холерного вибриона биовара эльтор
после пребывания их в водной среде обитания
Штамм* 1 Среда инкубации Температура, °С Время. Наличие генов профага СТХ Присутствие гена
инкубации, сут ctxA 1 zot 1 асе 1 orfU tcpA из ОП VPI-1
М888. Речная вода 4 4 .... +
М888 Речная вода 18 7 .... +
М888 Физиологический раствор 4 7 .... +
М888 Физиологический раствор 18 7 .... +
М888 Дистиллированная вода 18 7 .... +
М641 Речная вода 4 10 +
М641 Речная вода 18 10 - +
М641 Физиологический раствор 4 10 .... +
М641 Физиологический раствор 18 10 - ' - - - +
М641 Дистиллированная вода 18 10 - ... +
М887 Физиологический раствор 18 210 + - + + +
М887 Дистиллированная вода 18 45 . . . ’ . . +
М962 Речная вода 18 50 + - + + +
М962 Физиологический раствор 4 45' . - - . - - +
Р364^ Речная вода 18 75 - г - - +
Р364^ Дистиллированная вода 18 180 - - . - - +
* По данным ПЦР изученные штаммы содержали в хромосомах следующие 15 тестируемых генов; VP1-1 (loxT, aldA, mop), VPI-2 (hell760,
nanH, repl803), VSP-1 (deoOl 75, tnp0185), VSP-2 (pro 0496, pro0496), EP1 (mshA), а также гены hapA, rtxA, attRS, loxR.
!
і
ровой области. Одним из основных факторов, индуцирующих этот процесс, является голодание клеток по основным источникам углерода, фосфора и азота. Температура инкубации бактериальных суспензий, видимо, практически не влияет на этот процесс
На следующем этапе работы мы попытались выявить фенотипические свойства нетоксигенных штаммов, появление которых было бы связано с утратой профага СТХ. При обнаружении таких свойств последние могли бы служить в качестве маркеров выявленного изменения генома. Ранее рядом авторов [2] высказано предположение о существовании обратной зависимости между экспрессией генов гемолизина и холерного токсина. Более того была предложена формула эпидемически опасных холерных вибрионов эльтор, содержащих полный набор генов вирулентности, - сгх Н1у+ [6]. Из этого следовала очевидная необходимость сравнительного анализа гемолитической активности исходных штаммов и их нетоксигенных производных. Однако проведенные исследования указали на отсутствие различий в продукции гемолизина между сравниваемыми штаммами. Кроме того, подвижность, питательные потребности и уровень биосинтеза растворимой гемагтлютинин/протеазы у изо-генных токсигенных и нетоксигенных штаммов был одинаков, хотя у ряда других патогенных бактерий отмечено наличие связи между экспрессией соответствующих генов и процессом адаптации бактерий к новой экологической нише [7]. Таким образом, проверенные свойства не могут быть использованы как фенотипические маркеры для отбора в популяции вирулентного штамма нетоксигенных клонов. Вместе с тем, ПЦР, согласно нашим экспериментальным моделям, позволяет тестировать утратившие СТХ-профаг штаммы, образованные в течение относительно короткого (4—10 сут) или длительного времени (около 6 мес.) существования патогенных вариантов в водной среде, что доказывает правомочность этого метода для решения поставленных задач.
Формирование у вирулентных штаммов в водной среде нетоксигенных вариантов при сохранении в их геноме других известных МГЭ патогенности, пандемичности и персистенции подтверждает выявленную ранее закономерность изменения генома возбудителя холеры эльтор при смене экологических ниш его обитания [8, 9, 12]. Первый этап адаптации вибрионов к водной среде действительно может состоять в утрате ими профага СТХ. Выраженная утрата вибрионами генетической основы их вирулентности определяет появление нетоксигенных клонов, сохраняющих способность при их попадании в организм человека к развитию одного из первых этапов инфекционного процесса - колонизации тонкого кишечника и, как следствие, появление вибрионосителей.
