CC BY
0
ISSN 1560-7259 (print edition)
TURCZANINOWIA
ISSN 1560-7267 (online edition)
УДК 582.657.2+574.3+575.22
Генетический полиморфизм популяций и филогения среднесибирских спорышей секции Pоlygonum (Polygonaceae) с использованием ISSR и
хлоропластных маркеров
И. Е. Ямских1' 5*, Н. Н. Тупицына2 6, К. К. Рябова1' 3> 7, М. Г. Куцев1 4 8
1 Сибирский федеральный университет, пр. Свободный, д. 79, г. Красноярск, 660041, Россия
2Красноярский государственный педагогический университет им. В. П. Астафьева, ул. Ады Лебедевой, д. 89, г. Красноярск, 660049, Россия
3 Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный центр СО РАН», ул. Академгородок, д. 50, г. Красноярск, 660036, Россия
4 Алтайский государственный университет, пр. Ленина, д. 61, г. Барнаул, 656049, Россия 5E-mail: iyamskikh@mail.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0003-1424-9547 6E-mail: floranatalka@mail.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-2191-9740
7E-mail: ryabova.kseniya.k@mail.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0009-0008-0896-4249 8E-mail: m_kucev@mail.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0003-2284-6851 * Автор для переписки
Ключевые слова: генетическая структура, популяция, секция Polygonum, филогения, ISSR-PCR анализ, matK, trnL-trnF.
Аннотация. Статья посвящена исследованию генетического полиморфизма популяций и филогении видов секции Pоlygonum с использованием ISSR и хлоропластных маркеров. Спорыши представляют собой так-сономически сложную группу. Идентификация особей осложняется мелкими размерами растений, процессами межвидовой гибридизации, гетерокарпией, фенологической и экологической пластичностью. В данной работе изучена генетическая изменчивость 6 популяций 5 видов спорышей, произрастающих в г. Красноярске. ISSR-анализом установлено, что уровень генетического разнообразия в популяциях варьирует от 4,17 % до 35,83 % и имеет максимальные показатели для генетически близких видов P. sabulosum (P = 35,83 %) и P. arenastrum (P = 22,5-30 %). Минимальные значения генетического разнообразия зафиксированы для популяций P. aviculare (P = 4,17 %) и P. calcatum (P = 5 %). Изученные популяции характеризуются очень высоким уровнем генетической дифференциации (G = 0,78) и достоверно относятся к разным видам. На UPGMA-дендрограмме сходства особи данных видов формируют четко обособленные клады. Анализ генотипов особей в программе STRUCTURE также показывает достоверное разделение на 5 кластеров, соответствующих исследуемым видам. Филогенетический анализ с использованием trnL-trnF участка хлоропластной ДНК показывает наличие 5-нуклеотидной делеции и двух трансверсий, позволяющих разделить изучаемую группу спорышей на два кластера, морфологически отличающихся друг от друга. Первую группу формируют виды P. arenastrum, P. calcatum, P. caspicum, P. sabulosum, характеризующиеся отсутствием выраженного главного побега, постепенным уменьшением листьев к верхушкам побегов и расчленением околоцветника на 1/2 своей длины. Во вторую группу входят P. aviculare, P. boreale, P. neglectum, P rectum с выраженным главным побегом, гетерофиллией, расчленением околоцветника на 2/3-3/4 своей длины. В последовательностях гена matK выявлено 2 замены, он является менее информативным для решения вопросов таксономии изучаемой группы.
Поступило в редакцию 05.09.2023 Принято к публикации 16.10.2023
Submitted 05.09.2023 Accepted 16.10.2023
Genetic polymorphism of populations and phylogeny of the Central Siberian Polygonum (Polygonaceae) section using ISSR and chloroplast markers
I. E. Yamskikh1*, N. N. Tupitsyna2, K. K. Ryabova1 3, M. G. Kutsev1 4
1 Siberian Federal University, Svobodny Pr., 79, Krasnoyarsk, 660041, Russian Federation 2 V. P. Astafyev Krasnoyarsk State Pedagogical University, Ady Lebedevoy St., 89, Krasnoyarsk, 660049, Russian Federation 3 Federal Research Center "Krasnoyarsk Science Center SB RAS", Akademgorodok St., 50, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation 4 Altai State University, Lenina Pr., 61, 656049, Barnaul, Russian Federation *Corresponding author
Keywords: genetic structure, ISSR-PCR analysis, matK, phylogeny, population, section Polygonum, trnL-trnF.
