CC BY
38УДК 579.25:616.5-002.828
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ СЕРИЙНЫХ ИЗОЛЯТОВ ГРИБА TRICHOPHYTON RUBRUM (CASTELLANI) - ВОЗБУДИТЕЛЯ ОНИХО-МИКОЗА И МИКОЗА СТОП
1Пчелин И.М. (н.с., аспирант)*, 1Крючкова М.А. (студент), 1Чилина Г.А. (зав. лаб.), 2Боронина Л.Г. (профессор кафедры), 3Олина Е.С. (врач-бактериолог), 1Шурпицкая О.А. (зав. лаб.), 1Цурупа Е.Н. (аспирант, врач-дерматовенеролог), Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой), 1Тараскина А.Е. (зав. лаб.)
1НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург; 2Уральский государственный медицинский университет, Екатеринбург; 3Свердловский областной кожно-венерологический диспансер, Екатеринбург, Россия
©Коллектив авторов, 2018
Гриб Trichophyton rubrum является одним из частых возбудителей поверхностных микозов человека, поражающим преимущественно ногтевые пластины и кожу стоп. Генетический внутривидовой полиморфизм микромицетов отвечает за структуру популяции и определяет динамику вида. Анализ шести локусов микросателлит-ных повторов 50 клинических изолятов T. rubrum позволил получить 43 различных генотипа гриба. В ходе работы доказана высокая разрешающая способность примененного метода по сравнению с наиболее распространенным подходом молекулярно-генетического типиро-вания полиморфизма нетранскрибируемого спейсера рДНК. Оценка серийных изолятов T. rubrum показала генетическую гомогенность штаммов, полученных из одного источника, исключение составила одна серия изолятов, различающихся по длине микросателлитного локуса Tr002. Рассчитанное генетическое расстояние позволяет заключить, что вариабельные клоны являются частями одного полиморфного мицелия, а не принадлежат к отдельным генетическим линиям, таким образом, существует возможность инфицирования человека полиморфным мицелием гриба вида T. rubrum.
Ключевые слова: молекулярно-генетическое типирование, анализ микросателлитных повторов, дерматомицеты, внутривидовая генетическая изменчивость
GENETIC POLYMORPHISM OF TRICHOPHYTON RUBRUM (CASTELLANI) - A CAUSATIVE AGENT OF ONYCHOMYCOSIS AND TINEA PEDIS
1Pchelin I.M. (scientific researcher, postgraduate student), 1Kryuchkova M.A. (student), 1Chilina G.A. (head of the laboratory), 2Boronina L.G. (professor of the department), 3Olina E.S. (bacteriologist), 1Shurpitzkaya O.A. (head of the laboratory), 1Tsurupa E.N. (postgraduate student, dermatovenerologist), 1Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department), 1Taraskina A.E. (head of the laboratory)
Контактное лицо: Пчелин Иван Михайлович, e-mail: arcella.oraia@gmail.com
1 Kashkin Research Institute of Medical Mycology, NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg; 2Ural State Medical University, Yekaterinburg; 3Sverdlovsk Regional Dermatovenerologic Dispensary, Yekaterinburg, Russia
©Collective of authors, 2018
The fungus Trichophyton rubrum is prevalent causative agent of human superficial mycoses causing mostly infections of the toenails and sole skin. Genetic intraspecies polymorphism is responsible for population structure and species dynamics. We performed amplification of six microsatellite loci in 50 clinical T. rubrum isolates and obtained 43 individual multilocus genotypes. This result indicates a high efficiency of the applied method when compared to PCR amplification of rDNA nontranscribed spacer loci. We performed typing of serial T. rubrum isolates and found in all but one series identical genotypes. On the basis of genetic distances between the isolates of this polymorphic series, we conclude that its isolates can be considered as parts of the same polymorphic mycelium and do not represent independent genetic lineages. Thus, patients can potentially be infected by polymorphic T. rubrum mycelium.
