Генетический анализатор для фрагментного анализа ДНК Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2012, том 22, № 4, с. 86-92 = ПЦР-, ДНК-АНАЛИЗ -

УДК 543.426; 543.9

© Я. И. Алексеев, Ю. В. Белов, О. П. Малюченко, Ю. А. Монахова, А. Н. Натыров, В. А. Орехов, С. В. Коновалов, В. Е. Курочкин, А. И. Петров

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗАТОР ДЛЯ ФРАГМЕНТНОГО

АНАЛИЗА ДНК

Разработан макет генетического анализатора, в котором используется метод разделения молекул нуклеиновых кислот в жидкой полимерной фазе одновременно в 8 капиллярах под воздействием высокого напряжения с пятицветной лазер-индуцированной флуоресцентной детекцией. Разработаны наборы реактивов для спектральной калибровки анализатора и для фрагментного анализа ДНК.

Кл. сл.: ДНК, генетический анализатор, флуоресцентная детекция

ВВЕДЕНИЕ

Совокупность генетической информации, определяющей особенности организма, сосредоточена в его геноме в виде последовательностей нук-леотидов в составе информационных молекул (ДНК или РНК). Отдельные фрагменты информационных молекул, которые кодируют белки, называются генами.

В медицине данные о геноме позволяют точно идентифицировать возбудителей инфекционных заболеваний (вирусы, бактерии, паразиты), уточнять их биологические особенности (степень пато-генности), а также определять тактику лечения и профилактики (например, устанавливать чувствительность к определенным лекарственным препаратам).

Автоматизированные приборы для чтения последовательностей нуклеотидов в ДНК (секвени-рование ДНК) и анализа их отдельных фрагментов получили название генетических анализаторов (секвенаторов).

КОНСТРУКТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗАТОРА

Восьмикапиллярый генетический анализатор разрабатывается в ИАП РАН на основе однока-пиллярного анализатора НАНОФОР® 05 [1-4].

Создан макет анализатора, позволяющий выполнить одновременно генетический анализ восьми образцов. Внешний вид макета представлен на рис. 1. Технические решения защищены патентами [5, 6], патентообладатель — ИАП РАН.

Анализатор содержит компоненты, показанные на функциональной схеме (рис. 2).

Основными узлами анализатора являются:

- позиционер — система двигателей, обеспечивающих двухмерное перемещение планшета с пробами и вспомогательными растворами (вода, буфер);

- термостатируемая кассета — устройство, в котором закрепляется и термостатируется линейка капилляров;

- устройство заполнения капилляра гелем;

- высоковольтный источник (ВВИ), создающий электрическое поле в капилляре и обеспечивающий как внесение пробы в капилляр, так и разделение ДНК в капилляре;

- лазер-индуцированный флуориметрический детектор, состоящий из лазера, системы зеркал, фильтров, линз и фотоэлектронных умножителей.

Рис. 1. Внешний вид макета генетического анализатора

Детектор лазер-индуиироданный флуорипетрический

Флюоресценция пробы

Устройство заполнения капилляра гелем

Контейнер анодного буфера Н/=0 В)

I

Контейнер с гелем

Излучение позера Ш ни. 20 мВт

Кассета термостатируемая Ы30..60Х

Заполнение капилляров гелем перед анализом

Движение пробы в геле

под действием напряжения

Линейка капилляров

Источник высоковольтный

4-20 кВ

%-луночный планшет с продай, емкости катодного буфера, промывочной воды, сдраса геля

