CC BY
551
ГЕНЕТИКА
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ВИРУСНОГО OHKOlEHEiA
A.B. ИТКЕС
Кафедра биологии и общей генетики РУДН. Москва, 117198, ул. Миклухо-Маклая, д. X.
Медицинский факультет
Данный обзор написан на основе актовой лекции, прочитанной автором в Российским университете дружбы народов. По зтой причине обзор не содержит литературных ссылок и в'целом имеет структуру, соответствующую именно лекционному сообщению Автор предлагает вниманию читателей изложенный здесь материал в качестве введения для серии статей в настоящем выпуске Вестника РУДИ, который в основном посвящен генетике различных заболеваний человека.
Обзор современных данных о молекулярных механизмах канцерогенеза, об основных ipynnax вирусных и клеточных онкогенов и о механизмах их действия. Рассмотрены структуры геномов основных г рупп онко-генных вирусов и приведен анализ механизмов канцерогенной активности для каждой из тгих групп.
Ключевые слова: онкогены, онкогенные вирусы, молекулярные механизмы онкогенеза.
1. ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ
Современная медико-биологическая наука достигла в последние десятилетия, а в наибольшей степени - в последние годы, огромных успехов в понимании молекулярных механизмов большого числа процессов, лежащих в основе как нормальной жизнедеятельности, так и многих заболеваний человека. Один из таких примеров - молекулярно-генетические механизмы онкогенеза, выяснение которых стало результатом усилий как собственно биологии и медицины, так и всего комплекса естественных наук. Именно такая координация усилий сделала возможными расшифровку генома человека, открытие и исследование канцерогенов, создание компьютерных методов диагностики и др.
Обычно все возникающие опухоли принято делить на спонтанные и индуцированные. В первую группу попадает большинство опухолей - те, для которых не установлена явная связь с индуцирующими агентами. Можно полагать, что все эти опухоли также индуцируются определенными воздействиями, но ограниченность наших знаний пока оставляет их вне этиологического анализа. Вторая группа опухолей может быть разделена па собственно индуцированные, т. е. возникшие в результате воздействия внешних индуцирующих факторов, и тс, которые развиваются в результате внутренних причин, в первую очередь - в результате генетической предрасположенности.
Данный обзор, рассматривающий молекулярные механизмы канцерогенеза, посвящен именно индуцированным опухолям.
Внешние воздействия, с помощью которых можно индуцировать опухоли, относятся к трем основным группам: канцерогенные вещества, облучение и опухолеродные вирусы.
Канцерогенные вещества не составляю! какой-либо определенной химической группы, но вызывают сходные биологические эффекты. Чаще всего они либо непосредственно стимулируют размножение клеток - предшественниц опухоли, либо вызывают изменения в ДНК, т. и. мутации, что приводит к изменению наследственной информации и в результате этого - также к стимуляции размножения клеток и потере механизмов контроля процесса размножения. К канцерогенам относятся как простые по структуре вещества, например, четыреххлористый углерод (СС14), так и относительно сложные полициклические и гетероциклические соединения, например, метилхолантрен или бензанграцен; к ним можно отнести также и продукты жизнедеятельности некоторых микроорганизмов.
Особую группу составляют вещества, способствующие росту возникших одиночных опухолевых клеток так называемые промоторы канцерогенеза. Промоторы - чрезвычайно важный компонент химического канцерогенеза, так как одиночные опухолевые
клетки, находясь в окружении нормальной ткани, как правило, неактивны. Промоторы снимают сдерживающее влияние нормальных клеток, что внешне выглядит как сильный канцерогенный эффект. Канцерогенные вещества (включая промоторы) являются причиной многих опухолей человека. Это гак называемый «рак трубочистов», вызываемый канцерогенами каменноугольного дегтя, рак мочевого пузыря у работников анилиновой промышленности и самый распространенной рак у человека - рак легких, вызываемый самой распространенной причиной - курением.
Облучение как фактор канцерогенеза связано, как и многие химические канцерогены, с изменениями в структуре ДНК. Наиболее часты при общем облучении организма так называемые лейкозы, то есть различные формы опухолей кроветворной системы. Более редкие формы - опухоли костей, следствие накопления в костях радиоактивного стронция, аналога кальция, и рак щитовидной железы — результат накопления в этой железе радиоактивного иода.
Опухолеродные вирусы — третья группа канцерогенных воздействий. Вирусы, как и высшие организмы, имеют собственную наследственную информацию, записанную в структуре ДНК или РНК, причем в основе современной классификации вирусов лежит именно то, какая «информационная» молекула присутствует у данного вируса и по какой схеме происходит реализация его наследственной информации. В настоящее время достоверно доказано наличие онкогенной активности у шести групп вирусов, это ДНК-содержащие семейства паповавирусов, аденовирусов, герпес-вирусов, вирус гепатита В и РНК-содержащие вирусы: обширная группа ретровирусов и вирус гепатита С.