Summary. This article is devoted to the study of genetic polymorphism of populations and phylogeny of Polygonum section using ISSR and chloroplast markers. Section Polygonum is a taxonomically complex group. Identification of individuals is complicated because of the small size of plants, the processes of interspecific hybridization, heterocarpy, phenological and ecological plasticity. In this work, the genetic variability of six populations of five knotweed species growing in Krasnoyarsk was studied. ISSR analysis revealed that the level of genetic diversity in the populations varies from 4.17 % to 35.83 % and has maximum values for genetically close species P. sabulosum (P = 35.83 %) and P. arenastrum (P = 22.5-30 %). Minimum values of genetic diversity were observed for populations of P. aviculare (P = 4.17 %) and P. calcatum (P = 5 %). The studied populations are characterized by a very high level of genetic differentiation (G = 0.78) and reliably belong to different species. On the similarity dendrogram (UPGMA), individuals of these species form clearly distinct clades. The genetic structure of populations using STRUCTURE also shows a reliable division of individuals into 5 clusters corresponding to the studied species. Phylogenetic analysis using the trnL-trnF chloroplast region shows the presence of a 5-nucleotide deletion and two transversions that makes it possible to divide the studied group of Polygonum into two morphologically different clusters. The first group is formed by P. arenastrum, P. calcatum, P. caspicum, P. sabulosum and characterized by the absence of a main shoot, a gradual reduction of leaves to the top of shoots and the perianth dissection by 1/2 of its length. The second group includes P. aviculare, P. boreale, P. neglectum, P rectum that have a main shoot, heterophilly, perianth dissection by 2/3-3/4 of its length. Two substitutions have been identified in the matK sequences, however it is less informative for solving taxonomic issues of the studied group.
Введение
Виды рода Спорыш - Polygonum L. - широко распространенные растения. Род характеризуется рядом биологических особенностей, которые способствуют чрезвычайной вариабельности признаков и формированию большого количества видов и форм спорышей. Это высокая фенотипическая пластичность признаков, обусловленная различными условиями обитания в пределах обширных ареалов видов, приводящая к формированию рас, обладающих морфологическим своеобразием (Yurtseva, Kramina, 2003); самоопыление, когда даже мелкие уклонения признаков иногда оказываются наследственно устойчивыми (Voroshilov, 1954; Yurtseva, 1998); межвидовая гибридизация, которая осуществляется между видами не только одной, но и разных подсекций благодаря возможности редкой ксеногамии при хазмогамии и частичной
протандрии (Voroshilov, 1954; Scholz, 1958; Styles, 1962, Yurtseva, 1998), чему способствует совпадающий у многих видов длительный период цветения. Благодаря этому спорыши достигли чрезвычайного полиморфизма и статуса сложной в таксономическом отношении группы. Трудностям в определении способствует и присущая р. Polygonum гетерокарпия (Yanishevskiy, 1927; Nikitina, 1965; Yurtseva et al., 1999).
Род Polygonum L. s. str. на территории Сибири представлен видами, относящимися по классификации И. Г. Серебрякова (Serebryakov, 1962, 1964) к монокарпическим травам с ассимилирующими побегами несуккулентного типа, не нуждающимися в опоре - однолетними травянистыми монокарпиками. Все сибирские виды рода относятся к секции Polygonum = Avicularia Meissn. (Meissner, 1826), типовой секции. Секция насчитывает около 50 видов (Yurtseva et al., 2010). Полиморфизм видов, вызванный процессами
гибридизации и самоопылением, способствующим стабилизации гибридов, а также мелкие размеры растений, «скрывающие» диагностические признаки, приводят к затруднениям в определении видов. В данном случае на помощь методам классической систематики, основанной на анализе морфологических признаков, могут прийти методы молекулярно-генетического анализа. О значительной степени генетической обособленности видов спорышей может свидетельствовать их высокое видовое разнообразие на ограниченной территории. В качестве такой территории нами был выбран г. Красноярск.
Цель настоящей работы состояла в изучении генетического полиморфизма популяций и филогении видов секции Polygonum с использованием ISSR и хлоропластных маркеров.
Материалы и методы
Объектами исследования служили популяции спорышей, произрастающие в г. Красноярске: две популяции Polygonum arenastrum Boreau (PAR 1-PAR 2), по одной популяции P aviculare L. (PA), P calcatum Lindm. (PC), P sabulosum Vorosch. (PS), P. caspicum Kom. (PCS). В каждой популяции было отобрано по 9-10 особей. Для сравнения использовался образец P evenkiense Tupitz. et Juzefovich, собранный в 45 км от пос. Ва-навара (Эвенкийский р-н Красноярского края). Для филогенетических исследований дополнительно использовались образцы P. boreale (Lange) Small, P. neglectum Besser, P rectum (Chrtek) Scholz (табл. 1).