Позиционер <8 © ¿у-Ж мм

Рис. 2. Функциональная схема макета генетического анализатора

Для электрофоретического разделения фрагментов нуклеиновых кислот использованы кварцевые капилляры, заполненные раствором геля. Капилляры с электродами опускаются в лунки планшета с растворами исследуемых образцов, и высоковольтный источник тока обеспечивает электрокинетическое введение пробы в капилляр (отрицательно заряженная ДНК движется из раствора в гель к положительно заряженному электроду, находящемуся на противоположном конце капилляра). Далее под действием электрического поля происходит разделение внесенных в капилляр фрагментов ДНК. Ранее при проведении реакции секвенирования в состав разделяемых фрагментов нуклеиновых кислот введены флуоресцентные красители. При достижении флуоресцентно-меченными фрагментами ДНК оптического окна, находящегося вблизи конца капилляра (более короткие фрагменты достигают его быстрее, а более длинные — медленнее), лазером производится возбуждение флуоресцентных красителей в составе ДНК, а регистрация флуоресценции — детектором. При этом в случае разделения секвенсной смеси отдельный цвет пика на электрофореграмме соответствует определенному нуклеотиду, а последовательность пиков представляет собой последовательность расшифровываемого (секвенируемого) участка ДНК. Полученные от детектора данные обрабатываются с помощью специального программного обеспечения и выдаются пользователю в заданном виде. Данный метод является очень

точным и обеспечивает эффективное разделение отличающихся лишь на один нуклеотид фрагментов ДНК в диапазоне длин от 20 до 1000 нуклео-тидов.

Основным отличием вновь разработанного анализатора является наличие устройства сканирования капилляров. В этом устройстве использован кулачковый привод платформы, на которой установлены микрообъектив и зеркало.

Для фокусирования лазера на капиллярах и сбора флуоресценции используется конфокальная оптическая схема. Устройство сканирования обеспечивает возбуждение флуоресцентных красителей и одновременную регистрацию флуоресценции последовательно при совпадении фокуса микрообъектива с центром каждого капилляра. Регистрация флуоресценции осуществляется однока-нальными фотоэлектронными умножителями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Макет разработанного анализатора позволяет регистрировать флуоресценцию красителей в пяти каналах детекции, суммированных в таблице.

Интерференционные фильтры каналов № 1-4 соответствуют максимумам флуоресценции красителей, используемых при анализе продуктов реакции секвенирования и фрагментном анализе, а фильтр канала № 5 — красителю, входящему в состав фрагментов маркера молекулярного веса.

Каналы детекции сигнала флуоресценции

№ Длина волны максимума пропускания фильтра, нм Детектируемые флуоресцентные красители

1 520 FAM, R110, AlexaFluoro-488

2 550 R6G, JOE, VIC, HEX

3 580 TAMRA, NED, Cy3

4 610 ROX

5 650 LIZ, Cy5, DY632

3 300 2 250 2 200 2 150 2 100 2 050 2 000 1 960

Время, С

Рис. 3. Пример разделения смеси 6-РАМ-Т100

и 6-РЛМ-Т101 в 6 % ПДМА.

Напряженность электрического поля — 250 В/см

Для обеспечения процесса разделения фрагментов ДНК в капилляре был приготовлен специальный гель — водный раствор линейного поли-диметилакриламида (ПДМА). Линейный ПДМА был получен путем свободнорадикальной полимеризации диметилакриламида по стандартной методике, описанной ранее [7]. Был приготовлен раствор ПДМА с содержанием геля 6 %. Разрешающую способность полимера оценивали с помощью тестовой смеси синтетических фрагментов олиготимиди-латов длиной 100 и 101 нуклеотидов, содержащих на 5'-конце флуоресцентный краситель 6-карбокси-флуоресцеин (БАМ) (рис. 3). Разрешающую способность раствора полимера рассчитывали по

Время, с

Р ис. 4. Пример разделения спектрального калибратора СК-5.

Напряженность электрического поля — 280 В/см

формуле

Л, = 1/2-№ + ^^2) / АХАМ,

где Л, — разрешение; Wh1 и Wh2 — ширина на половине высоты пиков 1 и 2, с; АМ — разность размеров фрагментов в нуклеотидах; АХ — расстояние между пиками, с.

Рассчитанное значение разрешающей способности смеси 6-БАМ-Т100 и 6-БАМ-Т1Ш в 6 % ПДМА составило 1.58.