Впервые опухолеродная активность вирусов была предсказана Львом Александровичем Зильбером (1894-1966) в рамках его вирусо-генетической теории канцерогенеза. Основной постулат этой теории предполагал, что вирусы вызывают образование опухоли не непосредственно, как при классических инфекционных заболеваниях, а в результате образования единого комплекса из наследственного аппарата клетки, т. е. ее молекулы ДНК, и ДНК вируса. Такой объединенный генетический аппарат начинает функционировать с отклонениями от нормы, что и приводит к индукции опухоли.
Сейчас, по прошествии нескольких десятилетий, мы видим, что эта идея нашла блестящее и исчерпывающее подтверждение. В рамках современных представлений о генетике опухолей сформулировано представление об онкогенах, т. е. генах, вызывающих канцерогенез; они делятся на две основные группы вирусные и клеточные онкогены. Вирусы, изменяя генетический аппарат клетки, способны активировать либо онкогены клегки-хозяина, либо свои собственные, в обоих случаях следствием такой активации становится рост опухоли.
Таким образом, вирусный онкогенез имеет генетическую основу. В связи с этим, прежде, чем обсуждать его механизмы, необходимо кратко охарактеризовать собственно онкогены, являющиеся основными «действующими лицами» в процессах индукции и роста опухоли.
2. ОНКОГЕНЫ И ОНКОБЕЛКИ
Первыми открытыми онкогенами были вирусные онкогены, являющиеся элементами генома ретровирусов — РНК-содержащих вирусов птиц, способность которых вызывать определенные опухоли была известна еще с начала XX века. Эта РНК содержит гены, кодирующие структурные вирусные белки и белки, необходимые для размножения вируса. Вирусные гены, как и клеточные гены, могут мутировать, создавая новые варианты генов и самих вирусов. Среди таких мутаций встречаются термозависимые мутации, которые проявляются только при определенной (т. н. «пермиссивной», или разрешающей) температуре. В начале 70-х годов были получены такие термозависимые мутанты вируса саркомы, которые трансформировали клетки только при пермиссивной температуре (трансформацией называется первая стадия образования опухоли). Это значит, что один из генов вируса был активен только при такой температуре. Более того, свойства
злокачественности этих клеток сохранялись только при пермиссивной температуре. Отсюда следовало, что одного гена вируса саркомы достаточно и для того, чтобы вызвать опухолевую трансформацию клетки, и для того, чтобы поддерживать ее. Инактивация этого гена в непермиссивной температуре возвращала клетку в нормальное состояние. Таким образом, в вирусе саркомы содержится один ген, вызывающий и поддерживающий злокачественность. Этот, тогда не идентифицированный еще ген был назван онкогеном, то есть опухолевым геном. Сравнение близких вариантов вируса, вызывающих и не вызывающих опухоль, то есть содержащих и не содержащих онкоген, прямыми мо-лекулярно-биологическими методами позволило идентифицировать участок РНК в ретровирусе, содержащий этот ген, а затем и выделить его.
Первый онкоген, выделенный таким путем - онкоген src вируса куриной саркомы Рауса. Вскоре было показано, что искусственное введение гена src в хромосомы нормальной клетки трансформирует ее без вируса. Вскоре после открытия src были открыты и другие вирусные онкогены: myc, ras, abl и многие другие. Стало ясно, что опухолевые вирусы вызывают опухоли не сами по себе, а внося в генетический аппарат клетки онкоген и закрепляя его в геноме клетки. Если онкоген удалить из генетического аппарата вируса, то вирус, не лишаясь способности размножаться и встраиваться в геном клетки, утрачивает способность трансформировать клетки.
Главный вопрос, который был поставлен на повестку дня этими открытиями, заключался в следующем: поскольку существуют опухоли как вирусного, так и невирусного происхождения, есть ли собственные онкогены в нормальных клетках высших организмов? Оказалось, что во всех нормальных клетках есть гены, очень близкие по структуре к вирусным онкогенам, - они были названы клеточными онкогенами, или протоонкогенами.