Таблица 1
Исследованные популяции и особи видов секции Polygonum и номера секвенированных последовательностей ДНК в базе данных GenBank
Название таксона Местонахождение Координаты matK trnL-trnF
Polygonum arenastrum (PARI) г. Красноярск, Красной Армии, 15 56°00'47.8" с. ш. 92°50'48.5" в. д. OR463362 OR463368
Polygonum arenastrum (PAR2) г. Красноярск, ул. Горького, 14 56°01'28.4" с. ш. 92°84'85.5" в. д. - -
Polygonum aviculare (PA) г. Красноярск, Академгородок, 25 55°59'45.6" с. ш. 92°45'55.9" в. д. OR463363 OR463369
Polygonum calcatum (PC) г. Красноярск, ул. Дорожная, 6Б 56°01'38.5" с. ш. 92°49'42.7" в. д. OR463364 OR463370
Polygonum sabulosum (PS) г. Красноярск, ул. Дорожная, 6Б 56°01'38.5" с. ш. 92°49'42.7" в. д. OR463365 OR463371
Polygonum capsicum (PCS) г. Красноярск, ул. Декабристов, 36 56°01'27.5" с. ш. 92°84'63.6" в. д. OR463367 OR463373
Polygonum neglectum г. Красноярск, ул. Куйбышева, 85 56°01'12.7" с. ш. 92°49'40.4" в. д. - OR463374
Polygonum boreale г. Красноярск, Академгородок, 25 55°59'45.6" с. ш. 92°45'55.9" в. д. - OR463375
Polygonum rectum г. Красноярск, ул. Куйбышева, 85 56°01'12.7" с. ш. 92°49'40.4" в. д. - OR463376
Polygonum evenkiense (PE) Красноярский край, Эвенкийский р-н, 45 км от пос. Ванавара, 40 м восточнее скважины № 8 Пайгинского НГМ 60°13'01.9'' с. ш. 102°53'06.1" в. д. OR463366 OR463372
Исследования проводились в лаборатории молекулярно-генетических методов и биотехнологии ИФБиБТ СФУ. Экстракцию тотальной ДНК производили из 10 мг сухой растительной ткани с помощью коммерческого набора DiamondDNA (ООО «Научно-производственная фирма "Алтайбиотех"», Барнаул). Для изучения генетической изменчивости популяций использовался ISSR-PCR (Inter Simple Sequence
Repeats) метод. Для анализа было отобрано 7 праймеров (Mansour et al., 2009; Paterson et al., 2009), обладающих высоким уровнем полиморфизма и дающих воспроизводимый результат (табл. 2).
Амплификацию проводили в 20 мкл реакционной смеси, включающей: 10 мкл готовой PCR-смеси (ООО «Биолабмикс», Новосибирск), 6 мкл воды, 2 мкл ДНК и 2 мкл праймера. Программа
Таблица 2
Характеристика праймеров, использованных для ISSR-PCR анализа
Название Последовательность Общее количество Количество Процент
праймера 54 3' амплифицированных полиморфных полиморфных
фрагментов ДНК локусов локусов
17898А (CA)^AC 16 13 81,25
17898В (CA)^GT 11 10 91
НВ10 (GA^CC 11 9 81,8
НВ11 (GT^CC 18 18 100
НВ12 (CAC)3GC 14 12 85,7
НВ14 (CTCXGC 14 14 100
ISSR-23 (AC)8TA 15 13 86,6
амплификации: 95 °С (5 мин); 13 циклов: 95 °С (20 с), 55 °С (45 с, понижение температуры на 0,7 °С в каждом последующем цикле), 72 °С (90 с); 25 циклов: 95 °С (20 с), 44 °С (30 с), 72 °С (90 с); 72 °С (7 мин). Разделение продуктов амплификации производили в 1,8%-м агарозном геле, в горизонтальной электрофорезной камере в TAE-буфере при 90V с применением бромистого этидия. Визуализацию продуктов амплификации проводили в проходящем УФ-излучении с помощью системы гель-документирования Gel Doc XR (Bio-Rad, USA). Для определения длины амплифицированных фрагментов использовали ДНК-маркеры (ООО «Биолабмикс», Новосибирск).
Электрофореграммы анализировали с помощью программы Quantity One 1-D Analysis Software. При этом учитывали только воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы Popgene version 1.32 (расчет уровня полиморфизма (P), генного разнообразия Нея (He), индекса Шеннона (Io), генетических дистанций Нея (D), показателя подразделенности популяций (Gst)). Дендро-грамма сходства популяций строилась при помощи компьютерной программы TFPGA version 1.3 невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA - unweighted pair-group method using arithmetic average).
Для оценки генетической структуры популяций на основе данных ISSR-PCR анализа был использован байесовский подход (MCMC: Марковская цепь Монте-Карло), реализованный в программном обеспечении STRUCTURE версии 2.3.4 (Pritchard et al., 2000). Использовалось длительное выгорание (Burn-In) - 40000 циклов и MCMC - 120000 циклов. Количество возможных кластеров (К) тестировалось от 2 до 12 в двенад-
цати повторностях. Оптимальное количество кластеров оценивалось с помощью ДК (Evanno et al., 2005), вычисления которого доступны на софте STRUCTURE HarvesterWeb 0.6.94 (Earl, von Holdt, 2012).