Key words: molecular strain typing, microsatellites, dermatophytes, intraspecific variability
ВВЕДЕНИЕ
По оценке Глобального фонда по борьбе с грибковыми инфекциями GAFFI, около 1/7 населения Земли страдает грибковыми заболеваниями кожи, волос и ногтей [1]. Частота встречаемости онихомикоза варьирует от 8% до 13% на долю населения в зависимости от географических и популяционных особенностей [2, 3]. Прогрессированию онихомикоза и микоза стоп способствуют спортивная активность, экологические факторы, увеличение частоты генетических патологий, диабет, иммунодефицит, старение населения [4-6]. Основными возбудителями дерматомикозов человека и животных являются кератинофильные первично патогенные микромицеты, принадлежащие к трем родам: Trichophyton, Microsporum и Epidermophyton. Наиболее распространенный этиологический агент онихомикоза и микоза стоп - гриб Trichophyton rubrum, в то время как поражения волос, гладкой кожи и крупных складок обычно вызывают другие виды дерматомицетов [7-10]. Вклад T. rubrum в глобальную заболеваемость онихомикозом оценивают на уровне 44,9% [11].
Основа эволюции микроорганизмов - внутривидовое генетическое разнообразие. Изучение генетического полиморфизма позволяет оценить структуру популяции, его функциональное разнообразие, динамику микроэволюции вида. Несмотря на то, что вид T. rubrum является клональным, в настоящее время показана внутривидовая генетическая гетерогенность глобальной популяции изучаемого микромицета [12, 13]. Кроме того, существуют доказательства инфицирования одного пациента клиническими изолятами с различными генотипами [12, 14, 15].
С развитием методов молекулярной биологии, внедрением их в научно-исследовательскую и клиническую практику микробиологов, дискриминирующая способность, воспроизводимость методов молекуляр-но-генетического внутривидового типирования растет [16]. Для типирования T. rubrum наиболее распространенным является ПЦР по нетранскрибируемому спейсеру рДНК [14, 15, 17-25]. Но в настоящее время на смену ему приходят более перспективные методы: полногеномное секвенирование [13] и микросателлит-ный анализ [12, 26].
Цель нашего исследования - изучение генетического полиморфизма клинических изолятов гриба T.
rubrum методом микросателлитного анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работу были включены 58 изолятов гриба T. rubrum: 44 одиночных и 14 серийных, по два от пяти пациентов и четыре - от одного больного с сочетан-ным поражением ногтей и кожи стоп. Изоляты были выделены в микологической клинике НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина (Санкт-Петербург) и Свердловском областном кожно-венерологическом диспансере (Екатеринбург). Посевом патогенного материала на агар Сабуро с добавлением 2% глюкозы получали первичные высевы, содержащие несколько колоний гриба. Фрагменты одной или двух колоний для каждого первичного высева пересевали на отдельные чашки Петри и выращивали гигантские колонии, из которых потом выделяли геномную ДНК. Определение вида проводили на основании изучения морфологических признаков и подтверждали методом секвенирования ДНК по региону ITS. Выделение ДНК осуществляли набором GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, Литва). В пробирки с 350 мкл лизирующего буфера А с двумя стеклянными бусинами при помощи 200 мкл наконечников для дозаторов вносили мицелий, встряхивали на гомогенизаторе Minilys (Bertin Technologies, Франция), добавляли лизирующий буфер B и РНКазу А. Дальнейшие манипуляции выполняли в соответствии с протоколом производителя. Для амплификации региона ITS в термоциклере C1000 Touch (Bio-Rad, США) использовали прямой праймер ITS5 и обратный ITS4 (табл. 1).