Клеточные онкогены являются элементами нормального генома, в том числе и человеческого. Они кодируют целый ряд белков (т. н. онкобелков), которые контролируют деление клеток и процессы дифференцировки, т. е. превращение неспециализированных клеток в специализированные - мышечные, нервные и т. д. С точки зрения поведения онкобелков превращение нормальной клетки в опухолевую представляет собой нарушение нормальной функции одного или нескольких из онкобелков, в результате чего клеточный рост выходит из-под контроля, ускоряется, клетка становится бессмертной, теряет ряд свойств, полученных при дифференцировке (т. е. становится похожа на эмбриональные клетки) и теряет чувствительность к «тормозящему» воздействию окружающих клеток. Такие события могут последовать как за чрезмерной активацией клеточных онкогенов (это - особая и весьма сложная группа процессов), так и за появлением в клетке вирусного онкогена, который продуцирует собственный онкобелок. В этом случае вирусный онкобелок занимает место своего клеточного аналога в цепи регуляции клеточных процессов, и его «неправильная» активность оказывается причиной возникновения опухоли. В табл. 1 приведены некоторые примеры клеточных онкобелков, их вирусных аналогов и выполняемых ими функций.
Сам факт присутствия аналог ичных генов в клеточных и вирусных геномах породил целый ряд остроумных и логически непротиворечивых идей относительно причин этой аналог ии. Рассмотрение этой проблемы выходит за пределы нашей темы, поэтому можно ограничиться лишь кратким замечанием: на сегодняшний день наибольшее подтверждение нашла точка зрения о том, что онкогены - первоначально чисто клеточные гены - были захвачены вирусами в результате инфекционных процессов и превращены в постоянные элементы вирусных геномов.
В данном случае активно работающий клеточный ген имеет собственный регулятор, т. н. промотор. Вирусный онкоген встраивается перед клеточным геном, и промотор начинает активировать этот онкоген, а не свой «собственный» клеточный ген.
Таблица 1
Функции некоторых вирусных и клеточных онкобелков.
ВИРУС ВИРУСНЫЙ ОНКОГЕН КЛЕТОЧНЫЙ ОНКОГЕН ФУНКЦИЯ ОНКОБЕЛКА
Саркомы Рауса v-src c-src Мембранный регуляторный белок, Туг-киназа
Саркомы обезьян v-sis с-sis Фактор роста
Эритробластоза птиц v-erbA, v-erbB c-erbA, c-erbB Рецептор фактора роста
Мышиной саркомы Кир-стена v-kras c-kras Цитоплазматический регуляторный белок
Мышиной саркомы Мо-пони v-mos c-mos Цитоплазматическая БегЛТи-киназа
Миелоцитоматоза птиц v-myc c-myc Т ранскрипционный фактор - регулятор активности ряда генов
Как уже было упомянуто выше, вирусы, изменяя генетический аппарат клетки, способны активировать либо онкогены клетки-хозяина, либо свои собственные. Некоторые схемы такой активации рассмотрены на рисунках 1 и 2.
Однако очевидно, что примеры, рассмотренные выше, не исчерпывают всех возможных вариантов активации онкогенов. Кроме того, они лишь в первом приближении описывают процесс и не дают представления о его деталях. Поэтому, переходя непосредственно к молекулярным механизмам вирусного канцерогенеза, эти механизмы целесообразно рассмотреть в отдельности для разных групп вирусов; этому и посвящены последующие разделы, где рассмотрены пять групп онкогенных вирусов: ДНК-содержащие семейства паповавирусов, аденовирусов, герпес-вирусов, вирусов гепатита и группа РНК-содержащих ретровирусов.
3. ПАПОВАВИРУСЫ Паповавирусы известны лучше многих других групп вирусов благодаря принадлежащим к этой группе подробно исследованным онкогенным вирусам - вирусу полиомы и SV40. Свое наименование «паповавирусы» группа получила от названий трех вирусов: вируса кроличьей папилломы, вируса полиомы (по) и вакуолизирующего (ва) обезьяньего вируса типа 40 (SV40). У человека перечисленные вирусы не вызывают заболеваний, хотя SV40 способен заражать клетки человека в культуре. Однако к этой же группе относятся и вирусы человека, наиболее важными из которых являются, по-видимому, вирусы папилломы человека (ВПЧ).
По современной классификации паповавирусы делятся на группы полиомавирусов (вирусы собственно полиомы, SV40 и др.) и папилломавирусов, к которым относится и ВПЧ, являющийся типичным ДНК-содержащим онкогенным вирусом.
На рис. 3 приведена схема генома вируса папилломы человека типа 16 (ВПЧ-16), котрый является основным этиологическим агентом, вызывающим у человека рак шейки матки. Геном ВПЧ-16 представлен ковалентно замкнутой кольцевой ДНК длиной около 8 тысяч нуклеотидных пар. Он содержит 8 идентифицированных генов, которые разделены на ранние (т. е. начинающие работать непосредственно при начале инфекционного процесса, обозначаются буквой Е от английского «early») и поздние (обозначаются буквой L от «late»).