Для определения филогенетических отношений между исследуемыми образцами секвени-ровали хлоропластные участки ДНК: matK (ген белка Maturase К) c использованием пары праймеров 1R_KIM и 3F_KIM (Costion et al., 2011) и межгенный спейсер trnL-trnF (между генами транспортных РНК, переносящими лейцин и фенилаланин) с использованием пары прайме-ров (e / f) (Taberlet et al., 1991). Амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси: 25 мкл ddH2O, 21 мкл ПЦР-смесь (ООО «Биолабмикс», Новосибирск), 2 мкл ДНК, 1 мкл каждого прай-мера (10мМ) по следующей программе: 95 °С (3 мин); 35 циклов: 95 °С (20 с), 59 °С (30 с), 72 °С (30 с); 75 °С (5 мин). Определение нуклеотидных последовательностей проводили методом Сэн-гера на секвенаторе ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, MD, USA) (г. Новосибирск). Полученные последовательности ДНК депонировали в базе данных «GenBank» (см. табл. 1). На основе данных секвенирования были построены филогенетические деревья с использованием алгоритма максимального правдоподобия (ML) и модели нуклеотидных замен Тамуры-Нея (TN93) (Tamura, 1993) в программе MEGA X (Kumar et al., 2018) со значением параметра бут-стрэпа 5000.
Помимо секвенированных последовательностей для построения филогенетических деревьев в банке NCBI было отобрано 16 последовательностей близкородственных видов р. Polygonum. В качестве аутгруппы была выбрана гречиш-ка многоцветковая Fallopia multiflora (Thunb.) K. Haraldson. При поиске мутаций их положение
определялось при выравнивании секвенирован-ных нами образцов на соответствующую последовательность MZ748474 Polygonum aviculare из базы данных GenBank.
Результаты исследований ISSR-PCR анализ
В ходе ISSR-PCR анализа с использованием 7 праймеров выявлено 99 фрагментов ДНК, процент полиморфизма которых суммарно составляет 90 % (табл. 3). Число амплифицированных фрагментов ДНК, в зависимости от праймера, варьировало от 11 (HB10, 17898В) до 18 (HB11).
Генное разнообразие Нея (He) в суммарной выборке составляет 0,22, индекс Шеннона (Io) -0,34. Уровень генетического разнообразия в популяциях варьирует от 4,17 % до 35,83 % и имеет максимальные показатели в популяции P. sabulosum (PS1) (P = 35,83 %; He = 0,12; Io = 0,18). Также высокий уровень полиморфизма отмечен для двух популяций P. arenastrum (PAR1 - PAR2) (P = 22,5-30 %; He = 0,06-0,12; Io = 0,10-0,18). Минимальные значения генетического разнообразия зафиксированы для популяций P aviculare (PA1) (P = 4,17 %; He = 0,01; Io = 0,02) и P. calcatum (P = 5 %, He = 0,01; f = 0,02) (табл. 3).
Таблица 3
Показатели внутрипопуляционного генетического разнообразия видов секции Polygonum
Показатели PAR1 PAR2 PA PC PS PCS Все популяции
P, % 22,5 30 4,17 5 35,83 25 90
H ± SD 0,06 ± 0,12 0,12 ± 0,19 0,01± 0,07 0,01 ± 0,07 0,12 ± 0,18 0,02 ± 0,09 0,22 ± 0,19
I ± SD 0,10 ± 0,19 0,18 ± 0,28 0,02 ± 0,10 0,02 ± 0,11 0,18 ± 0,26 0,03 ± 0,12 0,34 ± 0,27
Примеч.: Р - процент полиморфных локусов; Не - генное разнообразие Нея; 1о - индекс Шеннона; 8Б - стандартные отклонения.
На следующем этапе был проведен анализ генетических различий между исследуемыми популяциями близкородственных видов спорышей (табл. 4). Для этого использовались показатель генетических дистанций М. Нея (№1, 1972) (Б) и коэффициент подразделенности популяций (С^).
Выявлено, что генетические дистанции Нея максимальны между популяциями P. aviculare и P. caspicum (D = 0,37), а также между P. caspicum и P. calcatum (D = 0,34). Генетически близки друг другу популяции P. arenastrum (PAR1 и PAR2) и P. sabulosum (PS) (D = 0,09-0,11).
Таблица 4
Степень генетической дифференциации (Gst) (над диагональю) и дистанции Нея (под диагональю) между видами секции Polygonum на основе ISSR-PCR анализа
Pop PAR1 PAR2 PA PC PS PCS
PAR1 **** 0,25 0,61 0,57 0,28 0,55
PAR2 0,05 **** 0,64 0,57 0,31 0,57
PA 0,28 0,26 **** 0,90 0,62 0,81
PC 0,21 0,21 0,30 **** 0,58 0,79
PS 0,09 0,11 0,26 0,22 **** 0,51
PCS 0,25 0,27 0,37 0,34 0,23 ****
Анализ значений коэффициентов подразделенности популяций (Gst) (табл. 4) при их попарном сравнении показал высокую степень генетической дифференциации спорышей. Значения Gst варьируют от 0,28 до 0,9. Видовое сходство демонстрируют только популяции P. arenastrum (PAR1) и P. sabulosum (PS) (Gst = 0,28). Общий показатель подразделенности популяций (Gst) для всей выборки составил 0,7675. Это говорит
о том, что на долю межпопуляционного разнообразия приходится 76,75 %, а изученные популяции показывают очень высокую степень дифференциации и достоверно разделяются на разные виды.