Для учета и нормализации свечения флуоресценции красителей в соседние каналы детектирования, так называемой спектральной калибровки генетического анализатора, было разработано два

набора флуоресцентно-меченных фрагмента ДНК. Один, предназначенный для калибровки с целью проведения фрагментного анализа, состоит из пяти фрагментов ДНК длиной 62, 82, 94, 106, 120 нуклеотидов, меченных красителями DY632, ROX, TAMRA, R6G и FAM — спектральный калибратор 5 (СК-5). Результаты разделения этого спектрального калибратора представлены на рис. 4.

Второй калибратор, предназначенный для анализа продуктов реакции секвенирования, состоит из четырех фрагментов ДНК длиной 21, 32, 47 и 66 нуклеотидов, содержащих красители с резонансным переносом энергии флуоресценции FAM-ROX, FAM-TAMRA, FAM-R6G и FAM [8] — спектральный калибратор 4 (СК-4). Результат его разделения представлен на рис. 5.

1-й i 1

0 8 ____\_____|_____

3 б

0.4. ___ 1 1

|

02

0 А . Г J 1 7 V А V

25 2 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Время, мин

б

Время, мин

Рис. 5. Пример разделения спектрального калибратора СК-4.

а — сырые данные, б — данные после обработки. Напряженность электрического поля — 280 В/см

Рис. 7. Пример разделения "аллельной лестницы". Напряженность электрического поля — 280 Вт/см

2 ООО 2 200 2 400 2 600 2 000 3 000 3 200 3 400 3 600 3 860 4 000 4 200

Время, с

Рис. 6. Пример разделения маркера молекулярного веса М-450.

Напряженность электрического поля — 280 В/см

а

Для определения длин анализируемых фрагментов ДНК в диапазоне 60-450 нуклеотидов был разработан маркер молекулярного веса М-450, состоящий из 24 фрагментов различной длины, каждый из которых на 5'-конце содержал флуоресцентный краситель DY632. Пример разделения маркера М-450 приведен на рис. 6.

На рис. 7 приведены результаты электрофоре-тического анализа "аллельной лестницы" — фрагментов ДНК, представляющих собой полный набор вариантов коротких тандемных повторов 19 генов человека, используемых в международных панелях для генетической идентификации личности. Данные получены с помощью набора COrDIS Plus, производства ООО "Гордиз", Россия.

22 23 24 25

27 23 29303132333435 36 37 33

40 41 42 43

45 48 47 48

D21S11 I

VWA S]

к ji 1 ■ к- L* tijj

— I 1

22 3 24 25 26 27 28 23 30 31 32 33 34 35 3637 3 33 40 4 2 43 44 4 5 46 47 48 43 50

Время, мин

Рис. 8. Пример разделения продуктов амплификации образца МК-1, полученных с использованием набора COrDIS Plus

На рис. 8 показан результат разделения образца МК-5, представляющего собой смесь продуктов мультиплексной амплификации 20 локусов контрольной ДНК человека, входящей в состав набора COrDIS Plus. На электрофореграмме в форме пиков изображены амплифицированные фрагменты ДНК, соответствующие аллелям 19 STR-маркеров и пол-специфичного локуса амело-генина. Совокупность длин аллельных фрагментов описывает индивидуальный генетический профиль, уникальный для каждого человека за исключением монозиготных близнецов. Все маркеры, представленные на рис. 8, активно используются в судебной генетике и входят в состав двух стандартных международных панелей маркеров CODIS и ESS. Генетический профиль в данном формате может быть использован экспертами-генетиками для идентификации личности, анализа родства и сравнения следов биологического происхождения с криминалистической базой ДНК-профилей. Представленные результаты демонстрируют возможность использования прибора НА-НОФОР® 05 для решения этих задач.

Полученная в результате проведенных экспериментов скорость фрагментного анализа составляет 13.8 нуклеотидов в минуту или 830 нуклеотидов в час при напряженности электрического поля 280 В/см. При этом точность анализа составила ± 1 нуклеотид в диапазоне длин до 450 нуклеотидов.