Таблица 1
Праймеры, использованные в данной работе
Локус Пряной прайиер Обратный прайиер Ссылка
ITS GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG TCCTCCGCTTATTGATATGC [27]
Тг001 GTGGGCTCGAACCGAGACAAAC GGTGACTGGAGGGTGAAGGG [26]
Тг002 CTCGCATTTGGCCTTGAGTGT CTGGCTGGTGGAAGGACATAG [26]
ТгООЗ GCCAGTGATCCTGCATCGTCC CGGGCTTCTCGTCTTGCTCTTC [26]
Тг005 AAAGTACCTCCTGTTTACCATC GGCATTCCGGGCAGTTGAAGC [26]
Тг(СТ)20 GCGGTGGCGTCTTCTATC CAGCAGACAACATAGCAGTCG [12]
Tr(GA)25 GCGATGGTTGGAGGAGTTG GCCTGTCGCTGCTTACTTG [12]
Реакционная смесь общим объемом 50 мкл состояла из 100 мМ Tris/HCl (pH 9,0), 250 мМ KCl, 10 мМ Tween-20, 2,5 мМ MgCl2, 250 мкМ каждого дНТФ. Праймеры были добавлены в количестве 10 пМ каждого, полимераза Taq (Синтол, Россия) -1 е.а. На одну реакцию брали 2,5 мкл геномной ДНК. Программа амплификации состояла из начальной денатурации в течение 5 мин. при 95 °С, 34 циклов (30 с - 95 °С, 30 с - 56 °С, 60 с - 72 °С) и финальной элонгации 10 мин. при 72 °С. Амплификацию микросателлитных локусов Tr001, Tr002, Tr003, Tr005, Tr(CT)20 и Tr(GA)25 (табл. 1) проводили в объеме 25 мкл, соотношение компонентов реакционной смеси было такое же, как и при амплификации региона ITS. Термоциклер был запрограммирован на начальную денатурацию на протяжении 10 мин. при 95 °С, 30 циклов (50 с - 95 °С, 60 с - 58 °С, 60 с - 72 °С) и финальную элонгацию 10 мин. при 72 °С [12]. Длины флуоресцентных продуктов амплификации микросателлитов определяли капиллярным электрофорезом на приборе ABI 3500 (Applied Biosystems, США) в присутствии стандартов молекулярных весов Red DNA Size Standard (MCLAB, США). Количество
мультилокусных генотипов подсчитывали в программе GenClone 2.0 [28]. Индекс генетического разнообразия R рассчитывали по формуле R = (G-1)/(N-1), где G - число мультилокусных генотипов, а N - число изолятов [29]. Генетические расстояния рассчитывали по методу Бруво в пакете polysat для R [30]. Совокупность длин локусов для каждого изолята позволяла относить его к некоторому мультилокусному генотипу, то есть определить индивидуальный микросателлитный профиль изолята.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Последовательность региона ITS у всех изученных 50 эпидемиологически не связанных изолятов была идентична последовательности этого региона штамма РКПГ-1408, депонированной в Генбанке под номером KT285224. Это позволило отнести их к виду T. rubrum sensu stricto. Для этих штаммов было получено 43 индивидуальных микросателлитных профиля, что дало значение индекса клонального разнообразия 0,86. В предыдущих наших работах [25] для сравнимой выборки из 51 изолята T. rubrum были получены 10 муль-тилокусных генотипов и гораздо более низкое значение R=0,18, что отражает большую разрешающую способность метода микросателлитного анализа по сравнению с типированием по локусам нетранскриби-руемого спейсера рДНК.
У всех шести пациентов, от которых были получены серийные изоляты, были выявлены уникальные мультилокусные генотипы гриба T. rubrum (табл. 2).
Таблица 2
Серийные изоляты гриба Trichophyton rubrum, изученные в настоящей работе, с указанием полученных длин микросателлитных локусов
Па- Лока- Изолят Муль- Микросателлитный локус
циент лизация кусный генотип Тг001 Тг002 ТгООЗ Тг005 ТгСТ20 TrGA25
Микоз D15P49I 1 282 282 237 308 135 146
стоп D15P49II 1 282 282 237 308 135 146
2 ОМ D15P51I 2 282 274 237 308 135 146
стоп D15P51II 2 282 274 237 308 135 146
3 ОМ D15P62I 3 280 263 237 308 135 146
стоп D15P62II 3 280 263 237 308 135 146
4 ОМ D15P71I 4 280 265 237 308 135 146
стоп D15P71II 4 280 265 237 308 135 146
5 ОМ кистей D15P88I 5 284 263 237 308 135 148
D15P88II 5 284 263 237 308 135 148
ОМ D15P100I 6 282 268 237 308 135 146
6 стоп D15P100II 7 282 265 237 308 135 146
Микоз D15P101I 7 282 265 237 308 135 146
стоп D15P101II 7 282 265 237 308 135 146
Примечание: заливкой отмечена мутация в локусе Тг002 у изолятов пациента №6. ОМ - онихомикоз.