Итак, представленные данные свидетельствуют в пользу предположения, что штаммы с1:хА 1:срА+, нередко выделяемые в природных популяциях, появляются в результате адаптивного изменения генома вирулентных штаммов, получивших в процессе эволюции весь необходимый набор чужеродных генных блоков патогенности. Штаммы с такой
структурой генома могут превратиться в токсиген-ные в результате фаговой конверсии, хотя не исключен и другой ход событий - последовательная утрата ими других МГЭ вирулентности и, как следствие, формирование полностью непатогенных вариантов. Однако эти предположения нуждаются в дальнейшей экспериментальной проверке.
Работа поддержана грантом РФФИ (06-04-48310-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Костромитина Е. А. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона Эль-Тор с различной эпидемической значимостью: Дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 2004. - 161 с. - 2. Мишанькин М.Б., Либидзон A.E., Родионова A.B. // ЖМЭИ. - 1983. - №2. - С. 59-62. -3. Николешвили JI.P., Мазрухо Б. А. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2001. - Вып. 81. - С. 65-75. 4. Осин
A.B., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. // Генетика. - 2005. - Т. 41, № 1. - С. 1-10. - 5. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А. и др. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2005. - Вып. 1 (89). - С. 5-9. -
6. Подосинникова Л.С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - Ростов н/Д, 1993. - 44 с. -
7.Романова Ю.М., Кириллов М.Ю., Терехов A.A., Гинцбург A.A. // Генетика - 1996. - № 9. - С. 1184-1190. -
8. Смирнова Н.И., Кириллина O.A., Челдышова Н.Б., Кутырев
B.В. // Мол. генет. - 2001. - № 3. - С. 23-28. - 9. Смирнова Н.И., Костромитина Е.А., Осин A.B., Кутырев В.В.//Веста. РАМН. -2005. -№7. -С. 19-25. 10. Bisztein N., Cosnfgliola М.С., Pichel М. et al. Il Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - Vol. 70, N 12. - P481-7486. - 11. Colwell R.R., Hug A .Il Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. - Washington, 1994. - Chapter 9. - P. 117-133. -
12. Faruque S.М., Kamruzzaman M. Ismail M. et al. Il Infect. Immun. - 2003. - Vol. 71, N 2. - P: 1020-1025. -
13. Finkeistein R.A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y. et al. Il Infect. Immun. - 1992. - Vol .60. - P. 472^178. -
14. Hung D.T., Zhu J., Sturtevant D. et al. Il Mol. Microbiol. - 2006. - Vol. 59, N 1. - P. 193-201. - 15. Matz C., McDougald D., Moreno A.M. el al. Il Proc Natl. Acad. Sei. USA. - 2005. - Vol. 102. - P. 16819-16824. - 16. Mostow P., Richardson K. // Infect. Immun. - 1990. - Vol. 58, N11. -P. 3633-3639.- 17. Reidl J., Klose K.E.//FEMS Microbiol. -2002. - Vol. 26. - P. 125-139.
T.A.Kulshan', A.V.Toporkov, N.I.Smimova
Genetic Changes of Virulent Vibrio cholerae El Tor Biovar Strains Living in Water Environment
Russian Anti-Plague Research Institute «Microbe», Saratov
Experimental, modeling research demonstrated that after having been shed from the host organism into the water environments, epidemically hazardous strains could lose the CTX prophage or a number of the core region genes from their genome, however, retaining the other mobile genetic elements carrying the genes of virulence, pandemicity and persistence. The loss of the toxinogenic properties was shown to be accompanied with no modifications in the strains' hemolytic activity which is a major phenotypic marker of the 7-th cholera pandemic etiologic agent. The observations described in the work may testify in favour of the assumption that ctxA'tcpA* isolates often found in natural populations could be formed as a result of some adaptive alterations of the genome of virulent strains that had previously acquired the whole necessary set of foreign pathogenicity gene blocks during the evolutionary process.
Key words'. El Tor cholera pathogen, experimental modeling, genome reorganization, CTX prophage, hemolytic activity.
Поступила 20.03.06.