А
Клеточная ДНК
Клеточный онкоген
Интеграция
Вирус
Клеточный онкоген
Л. Интеграция вирусного генома непосредственно перед клеточным онкогеном. В этом случае вирус, обладая мощными генетическими элементами, активирующими работу генов (т. н. промоторами и энхансерами), способен активировать клеточный онкоген в такой степени, что последний инициирует появление опухоли.
Б. Интеграция вирусного генома непосредственно в область регуляции активности клеточного онкогена (т. н. энхансер). В этом случае вирус может существенно усилить действие и энхансера, и регулируемого гш онкогена, что также приведет к воз-11 икновейию опухоли.
Рис. 1. Активация клеточного онкогена при встраивании (интеграции) вирусного генома или его отдельных -элементов в ДНК клетки
Клеточная ДНК
Активный промотор Активно работающий клеточный ген
Вирусный онкоген
Активный промотор Активно работающий клеточный ген
В данном случае активно работающий клеточный ген имеет собственный регулятор. Вирусный онкоген встраивается перед клеточным геном., и промотор начинает активировать этот онкоген, а не свой «собственный» клеточный ген
Рис.2. Активация вирусного онкогена при встраивании (интеграции) вирусного генома или его отдельных элементов в ДНК клетки.
Теряются при интеграции
Рис. 3. Схема генома вируса папилломы человека типа 16 (пояснения в тексте)
Попадание вируса в клетку
Клеточная ДНК
Вирусная
ДНК
I
Инфекционный процесс и первые стадии канцерогенеза
Вирусная ДНК
Клеточная ДНК
Вирусные онкогены Еб и Е7
Опухоль
Клеточная ДНК
Рис. 4. Переход вируса папилломы человека в интегрированное состояние при
канцерогенезе.
При попадании вируса внутрь клетки-хозяина кольцевая ДНК высвобождается из вирусной частицы и существует в клетке в двух состояниях, между которыми устанавливается определенное равновесие — в свободном состоянии и в виде интегрированного элемента клеточной ДНК. По-видимому, это равновесие характерно и для собственно инфекционного процесса, не связанного с образованием опухоли, и для начальных «предраковых» стадий канцерогенеза. Если процесс развивается по пути формирования злокачественной опухоли, то вирусный геном полностью переходит в интегрированное состояние и при этом теряет все свои гены за исключением Е6 и Е7, являющихся онкогенами ВПЧ. Схематически эти события представлены на рис. 4.
Трансформирующая (онкогенная) активность вирусных онкогенов Е6 и Е7 определяется следующим.
Онкобелок Е7 - консервативный, т. е. его структура практически одинакова у разных папилломавирусов, отрицательно заряженный, молекулярная масса — 11 килодаль-тон. Молекула Е7 способна связывать и инактивировать внутриклеточный белок Rb, обладающий антиопухолевой активностью, что приводит к индукции опухолевого роста. Помимо этого, онкобелок Е7 способен прямо активировать ряд генов, включая вирусные и клеточные онкогены.
Онкобелок Е6 - также консервативный, положительно заряженный, молекулярная масса 18 килодальтон; Е6 - главный онкоген папилломавирусов. При обычной (т. н. «продуктивной») вирусной инфекции содержание Е6 в клетке низко, иногда его нет вообще, но при переходе к процессу опухолеобразования его содержание существенно возрастает. Молекула Е6 способна связывать внутриклеточный белок р53, который, подобно Rb, обладает антиопухолевой активностью. При этом Е6 запускает особый внутриклеточный механизм, который уничтожает р53 внутри инфицированной клетки. Подобно Е7, онкобелок Е6 способен активировать ряд вирусных и клеточных онкогенов. Существенно, что одна из главных мишеней Е6 при активации клеточных генов - ген теломеразы, белка, который обеспечивает «бессмертие» живой клетки, точнее - способность клетки проходить неограниченное число делений. Эта способность является важнейшим отличием раковой клетки от нормальной, а все перечисленные процессы в сумме обеспечивают весьма высокую вероятность появления опухоли при папилломавирус-ной инфекции.
Таким образом, заражение ВПЧ действительно означает повышение вероятности злокачественных заболеваний и требует для инфицированных больных выделения их в особую группу риска.
4. АДЕНОВИРУСЫ
Хотя в вирусных частицах (т. н. вирионах) вирионах аденовирусов содержи тся почти в 5 раз больше ДНК, чем в папилломовирусах (около 40 тыс. нуклеотидных нар), и геном аденовирусов кодирует соответственно большее число белков, циклы репродукции этих вирусов в основном сходны. Гак, у аденовирусов, как и у паповавирусов, имеется механизм, контролирующий переключение синтеза ранних макромолекул на синтез поздних. Однако ДНК аденовирусов - линейная молекула (принципиальная схема генома аденовирусов рассмотрена на рис. 5.).