Парные изоляты, полученные от пяти больных, имели одинаковые микросателлитные профили. Изо-лят с ногтей пациента с сочетанным поражением отличался от второго с ногтей и от обоих изолятов с кожи стоп этого больного по длине локуса Тг002. Чтобы выяснить, являются ли изоляты в серии самостоятельными или принадлежат одной и той же клональной линии, необходимо ответить на два вопроса: 1) принад-
лежат ли все повторности одного мультилокусного генотипа одному клону [31] и 2) принадлежит ли каждый отдельно взятый мультилокусный генотип отдельному клону [32]. Ответ на первый вопрос может быть дан через анализ зависимости распределения числа выявляемых в выборке мультилокусных генотипов от числа используемых локусов. Второй вопрос требует анализа распределения частот парных генетических расстояний для того, чтобы обнаружить возможные соматические мутации или погрешности метода, которые приводят к приписыванию разным образцам одного и того же клона разных мультилокусных генотипов. Полученное нами распределение числа выявляемых микросателлитных профилей в зависимости от числа используемых локусов указывало на то, что примененная схема типирования была достаточной для того, чтобы считать повторности каждого мультилокусного генотипа принадлежащими одному клону (Рис. 1).
Рис. 1. Разрешающая способность шести микросателлитных локусов, использованных для типирования выборки изолятов T. rubrum, n=50. По оси абсцисс указано число локусов, взятых во всех возможных комбинациях. По оси ординат отложен разброс количества мультилокусных генотипов, выявляемых при использовании комбинаций заданного числа локусов. Центральная линия указывает
среднее число генотипов, выявляемых в образце при иотользовании Х микросателлитных локусов. Набор из 5 локусов позволяет надежно определить число генотипов в выборке.
В изученной выборке изолятов T. rubrum распределение парных генетических расстояний Бруво было унимодальным, с локальным максимумом в области минимума. Разброс значений был в пределах от 0,00 до 0,62 (Рис. 2). Генетическое расстояние между изо-лятами D15P100I и D15P100II составляло 0,059 и находилось в крайней левой части распределения. Иными словами, оно имело околонулевое значение. Из этого можно было сделать вывод, что данные изоляты принадлежали одному и тому же клону, являясь частями одного полиморфного мицелия. Явление генетического полиморфизма среди ядер отдельно взятого мицелия известно для целого ряда видов грибов. Так, 2-3% ядер, изолированных из лабораторного штамма гриба Neurospora crassa имели мутации, связанные с изменением морфологии мицелия [33].
Генетическое расстояние
Рис. 2. Trichophyton rubrum. Распределение генетических расстояний, рассчитанных по методу Бруво, на основании результатов амплификации шести микросателлитных локусов. Отмечено генетическое расстояние между изолятами D15P100I и D15P100I.