Дендрограмма сходства популяций, построенная на основе данных ISSR-PCR анализа, представлена на рисунке 1. Минимальные генетические расстояния характерны для двух попу-
ляций одного вида P. arenastrum (PARI и PAR2). Близки к ним популяции P. sabulosum (PS) и P. calcatum (PC). Обособленным от других является P caspicum. Высокие значения бутстрепа (82-97 %) позволяют нам сделать выводы о четких генетических отличиях изученных видов.
При построении дерева по отдельным представителям наблюдается аналогичная картина (рис. 2). Особи разных видов формируют четко обособленные группы. Генетическая близость также характерна для P. arenastrum и P. sabulosum. Минимальные генетические дистанции наблюдаются между особями внутри популяций P. calcatum, P. caspicum, P. aviculare. Высокий уровень полиморфизма отмечен для P. sabulosum и P. arenastrum, что, возможно, связано с их гибридогенным происхождением.
Анализ структуры распределения генотипов особей в программе STRUCTURE показывает, что исследуемые образцы достоверно можно разделить на 5 кластеров (K = 5, ДК = 60,81). На гистограммах вероятностей (рис. 3) при разделении популяций на 5 кластеров все изучаемые виды четко отделяются друг от друга. Можно отметить возможное гибридогенное происхождение 51 образца, представленного видом P. even-kiense. Аналогичное положение наблюдается и у 52 образца P. caspicum.
Филогенетический анализ
Для построения филогенетических деревьев, помимо исследуемых видов, были дополнительно использованы собранные нами образцы видов P. boreale, P. neglectum, P. rectum. Филогения строилась по молекулярным маркерам matK, trnL-trnL.
При обработке последовательностей наших образцов по участку matK длиной 699 п. н. было выявлено только две нуклеотидных замены. У видов P. aviculare и P. evenkiense обнаружена замена тимина на цитозин в положении 918. Polygonum evenkiense также отличается от других видов, в том числе загруженных из NCBI, по транзиции цитозина на тимин в положении 698 относительно начала гена. Вследствие этого P. evenkiense занимает обособленное положение на филогенетическом дереве.
Межгенные спейсеры обладают большей информативностью, поскольку могут накапливать большее количество мутаций, при этом не влияя на работоспособность генов. Так, уже во время выравнивания последовательностей участка trnL-trnF длиной 346 п. н. в MEGA-X, выявились SNP у P. arenastrum, P. sabulosum, P. calcatum, P. caspicum в виде двух трансверсий (A > C и G > T), также наблюдалась делеция в 5 п. н. (табл. 5).
Положение замены 63 103 166 167 168 169 170 214 228 244 252 303
OR463368 Polygonum arenastrum * G C - - - - - C A G T T
OR463369 Polygonum aviculare * G A T T T G A C A T T T
OR463375 Polygonum boreale * G A T T T G A C A T T T
0R463370 Polygonum calcatum * G C - - - - - C A G T T
OR463373 Polygonum caspicum * G C - - - - - C A G T T
OR463371 Polygonum sabulosum * G C - - - - - C A G T T
OR463376 Polygonum rectum * G A T T T G A C A T T T
OR463374 Polygonum neglectum * G A T T T G A C A T T T
OR463372 Polygonum evenkiensis * G A T T T G A C A T T T
NC063678 Polygonum plebeium G A T T T G A T A T T C
KR537745 Polygonum ramosissimum G C - - - - - C A G C T
KR537730 Polygonum equisetiforme A C T T T G A C A G T T
KR537759 Polygonum arenastrum G C - - - - - C A G T T
KU508749 Polygonum arenarium G C T T T G A C G G T T
KU508750 Polygonum boreale G A T T T G A C A T T T
MZ748474 Polygonum aviculare G A T T T G A T A T T C
Таблица 5
Вариабельность последовательностей ДНК межгенного спейсера trnL-trnF у различных видов р. Polygonum
Примеч.: * отмечены секвенированные нами последовательности.
Рис. 1. UPGMA-дендрограмма сходства популяций видов секции Polygonum на основе данных ISSR-PCR анализа. Генетическое расстояние рассчитано по формуле Нея (Nei, 1972). Цифрами обозначены значения бутстрэпа.