Гены аденовирусов распределены вдоль линейной ДНК, обозначенной на рисунке двумя прямыми с указанием 3’ и 5’ концов каждой из нитей ДНК. Эти гены разделены, как и у аденовирусов, на ранние «Е» и поздние «L». Каждому из генов на схеме соответствует несколько стрелок. Эти семейства стрелок означают, что каждый из генов кодирует не один тип РНК, а целую группу; в целом это касается и кодируемых аденовирусными генами белков, которые представлены несколькими молекулами для каждого гена.
Онкогенами аденовирусов являются ранние гены Ela и El в. Они, как и другие гены аденовирусов, кодируют целую группу онкобелков, основные из которых представлены на рис. 6.
Схема показывает, что есть несколько вариантов соединения кодирующих участков РНК. и, как следствие, образующихся зрелых белков (участки белков Ela обозначены черными прямоугольниками, El в - белыми). Показано также, ч то собственно трансформирующей (т. е. опухолеродной) активностью обладает Ela, причем для трансформации клетки вирусом нужен гораздо больший фрагмент генома, чем для трансформации индивидуальным геном (фрагментом ДНК).
Рис. 5. Схема генома аденовируса (пояснения в тексте)
Небезынтересно, что аденовирусы весьма разнообразны, они выделены от многих видов животных. Более того, от каждого из этих видов выделено много различных аденовирусов -так, среди аденовирусов человека идентифицирован 31 серологический тип.
Аденовирусы в основном вызывают острые респираторные заболевания; некоторые типы аденовирусов человека при введении хомячкам вызывают у них опухоли, почти все штаммы аденовирусов способны вызывать трансформацию фибробластов крысы в культуре, но ни один из этих вирусов не имеет отношения к злокачественным опухолям у человека. Это означает, что по сей день остается открытым вопрос о механизме превращения аденовируса из обычного инфекционного вируса в фактор канцерогенеза, по крайней мере, если говорить не о лабораторных линиях, а о природных популяциях аденовирусов.
5. ГЕРПЕСВИРУСЫ
Герпесвирусы — группа вирусов, в высшей степени разнообразная и многочисленная. Это - крупные вирусы с линейной геномной ДНК размером до 220 тысяч нуклеотидных пар. Из более чем 25 групп герпесвирусов только 6 достоверно вызывают заболевания человека: вирусы простого герпеса типов I и II, вирус герпеса типа 3 (вирус куриной оспы), вирус герпеса т ипа 4 (вирус Эпштейна-Барр), вирус герпеса типа 5 (цитомегало-вирус) и вирус герпеса типа 6.
В силу большого разнообразия этой группы вирусов при ее рассмотрении приходится ограничиться лишь одним конкретным примером - вирусом Эпштейна-Барр, который является наиболее выраженным опухолеродным вирусом в данной группе.
Вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ), как, впрочем, и другими герпесвирусами, инфицировано подавляющее большинство взрослого населения нашей планеты Наиболее известное неопухолевое заболевание человека, вызываемое этим вирусом - инфекционный мононуклеоз, наиболее известные из злокачественных лимфома Беркитта и карцинома носоглотки.
Инфицирование ВЭБ происходит, как правило, в детском возрасте и протекает бессимптомно или при незначительных симптомах. Если первичное заражение ВЭБ сопряжено с заболеванием инфекционным мононуклеозом, то инфекция поражает до 10%
Е1А
Е1В
Q
-►
I — 1 1 Э 1 2 чХ\Ч\\\\\ХУЧ\ХЧ\\ХЧЧ\\ 1 1 3 4 kbf
Неполная трансформация ДНК Несущественно
Полная трансформация ДНК
Л\\\\\\\\\\^\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\У
Полная трансформация вирусом
^ Элементы EIA J Элементы El В
Опкобелок Ela - основной онкобелок аденовирусов. В первую очередь он является транскрипционным фактором, т. е. непосредственным активатором целого набора опухолеродных генов. Помимо этого, Ela способен связывать и инактивировать уже упомянутый выше белок-супрессор опухолевого роста RB.
Онкобелок Е!Ь действует как помощник Ela, усиливая опухолеродную активность последнего.
Рис. 6. Схема синтеза онкобелков Ela и Elb (пояснения в тексте)
В-клеток периферической крови. По окончании первичного инфекционного процесса ВЭБ обнаруживается в единичных В-клетках периферической крови на миллион.