Чен Дж. с соавторами [34] изучали распределение генотипов региона ITS в ядрах штамма гриба Agaricus subrufescens. Было найдено три варианта последовательности региона ITS, причем два из них были ал-лельны, а третий располагался в особом, не связанном локусе. Этот третий вариант присутствовал только в одном из двух конститутивных гаплоидных ядер клеток мицелия. Считают, что наибольший вклад в формирование генетического разнообразия вносит мутационный процесс, но генетически различные ядра могут также быть получены при слиянии гиф и генетическим обмене с другими мицелиями [35]. Генетический полиморфизм микромицетов на внутривидовом уровне связывают с рядом важных с практической точки зрения свойств [36, 37]. В изученных в работе [38] случаях инвазивного аспергиллеза, вызванного Aspergillus fumigatus, все изоляты не-респираторного происхождения имели одинаковый генотип, а изоляты из легких проявляли полиморфизм. В оригинальной статье это рассматривают как свидетельство того, что полость легких колонизируется многими изолятами A. fumigatus, но лишь отдельные изоляты приобретают способность диссеминировать в другие ткани. Некоторые авторы также полагают, что данный феномен может быть связан с тем, что в полости легкого проходит конидиальное спороношение, которое сопровождается возникновением значительного количества мутаций вследствие большого числа митотических делений. В тканях же размножение гриба происходит только за счет пролиферации мицелия, и генетическое разнообразие не генерируется [39]. В последних исследованиях связывают тип спаривания изолята A. fumigatus и летальность вызванного им заболевания [40]. Candida auris является еще одним примером клонального вида аскомицетов. Одна из генетических линий этого гриба проявляет ограниченную контагиозность, встречаясь практически исключительно в ушных раковинах. Напротив, изоляты других линий могут вызывать вну-трибольничные вспышки заболевания [41]. Несмотря на то, что корреляции фенотипических свойств гриба T. rubrum и его генотипической принадлежности в настоящее время не выявлено, приведенные примеры позволяют полагать, что со временем такие данные появятся. Интересно, что отмеченный нами полимор-
физм мицелия относился к колониям, выделенных с ногтей, а не с кожи стоп. Это находится в согласии с результатами других авторов [14, 20], обнаруживших разнообразные изоляты именно в случаях онихоми-коза, а не микоза стоп. Поскольку логичнее ожидать большее генетическое разнообразие в источнике инфекции, а не во вторичных очагах заболевания, все эти наблюдения ставят под вопрос высказанное в работе [2] понимание онихомикоза стоп как вторичного явления по сравнению с грибковым поражением кожи.
ВЫВОДЫ
Микросателлитный анализ позволяет достичь большего разрешения при типировании изолятов T. rubrum по сравнению с широко используемым методом ПЦР по нетранскрибируемому спейсеру рДНК. Существует возможность инфицирования пациентов полиморфным мицелием гриба вида T. rubrum.
Исследование поддержано Российским фондом фундаментальных исследований, грант 18-34-00153.
ЛИТЕРАТУРА
1. The Fungal Infection Trust. How common are fungal diseases? Fungal Research Trust 20th Anniversary meeting. London June 18th 2011, updated August 2017.
2. Ameen M., Lear J.T., Madan V., Mohd Mustapa M.F., Richardson M. British Association of Dermatologists' guidelines for the management of onychomycosis 2014. Br. J. Dermatol. 2014; 171: 937-58.
3. Petinataud D., Berger S., Contet-Audonneau N., Machouart M. Molecular diagnosis of onychomycosis. J. Mycol. Med. 2014; 24: 287-95.
4. Pankewitz F., Nenoff P., Uhrlaß S., et al. Development of a novel polymerase chain reaction-enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of Trichophyton rubrum onychomycosis. Br. J. Dermatol. 2013; 168: 1236-42.
5. Leelavathi M., Noorlaily M.N. Onychomycosis nailed. Malaysian Family Physician. 2014; 9: 2-7.
6. Joshua A., Zeichner M.D. Onychomycosis to fungal superinfection: prevention strategies and considerations. J. Drugs Dermatol. 2015; 14 (10): 32-4.
7. Васильева Н.В., Разнатовский К.И., Котрехова Л.П. и др. Этиология онихомикоза стоп в г. Санкт-Петербурге и г. Москве. Результаты проспективного открытого многоцентрового исследования. Проблемы медицинской микологии. 2009; 11: 14-8. [Vasil'eva N.V., Raznatovskij K.I., Kotrekhova L.P. i dr. Etiologiya onihomikoza stop v g. Sankt-Peterburge i g. Moskve. Rezul'taty prospektivnogo otkrytogo mnogocentrovogo issledovaniya. Problemy medicinskoj mikologii. 2009; 11: 14-8 (In Russ)].