Рис. 2. UPGMA-дендрограмма сходства особей видов секции Polygonum из различных популяций на основе данных ISSR-PCR анализа. Цифрами обозначены значения бутстрэпа.
Рис. 3. Структура распределения генотипов спорышей по генетическим кластерам (апостериорная вероятность). По оси Х - номера образцов и обозначения популяций, по оси У - доля частот соответствующего кластера.
Примечательно, что подобное явление наблюдалось и у некоторых видов Polygonum, загруженных с платформы NCBI. В дальнейшем при построении филогенетического дерева по
участку £гпЬ-£гпБ за счет обнаруженных полиморфизмов исследуемые виды разделились на 2 кластера (рис. 4).
Рис. 4. Филогенетическое дерево видов р. Polygonum, построенное на основании сравнения последовательностей межгенного спейсера trnL-trnF хлоропластной ДНК методом максимального правдоподобия (ML). Цифрами обозначены значения бутстрэпа, красным цветом - секвенированные нами последовательности.
На полученном филогенетическом дереве по участку trnL-trnF в первую кладу вошли ранее определяемые как наиболее генетически близкие виды P. arenastrum, P. sabulosum и P. calcatum, а также P. caspicum. Во вторую кладу входят P. aviculare, P. neglectum, P. boreale, P. rectum, а также наиболее обособленный вид P. evenkiense. Следует отметить, что виды, входящие в полученные клады, имеют четкие морфологические отличия. Взятые из банка NCBI последовательности других видов спорышей адекватно вписываются в построенное филогенетическое дерево.
Обсуждение результатов
Таким образом, результаты молекуляр-но-генетического анализа с использованием ISSR, matK, trnL-trnF маркеров видов секции Polygonum показали, что независимо от географической близости произрастания и сходных местообитаний, изученные популяции имеют очень высокую степень дифференциации и достоверно относятся к разным видам.
ISSR-PCR анализом установлено, что к популяциям P. arenastrum близка популяция P. sa-bulosum. Об этом свидетельствуют низкие значения генетических дистанций Нея (D = 0,09-0,11) и коэффициента подразделенности популяций (G = 0,28-0,31). На дендрограмме сходства также обнаруживается близкое родство данных видов. О. В. Юрцева с соавторами (Yurtseva et al., 2006), отмечает, что P. arenastrum является гибридом P. calcatum и P. aviculare. Важно отметить, что P. calcatum и P. aviculare обладают наименьшим генетическим полиморфизмом, тогда как P. arenastrum и P. sabulosum, напротив, имеют высокие показатели изменчивости, что может свидетельствовать об их гибридогенном происхождении и обилии переходных форм. Причем из двух возможных родительских видов, приведенных в работе О. В. Юрцевой с соавторами (Yurtseva et al., 2006), к P. sabulosum и P. arenastrum наиболее близок P. calcatum.
Полученные в ходе ISSR-PCR анализа данные подтверждаются и филогенетическим анализом. Наиболее информативным маркером оказался межгенный спейсер trnL-trnF. На филогенетическом дереве также отмечается близкое расположение видов P. sabulosum, P. arenastrum и P. cal-catum, тогда как P. aviculare относится к другой кладе.
Филогенетичекий анализ показал, что рассмотренные представители секции Polygonum
разделяются на две клады, что подтверждает и морфологическая дифференциация указанных видов по признакам выраженности или отсутствия главного (прямостоячего, приподнимающегося, стелющегося) побега, наличия или отсутствия гетерофиллии и по степени расчленения околоцветника. В первую группу входят виды P. arenastrum, P. calcatum, P. caspicum, P. sabulo-sum. Для них характерны следующие признаки: главный побег не выражен, листья постепенно уменьшаются к верхушке побегов, околоцветник расчленен на 1/2 своей длины. Вторую группу формируют P aviculare, P. boreale, P. neglectum, P rectum, характеризующиеся выраженным главным побегом, гетерофиллией, расчленением околоцветника на 2/3-3/4 своей длины. Каждая группа включает исходные таксоны, обладающие таксономическим своеобразием, устойчивыми, константными признаками (Meerts et al., 1990; Yurtseva, Kramina, 2003), остальные виды (P. arenastrum, P. sabulosum) имеют признаки, свидетельствующие о гибридогенном происхождении.
Polygonum evenkiense (исследован один экземпляр) характеризуется толстоватыми, узколанцетными листовыми пластинками снизу с незаметными или едва заметными боковыми жилками, раструбами с 4-6 жилками, яйцевидным околоцветником, слабо блестящим плодом. Данное исследование предполагает гибридо-генную природу P. evenkiense. По данным ISSR анализа, вид содержит блоки генов P. aviculare (явная гетерофиллия и крупный околоцветник, расчлененный на 2/3), P. sabulosum (листья узкие), P. capsicum и P. arenastrum (нет сходных морфологических признаков). По данным филогенетического анализа, P. evenkiense близок к P. aviculare. Для подтверждения гибридогенной природы этого вида потребуются дальнейшие популяционные и филогенетические исследования.