Для генетического анализатора разработано программное обеспечение, которое рассчитано на работу в среде Windows XP и выше и позволяет задавать и контролировать значения высокого напряжения, тока через капилляры, температуры кассеты, времени анализа, скорости приема данных, а также детектировать флуоресценцию из пяти световых каналов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Подтверждены технические характеристики макета генетического анализатора:

- 5-цветная детекция красителей;

- возможность анализа фрагментов ДНК со скоростью 830 нуклеотидов в час и точностью ± 1 нуклеотид в диапазоне длин до 450 нуклеоти-дов.

2. Для макета генетического анализатора разработаны следующие материалы и наборы реагентов:

- гель для разделения фрагментов ДНК;

- спектральный калибратор для фрагментного анализа;

- спектральный калибратор для секвенирования ДНК;

- маркер молекулярного веса.

Генетический анализатор разрабатывается при выполнении ОКР "Разработка генетического анализатора для секвенирования и фрагментного анализа ДНК" на основании Государственного контракта № 16.522.12.2014 от 10 октября 2011 г. по заказу Министерства образования и науки РФ в рамках федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы" (шифр заявки "2011-2.2-522-014-001").

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Беленький Б.Г., Евстрапов A.A., Козулин РЛ. Влияние отраженного капилляром излучения лазера на чувствительность флуориметрического детектора капиллярного электрофореза // Научное приборостроение. 2001. Т. 11, № 2. С. 21-25.

2. Беленький Б.Г., Козулин Р.A., Курочкин В.Е., Золотарев В.М. Приборы аналитического контроля на основе комбинированного метода капиллярного электрофореза и флуоресценции // Оптический журнал. 2002. Т. 69, № 3. С. 69-77.

3. Беленький Б.Г., Козулин Р.A., Курочкин В.Е., Золотарев В.М. Аналитический метод определения последовательности ДНК (секвенирование) по спектральным флуоресцентным меткам // Оптический журнал. 2003. Т. 70, № 1. С. 65-68.

4. Генетический анализатор НАНОФОР® 05. URL: (http://www.iai.rssi.ru/nanofor03.php).

5. Флуориметрический детектор. Патент РФ на изобретение № 2182329 от 10.05.2002 г. Патентообладатель Институт аналитического приборостроения РАН.

6. Способ удаления внешнего полиимидного покрытия кварцевого капилляра. Патент РФ на изобретение № 2391303 от 05.11.2008 г. Патентообладатель Институт аналитического приборостроения РАН.

7. Chiari M., Riva S., Gelain A., Vitale A., Turati E. Separation of DNA fragments by capillary electrophore-sis in N-substituted polyacrilamides // J. Chromatogr. A. 1997. V. 781. P. 347-355.

8. Lee L.G., Spurgeon S.L., Heiner C.R. et al. New energy transfer dyes for DNA sequencing // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2816-2822.

ЗАО "СИНТОЛ", Москва (АлексеевЯ.И., Малючен-ко О.П., МонаховаЮ.А., Натыров А.Н.)

Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург (Белов Ю.В., Коновалов С.В., Курочкин В.Е., ПетровА.И.)

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхоз-академии, Москва (Алексеев Я.И., Малюченко О.П., Натыров А.Н.)

OОО "Гордиз", Москва (Орехов В.А.)

Контакты: Белов Юрий Васильевич, Материал поступил в редакцию 18.10.2012

[email protected]

GENETIC ANALYSER FOR DNA FRAGMENT ANALYSIS

Ya. I. Alekseev1'3, Yu. V. Belov2, O. P. Malyuchenko1'3, Yu. A. Monakhova1, A. N. Natyrov1'3, V. A. Orekhov4, S. V. Konovalov2, V. E. Kurochkin2, A. I. Petrov2

1JSC Syntol, Moscow

2Institute for Analytical Instrumentation ofRAS, Saint-Petersburg 3All-Russia Research Institute of Agriculture Biotechnology, Moscow 4Gordis, LLC, Moscow

The genetic analyser model was developed in which is used the method of nucleic acid molecules separation in the liquid polymer phase simultaneously in 8 capillaries, under the influence of the high voltage with five-colour laser-induced fluorescence detection. The reagents kits for spectral calibration of the analyser and for DNA fragment analysis were developed.

Keywords: DNA, genetic analyser, fluorescence detection