Подобно другим герпес-вирусам, ВЭБ имеет как латентную (не вызывающую лизиса инфицированных клеток), так и литическую форму, характерную для обычной продуктивной инфекции. При этом отличительной особенностью ВЭБ является то, что именно латентная форма ассоциирована с наиболее важными злокачественными заболеваниями, предположительно вызываемыми данным вирусом.
Разница между этими двумя формами заключается в том, что литическая представлена линейной внутриклеточной ДНК, такой же, как ДНК внутри вирусной частицы. Латентная форма — вариант вирусного генома, который существует в инфицированной клетке в виде кольцевой ДНК, возможно, что она способна и к интеграции в ДНК клетки-хозяина; как уже упомянуто выше, именно такая форма обладает канцерогенной активностью.
Геном ВЭБ содержит несколько десятков генов, что делает слишком громоздким рассмотрение его полной схемы. Поэтому, поскольку предмет нашего обзора вирус-
ный онкогенез, мы ограничимся описанием основных онкогенов и онкобелков этого вируса (табл. 2).
pre-S2
Гены вируса гепатита В, показанные на схеме, кодируют следующие вирусные белки:
С — внутренний белок вируса (т. н. «core» белок);
Р — ДНК-полимер аз а вируса;
S — поверхностный белок вируса;
X онкобелок.
Рис. 7. Схема генома вируса гепатита В
6. ВИРУСЫ ГЕПАТИТА Из всех вирусов, вызывающих у человека различные формы гепатита, онкогенная активность достоверно показана для вирусов гепатита В и С; здесь мы ограничимся рассмотрением возбудителя гепатита В.
Геномная ДНК вируса гепатита В представлена кольцевой частично двуспиральной молекулой длиной 3 - 3,3 тысячи нуклеотидов, ее схема приведена на рис. 7.
Информация о молекулярном механизме действия онкобелка X на сегодняшний день весьма ограничена; вероятно, этот белок активирует какие-то вирусные и клеточные онкогены на уровне транскрипции.
7. РНК-СОДЕРЖАЩИЕ ОНКОГЕННЫЕ ВИРУСЫ РЕТРОВИРУСЫ Ретровирусы рекордная по разнообразию группа вирусов, отличительной особенностью которой является следующее: геном ретровирусов представлен РНК, однако при инфекционном процессе обязательной стадией является синтез на этой РНК другой молекулы - ДНК-копии, которая встраивается в клеточную ДНК и с этого момента стано-
r>OC-..,V‘V:C’nU)l-
УШБЕРОАТ& ДРУЖБЫ НАРО‘ ьАУЧНАЯ БИБЛИОТЕК.
Таблица 2.
Основные группы онкогенов вируса Эпштейна-Барр.
№ п/п Онкоген Основные белки-мишени и механизм индукции канцерогенеза
1 Мембранные белки. ЕМР-1. Иммортали-зующий онкоген. Мембранный белок, 6 т рансмембранных доменов. ГМР-2. Основной онкоген ВЭБ. Мембранный белок, 12 трансмембранных доменов. Связывается с мембранными рецепторными молекулами инфицированных клеток и блокирует нормальное уничтожение опухоли клетками иммунной системы. Индуцирует клеточный гомолог онкогена bcl-2 и таким образом блокирует апофтоз - один из основных противоопухолевых механизмов клетки. Связывается с молекулами главного комплекса гистосовместимости и блокирует нормальное уничтожение опухоли клетками иммунной системы. Связывается с В-клеточным рецептором (BCR) в трансформированных лимфоцитах и блокирует его. Результат подавление действия на эти В-лимфоциты цитотоксических клеток иммунной системы и неуничгожение опухоли. Подвергается фосфорилированию, в результате которого связывается с рядом вирусных и клеточных онкобелков и усиливает их действие.
2 Ядерные белки Е1^А-1. ДНК-связывающий ядерный белок ЕВЫ А-2. Транскрипционный активатор. ЕВЫА-З (а, в, с). Транскрипционный активатор. Связывает участок начала репликации вируса, удерживает ДНК в кольцевой эписомальной форме. По-видимому - активатор ряда вирусных и клеточных онкогенов. Образует комплекс с факторами spi-1 и spi-B, активирует ряд вирусных и клеточных онкогенов, в т. ч. - LMP-1, LMP-2, cd-23, cd-21, c-fgr. Образует комплекс с фактором J-каппа, универсальным клеточным ингибитором транскрипции и инактивирует его. EBNA-Зс связывается с факторами spi-1 и spi-B. активирует LMP-1, вообще частично заменяет EBNA-2.