8. Кожичкина Н.В. Этиология микозов стоп и онихомикоза. Вестник дерматологии и венерологии. 2013; 1: 9-13. [Kozhichkina N.V. Etiologiya mikozov stop i onihomikoza. Vestnik dermatologii i venerologii. 2013; 1: 9-13 (In Russ)].
9. Тлиш М.М., Кузнецова Т.Г., Псавок Ф.А. Этиологические особенности онихомикоза в Краснодарском крае. Выбор метода системной терапии. Вестник дерматологии и венерологии. 2016; 5: 84-89. [Tlish M.M., Kuznecova T.G., Psavok F.A. EHtiologicheskie osobennosti onihomikoza v Krasnodarskom krae. Vybor metoda sistemnoj terapii. Vestnik dermatologii i venerologii. 2016; 5: 84-89 (In Russ)].
10. Хисматулина И.М., Абдрахманов Р.М., Халдеева Е.В., Глушко Н.И., Лисовская С.А. Анализ состава микробиоты при микотическом поражении паховой области. Проблемы медицинской микологии. 2017; 19: 34-6. [Hismatulina I.M., Abdrahmanov R.M., Haldeeva E.V., Glushko N.I., Lisovskaya S.A. Analiz sostava mikrobioty pri mikoticheskom porazhenii pahovoj oblasti. Problemy medicinskoj mikologii. 2017; 19: 34-6 (In Russ)].
11. Sigurgeirsson B., Baran R. The prevalence of onychomycosis in the global population: a literature study. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2014; 28: 1480-91.
12. Gräser Y., Fröhlich J., Presber W., de Hoog S. Microsatellite markers reveal geographic population differentiation in Trichophyton rubrum. J. Med. Microbiol. 2007; 56: 1058-65.
13. Persinoti G.F., Martinez D.A., Li W., et al. Whole genome analysis illustrates global clonal population structure of the ubiquitous dermatophyte pathogen Trichophyton rubrum. Genetics. 2018; 208: 1657-69.
14. Yazdanparast A., Jackson C.J., Barton R.C., Evans E.G. Molecular strain typing of Trichophyton rubrum indicates multiple strain involvement in onychomycosis. Br. J. Dermatol. 2003; 148: 51-4.
15. Takeda K., Mochizuki H., Izumi K., et al. Polyclonality of Trichophyton rubrum isolates in a dermatophytosis patient with multiple lesions. Med. Mycol. J. 2016; 57: E17-20.
16. Mochizuki T., Takeda K., Anzawa K. Molecular markers useful for intraspecies subtyping and strain differentiation of dermatophytes. Mycopathologia. 2017; 182: 57-65.
17. Jackson C.J., Barton R.C., Kelly S.L., Evans E.G. Strain identification of Trichophyton rubrum by specific amplification of subrepeat elements in the ribosomal DNA nontranscribed spacer. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 4527-34.
18. Rad M.M., Jackson C., Barton R.C., Evans E.G. Single strains of Trichophyton rubrum in cases of tinea pedis. J. Med. Microbiol. 2005; 54: 725-6.
19. Baeza L.C., Matsumoto M.T., Almeida A.M., Mendes-Giannini M.J. Strain differentiation of Trichophyton rubrum by randomly amplified polymorphic DNA and analysis of rDNA nontranscribed spacer. J. Med. Microbiol. 2006; 55: 429-36.
20. de Assis Santos D., de Carvalho Araüjo R.A., Kohler L.M., et al. Molecular typing and antifungal susceptibility of Trichophyton rubrum isolates from patients with onychomycosis pre- and post-treatment. Int. J. Antimicrob. Agents. 2007; 29: 563-9.
21. Rad M.M., Mohammadi A.M.A, Barton R.C. PCR typing of Trichophyton rubrum isolates by specific amplification of subrepeat elements in ribosomal DNA nontranscribed spacer. Iranian J. Dermatol. 2008; 11: 17-20.