Заключение
Проведенный ISSR-PCR анализ показал, что уровень генетического разнообразия в популяциях спорышей варьирует от 4,17 % до 35,83 % и имеет максимальные показатели для P. sabulosum (P = 35,83 %; He = 0,12; Io = 0,18). Минимальные значения генетического разнообразия зафиксированы для популяции P. aviculare (P = 4,17 %; He = 0,01; Io = 0,02). Изученные популяции характеризуются очень высоким уровнем генетиче-
ской дифференциации (G = 0,7675) и достоверно относятся к разным видам.
Анализ степени генетической дифференциации популяций близкородственных видов р. Polygonum на данном этапе исследований показал разделение на следующие виды: P. arenastrum, P. aviculare, P. calcatum, P. caspicum. Популяция P. sabulosum генетически близка к виду P. arenastrum.
Филогенетический анализ с использованием trnL-trnF маркера хлоропластной ДНК показал наличие 5-нуклеотидной делеции и двух трансверсий, позволяющих разделить изучаемую группу спорышей на два кластера. Первую группу формируют виды P. arenastrum, P. calcatum, P. caspicum, P. sabulosum, характеризующиеся отсутствием выраженного главного побега, уменьшением листьев к верхушке побегов и расчленением околоцветника на 1/2 своей длины. Во вторую группу входят P aviculare, P. boreale,
P. neglectum, P rectum с выраженным главным побегом, гетерофиллией, расчленением околоцветника на 2/3-3/4 своей длины. Вполне возможно, что данные группы относятся к разным подсекциям секции Polygonum. Однако для подтверждения этого требуются дополнительные морфологические и генетические исследования.
В целом, используемые в данных исследованиях молекулярные маркеры и методы показали полную адекватность и могут быть использованы при анализе видов секции Polygonum. Для филогенетических построений наиболее информативным является межгенный хлоропластный спейсер trnL-trnF. В последовательностях гена matK выявлено 2 замены, он является менее пригодным для решения вопросов таксономии изучаемой группы. В дальнейшем планируется осуществить подбор дополнительных молекулярных маркеров для филогенетического анализа.
REFERENCES / ЛИТЕРАТУРА
Costion C., Ford A., Cross H., Crayn D., Harrington M., Lowe A. 2011. Plant DNA barcodes can accurately estimate species richness in poorly known floras. PLoS One. 6(11): e26841. DOI: 10.1371/journal.pone.0026841
Earl D. A., von Holdt B. M. 2012. Structure harvester: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method. Conservation Genetics Resourses 4: 359-361. DOI: 10.1007/s12686-011-9548-7 Evanno G., RegnautS., Goudet J. 2005. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology 14(8): 2611-2620. DOI: 10.1111/j.1365-294X.2005.02553.x
Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. 2018. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 35: 1547-1549. DOI: 10.1093/molbev/msy096
Mansour A., Ismail H. M., Ramadan M. F., Gyulai G. 2009. Variations in tomato (Lycopersicon esculentum) cul-tivars grown under heat stress. Journal für verbrauchersschutz und lebensmittelsicherheit 4: 118-127. DOI: 10.1007/ s00003-009-0474-5
Meerts P., Briane J. P., Lefebvre C. 1990. A numerical taxonomic study of the Polygonum aviculare complex (Po-lygonaceae) in Belgium. Plant Systematics and Evolution 173: 71-89. DOI: 10.1007/BF00937764
Meissner C. F. 1826. Monographiae Generis Polygoni Prodromus. Genevae. 117 pp. DOI: 10.5962/bhl.title.51543 Nei M. 1972. Genetic distance between populations. The American Naturalist 106: 283-292. DOI: 10.1086/282771 Nikitina K. K. 1965. About seed reproduction of knotgrass. In: Uchenye zapiski Ulyanovskogo pedagogicheskogo instituta [Memoir of Ulyanovsk Pedagogical Institute] 20, 6: 31-37. [In Russian] (Никитина К. К. О семенном размножении спорыша // Ученые записки Ульяновского педагогического института, 1965. Т. 20, вып. 6. С. 31-37).
Paterson I. D., Downie D. A., Hill M. P. 2009. Using molecular methods to determine the origin of weed populations of Pereskia aculeata in South Africa and its relevance to biological control. Biological Control 48(1): 84-91. DOI: 10.1016/j.biocontrol.2008.09.012
Pritchard J. K., Stephens M., Donnelly P. 2000. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics 155: 945-959. DOI: 10.1093/genetics/155.2.945
Scholz H. 1958. Die systematic des europäichen Polygonum aviculare L. I. Die Zweiteilung des P aviculare nach Lindman und der Formenkreis des P. aequale Lindman. Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft 71(10): 427434.