3 Цитоплазматические белки ВАЯЙ. Гомолог Ьс 1-2, основного противоапофтозного онкогена клетки. Подавляет апофтоз трансформированных клеток, причем bcl-2, bcl-x(L), bid и др. при расщеплении каспазами образуют фрагменты с высокой проапофтозной активностью; все герпес-вирусные белки этой группы либо не расщепляются каспазами, либо их фрагменты не стимулируют апофтоз.
вится неотъемлемой частью генома клетки-хозяина, которая получила название «провирус». Этот процесс копирования вирусного генома в виде ДНК осуществляется специальным вирусным белком — ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).
Ретоовиоус
Вирусный РНК-геном
ГТ“' " ' \ Вирусная ревертаза
Вирусный интегрированный ДНК-геном
Клеточная РНК-полимераза
Вирусная РНК
/ 1 1 1 і- 1 ! е Клеточные ферменты
Вирусная мРНК
Вирусные белки
п
РетюовиоУС
Рис. 8. Схема инфекционного цикла ретровирусов (пояснения в тексте)
Исторически классификация ретровирусов была построена на различиях в их морфологии (при негативном окрашивании) на электронно-микроскопических изображениях:
Тип А - неинфекционные вирусоподобные внутриклеточные частицы, лишенные оболочки.
Тип В - внеклеточные вирусные частицы, имеющие оболочку, с ацентрическим расположением плотной сердцевины и выраженными выростами оболочки, например вирус рака молочной железы мышей.
Тип С также внеклеточные вирусные частицы, имеющие оболочку, но с центральным расположением сердцевины и невыраженными выростами оболочки; к этому типу от носится большинство вирусов птиц и млекопитающих.
Тин I) - Несколько более крупные вирусы, чем типа С, с аналогичным строением; первоначально выделены от нескольких видов обезьян.
Эта классификация показывает, что на своем начальном этапе вирусология была весьма близка к описательным естественным наукам ... зоологии, ботанике и др. В на-
стоящее время в основу этой науки положены генетические подходы и в целом молекулярно-генетическое мировоззрение вирусологов. Эти подходы существенно изменили прежние взгляды на мир вирусов. Так, было выяснено, что ретровирусы типа А не являются собственно вирусами, они кодируются ретровирус-подобными элементами генома самой клетки, получившими название «эндогенные ретровирусы». Весьма разнообразными оказались и другие типы ретровирусов, в том числе - по своей канцерогенной способности и по наличию и расположению в геноме онкогенов.
Ограниченные рамки данного обзора требуют выбрать в качестве примера какой-то один вариант ретровирусного онкогенеза. В качестве такого примера здесь рассмотрен
вирус Мейзона-Пфайзера, принадлежащий к типу D. Этот вирус в течение нескольких лет был объектом исследований на кафедре биологии и общей генетики РУДН и приведенные ниже данные представляют основные научные результаты кафедры по данной теме.
Экзогенные ретровирусы типа D - не содержащие онкогенов лимфотропные вирусы, выделенные от нескольких видов обезьян. Антитела к этим вирусам обнаружены у здорового населения Западной Африки, у больных лимфоаденопатиями, включая СПИД; также известен случай выделения ретровируса типа D от больного В-клеточной лимфо-мой и СПИД.
Ранее авторы настоящего исследования обнаружили нуклеотидные последовательности ретровируса типа D в лимфоцитах детей, больных В-клеточной Беркитт-подобной лимфомой. Эти элементы, как было показано при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), представляют участки генома вируса Мейзона-Пфайзера (MPMV).
Дальнейшие исследования показали, что анализируемые человеческие ДНК содержат не только небольшую обнаруженную область, но и длинные концевые повторы (LTR), т. е. включают, по-видимому, полную копию генома MPMV. Кроме этого, был определен участок генома человека, в котором произошла интеграция ДНК данного вируса у одного из больных В-клеточной Беркитт-подобной лимфомой.
Схема на рис. 9А показывает, что в ДНК человека включен полный геном MPMV (как уже упомянуто выше, он называется «провирусом»). В состав провируса входят концевые участки, т. н. длинные концевые повторы, обозначенные как LTR (от английского “Long Terminal Repeat”). Для анализа из этой ДНК был вырезан фрагмент,
5' LTR
ггровирус
3' LTR
длинный концевой повтор вируса; последовательность-мишень в клеточной ДНК.
Рис. 9. Схема анализа элементов генома вируса Мейзона-Пфайзера (МРМУ), интегрированных в геном человека (пояснения в тексте).