22. Hryncewicz-Gwozdz A., Jagielski T., Sadakierska-Chudy A., et al. Molecular typing of Trichophyton rubrum clinical isolates from Poland. Mycoses. 2011; 54: e726-36.
23. Takahashi I., Fukushima K., Miyaji M., et al. Species identification and strain typing of dermatophytes by single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis of the ribosomal DNA and polymerase chain reaction analysis of subrepeat elements in the intergenic spacer region of Trichophyton rubrum. Asahikawa Medical University Repository. 2015; 15: 27-36.
24. Ramaraj V., Vijayaraman R.S., Elavarashi E., et al. Molecular strain typing of clinical isolates, Trichophyton rubrum using non transcribed spacer (NTS) region as a molecular marker. J. Clin. Diagn. Res. 2017; 11: DC04-DC09.
25. Pchelin I.M., Azarov D.V., Chilina G.A., et al. Single-nucleotide polymorphism in a local population of Trichophyton rubrum. Med. Mycol. 2018; 56: 125-8.
26. Gong J., Wu W., Ran M., et al. Population differentiation and genetic diversity of Trichophyton rubrum as revealed by highly discriminatory microsatellites. Fungal Genet. Biol. 2016; 95: 24-9.
27. White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J.W. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis M., Gelfand D., Sninsky J., White T (eds), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Orlando, FL: Academic Press, 1990: 315-22.
28. Arnaud-Haond S., Belkhir K. GenClone: a computer program to analyse genotypic data, test for clonality and describe spatial clonal organization. Mol. Ecol. Notes. 2007; 7: 15-7.
29. Dorken M.E., Eckert C.G. Severely reduced sexual reproduction in northern populations of a clonal plant, Decodon verticillatus (Lythraceae). J. Ecol. 2001; 89: 339-50.
30. Clark L., Jasieniuk M. polysat: an R package for polyploid microsatellite analysis. Molecular Ecology Resources. 2011; 11: 562-6.
31. Arnaud-Haond S., Duarte C.M., Alberto F., Serrao E.A. Standardizing methods to address clonality in population studies. Mol. Ecol. 2007; 16: 5115-39.
32. Halkett F., Simon J.C., Balloux F. Tackling the population genetics of clonal and partially clonal organisms. Trends Ecol. Evol. 2005; 20: 194-201.
33. Maheshwari R. Nuclear behavior in fungal hyphae. FEMS Microbiol. Lett. 2005; 249: 7-14.
34. Chen J., Moinard M., Xu J., et al. Genetic analyses of the internal transcribed spacer sequences suggest introgression and duplication in the medicinal mushroom Agaricus subrufescens. PLoS One. 2016; 11: e0156250.
35. Caten C.E., Jinks J.L. Heterokaryosis: its significance in wild homothallic ascomycetes and fungi imperfecti. Trans. Br. Mycol. Soc. 1966; 49: 81-93.
36. Rep M., Kistler H.C. The genomic organization of plant pathogenicity in Fusarium species. Curr Opin Plant Biol. 2010; 13: 420-6.
37. Ma L.J., van der Does H.C., Borkovich K.A., et al. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium. Nature. 2010; 464: 367-73.
38. de Valk H.A., Meis J.F., de Pauw B.E., et al. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 2007; 45: 1415-9.
39. Verweij P.E., Zhang J., Debets A.J.M., et al. In-host adaptation and acquired triazole resistance in Aspergillus fumigatus: a dilemma for clinical management. Lancet Infect. Dis. 2016; 16: e251-60.
40. Monteiro M.C., Garcia-Rubio R., Alcazar-Fuoli L., et al. Could the determination of Aspergillus fumigatus mating type have prognostic value in invasive aspergillosis? Mycoses. 2018; 61: 172-8.
41. Schelenz S., Hagen F., Rhodes J.L., et al. First hospital outbreak of the globally emerging Candida auris in a European hospital. Antimicrob. Resist. Infect. Control. 2016; 5: 35.
Поступила в редакцию журнала 28.02.2018 Рецензент: В.А. Агеевец