Serebryakov I. G. 1962. Ekologicheskaya morfologiya rasteny. Zhiznennyye formy pokrytosemennykh i khvoynykh [Ecological morphology of plants. Plant life-form of angiosperms and conifers]. Moscow: Vysshaya shkola. 378 pp. [In Russian] (Серебряков И. Г. Экологическая морфология растений. Жизненные формы покрытосеменных и хвойных. М.: Высшая школа, 1962. 378 с.).
SerebryakovI. G. 1964. Plant life-form of Embryophyta and their study. In: Polevayageobotanika [Fieldgeobotany]. Vol. 3. Moscow: AN SSSR. Pp. 146-205. [In Russian] (Серебряков И. Г. Жизненные формы высших растений и их изучение // Полевая геоботаника. Т. 3. М.: АН СССР, 1964. С. 146-205).
Styles В. Т. 1962. The taxonomy of Polygonum aviculare and its allies in Britain. Watsonia 5(4): 177-214.
Taberlet P., Gielly L., Pautou G., Bouvet J. 1991. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology 17: 1105-1109. DOI: 10.1007/BF00037152
Tamura K., Nei M. 1993. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 10(3): 512-526. DOI: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040023
Voroshilov V. N. 1954. For systematics of knotgrasses of Center of European part of USSR. Byull. Glavn. bot. sada (Moscow) [Bulletin of the Main Botanical Garden] 18: 97-108. [In Russian] (Ворошилов В. Н. К систематике спорышей Средней полосы европейской части СССР // Бюл. Глав. ботан. сада, 1954. Вып. 18. С. 97-108).
Yanishevskiy D. Ye. 1927. On the characterization of Polygonum salsugineum M. V. and heterocarpia in the genus Polygonum of the section Avicularia Meisn. Izvestiya Saratovskogo obshchestva yestestvoispytateley [News of the Saratov Society of Naturalists] 2, 1: 16-19. [In Russian] (Янишевский Д. Е. К характеристике Polygonum salsugineum M. V. и гетерокарпии у рода Polygonum секции Avicularia Meisn. // Известия Саратовского обш-ва естествоиспытат., 1927. Т. 2, № 1. С. 16-19).
Yurtseva O. V. 1998. Self-pollination in species of Polygonum aviculare L. relationship (Polygonum subsection Polygonum). Byull. Moskovsk. Obshch. Isp. Prir., Otd. Biol. [Bull. Moscow Soc. Natur. Biol. Ser.] 103, 5: 61-67. [In Russian] (Юрцева О. В. Самоопыление у видов родства Polygonum aviculare L. (Polygonum subsect. Polygonum) // Бюл. МОИП. Отд. биол., 1998. Т. 103, вып. 5. С. 61-67).
Yurtseva O. V., Kramina T. Ye. 2003. Variability of species of subsection Polygonum of the genus Polygonum (Po-lygonaceae) due to possible hybridization. Bot. Zhurn. 88(1): 9-25. [In Russian] (Юрцева О. В. Крамина Т. Е. Изменчивость видов подсекции Polygonum рода Polygonum (Polygonaceae) в связи с возможной гибридизацией // Бот. журн., 2003. Т. 88, № 1. С. 9-25).
Yurtseva O. V., Troitskiy A. V., Bobrova V. K., Voylokova V. N. 2010. To the revision of the system of the genus Polygonum L. s. str. (Polygonaceae): molecular and morphological data. Bot. Zhurn. 95(2): 226-247. [In Russian] (Юрцева О. В., Троицкий А. В., Боброва В. К., Войлокова В. Н. К ревизии системы рода Polygonum L. s. str. (Polygonaceae): молекулярные и морфологические данные // Бот. журн., 2010. Т. 95, № 2. С. 226-247).
Yurtseva O. V., Voylokova V. N., Troitskiy A. V., Bobrova V. K. 2006. Morphological variability and genetic polymorphism of species of Polygonum aviculare relationship (Polygonaceae). Bot. Zhurn. 91(5): 697-716. [In Russian] (Юрцева О. В., Войлокова В. Н., Троицкий А. В., Боброва В. К. Морфологическая изменчивость и генетический полиморфизм видов родства Polygonum aviculare (Polygonaceae) // Бот. журн., 2006. Т. 91, № 5. С. 697-716).
Yurtseva O. V., Yakovleva N. D., Ivanova-Ragkevich T. I. 1999. Heterocarpy in Polygonum aviculare L. s. str. and related species (Polygonum subsect. Polygonum). Byull. Moskovsk. Obshch. Isp. Prir., Otd. Biol. [Bull. Moscow Soc. Natur. Biol. Ser.] 104, 2: 13-20. [In Russian] (Юрцева О. В., Яковлева H. Д., Иванова-Радкевич Т. И. Гетерокарпия у Polygonum aviculare L. и близких видов (Polygonum subsect. Polygonum) // Бюл. МОИП. Отд. биол., 1999. Т. 104, вып. 2. С. 13-20).