содержащий участки как вирусного, так и клеточного происхождения (рис. 9Б) и определена его нуклеотидная последовательность. Далее полученная последовательность была сравнена с существующим компьютерным банком данных по геному человека и определен точный участок генома, куда включился вирус.
Этим участком генома оказалась 17-я хромосома человека (по крайней мере, у одного из обследованных больных с В-клегочной лимфомой). По-видимому, в инфицирован-
ных клетках могут существовать и другие области интеграции МРМУ, выявление которых требует дальнейших исследований. Тем не менее, показано, что МРМУ непосредственно инфицирует клетки периферической крови у больных В-клеточной лимфомой и интегрирует в хромосомную ДНК. Это дает веские основания считать, что зарегистрированные ранее положительные результаты при иммунохимическом определении белков МРМУ у больных с лимфопролиферативными заболеваниями не являются результатом неспецифических, перекрестных и т. д. реакций, а действительно показывают наличие инфекции МРМУ. Кроме того, поскольку МРМУ обнаружен только в крови больных и их родственников, но не здоровых доноров, данный вирур можно считать вовлеченным в процесс канцерогенеза для данной группы опухолей.
Завершающим этапом этой работы явился компьютерный анализ участка 17-й хромосомы человека, где был обнаружен провирус МРМУ. Возможности такого анализа в настоящее время весьма широки, поскольку в рамках всемирного проекта «Геном человека» была определена нуклеотидная последовательность практически всей человеческой ДНК. С другой стороны, всестороннее развитие получили и методы компьютерного предсказания возможных свойств участков ДНК, которые позволяют определить, входит ли данная ДНК в состав гена, кодирует ли она какой-либо белок, или рег улирует работу
Провирус
Инициирующий экзон — 1
Внутренние экзоны — 2, 3 и т.д.
Длина проанализированной ДНК — б тысяч нуклеотидов. Интеграция провируса произошла между кодирующими элементами гена, т. н. экзонами, в непосредственной близости от экзона 2.
Рис. 10. Схема встраивания провируса МРМУ.
соответствующего гена и т. д. Этот подход, особенно с учетом того, что появляется возможность анализировать ДНК длиной в десятки и сотни тысяч нуклеотидов, становится одним из основных в современной молекулярной генетике.
Анализ участка интеграции МРМУ в 17-й хромосоме человека показал, что провирус встроен внутрь клеточного онкогена, кодирующего особый белок, обнаруженный первоначально в клетках гепатоцеллюлярной карциномы; схема этого встраивания приведена на рис. 10. Таким образом, интеграция МРМУ вызывает типичную активацию клеточного онкогена.
Данная работа — пример экспериментального исследования молекулярных основ вирусного онкогенеза, которые проводятся сейчас во всем мире. Обнаружение белка, ген которого поврежден провирусной вставкой, дает прямые возможности для специфического воздействия на данную опухоль, поскольку известна и нарушенная функция (т. е. собственно активность белка), и ген, который может быть подвергнут генетической коррекции. Этот уровень понимания механизмов канцерогенеза привел к появлению целого ряда новых областей в медицинской науке и клинической практике, таких, как генотера-пия опухолей, и в целом весь комплекс подходов, касающихся не только онкологии, получивший название геномной медицины.
Отметим также, что молекулярно-генетическая информация имеет и более общее значение - человечеству, по-видимому, предстоит постоянно сталкиваться с появлением новых инфекций и их проявлений. Приведенные здесь данные показывают, что непосредственно сейчас происходит переход нового вируса, а именно - вируса Мейзона-Пфайзера (МРМУ) , из обезьяньей популяции в человеческую. МРМУ во многом является аналогом вируса иммунодефицита человека и сейчас мы, вероятно, наблюдаем развитие процесса, который произошел с возбудителем СПИДа несколько десятилетий назад.
Тем не менее, чтобы не завершать обзор на столь пессимистичной ноте, позвольте мне, глубокоуважаемые коллеги, выразить надежду, что прогресс клинической и экспериментальной онкологии, вирусологии и других дисциплин все же послужит нам не как источник страхов и печальных прогнозов, а как путь к осмысленному преодолению тех опасностей, которые ожидают каждого человека и в целом человечество.
GENETIC AL MECHANISMS OF VIRAI. ONCOGENESIS A.V.ITKES
Department of Biology and General Genetics of PFUR. 117198, Moscow, M.-Maklaya st., 8. Medical faculty
Review of a modem information on molecular mechanisms of oncogenesis and on more important groups of viral and cellular oncogenes and mechanisms of their action. Structures of genomes of main groups of oncogcnic viruses are analyzed and the mechanisms of their tumorigenic activity are discussed.
Key words: oncogenes, oncogcnic viruses, molecular mechanisms of oncogenesis
