Генетические маркеры и их взаимосвязь с обменом липидов на этапах развития микроангиопатий у детей и подростков Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Генетик

Генетические маркеры и их взаимосвязь с обменом липидов на этапах развития микроангиопатий у детей и подростков

Е.Б. Кравец, Ю.Г. Самойлова, Е.В. Юрченко,

М. Б. Фрейдин, Е.В. Горбатенко, Е.А. Солодилова

Сибирский Государственный медицинский университет (ректор — член-корр. РАМН проф. В.В. Новицкий), Томск НИИ медицинской генетики (дир. — проф. В.П. Пузырев) ТНЦ СО РАМН

Актуальной проблемой является оценка комбинированного влияния экзогенных и эндогенных факторов риска на развитие микрососуди-стых осложнений при сахарном диабете типа 1 (СД 1). Доказано, что основным патогенетическим звеном в развитии сосудистых осложнений СД является хроническая гипергликемия. Учитывая, что не всегда качественный метаболический контроль позволяет предотвратить развитие диабетических осложнений, остается актуальным поиск потенциальных факторов риска развития микроангиопатий у больных СД. Результаты исследований свидетельствуют о большом значении нарушений липидного обмена в патогенезе микроангиопатий при СД типа 1 [1, 8, 16].

Для СД наиболее характерными нарушениями обмена липидов являются накопление в сыворотке крови атерогенного холестерина липопротеинов низкой (ХС ЛПНП) и очень низкой плотности (ХС ЛПОНП) и триглицеридов (ТГ). В последние годы был обнаружен еще один механизм, приводящий к повышению содержания ХС ЛПНП при СД — механизм неферментного гликозилирования липопротеинов низкой плотности. Процесс гликозилирования липидов нарушает их биологическую активность, транспорт в клетки и расщепление. Это способствует тому, что в клетки продолжает поступать ХС ЛПНП, несмотря на перенасыщение клеток холестерином. Кроме того, гликозилиро-ванный коллаген сосудов приобретает способность связывать в 3 раза большее количество ХС ЛПНП, чем коллаген здоровых людей. Данные механизмы способствуют резкому ускорению атеро-генеза при СД. Большинство авторов признают важную роль ги-перлипидемии в развитии и прогрессировании диабетической нефропатии (ДН) [2, 4, 5, 9, 12]. Некоторые исследователи опровергают данное утверждение [15].

Оценка действия нарушений обмена липидов на развитие диабетических микроангиопатий у детей и подростков с СД типа 1 изучена недостаточно. Исследования ангиопатий на популяционном и семейном уровне указывают на наличие генетического компонента в развитии этих осложнений [3, 6, 7, 13]. Наиболее перспективным подходом к оценке генетической предрасположенности к конкретным сосудистым осложнениям СД является изучение их ассоциации с определенными генами-кандидатами.

В число генов-кандидатов, продукты которых

могут участвовать в развитии диабетических ангис патий, входят гены, кодирующие компоненты ре нин-ангиотензиновой системы (РАС). Активное! РАС регулируется уровнем продукции ангиотензк ногена и активностью ренина и ангиотензинпреврг щающего фермента (АПФ).

Изучение генетической предрасположенности диабетической нефропатии затруднено многими of стоятельствами, что находит отражение в противс речивых данных об ассоциации полиморфизма ге нов ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ) ангиотензиногена (AGT) с данными ангиопатий.

Учитывая прогностическую значимость указан ных процессов, целью нашего исследования явилос изучение взаимосвязи генетических маркеров с сс стоянием обмена липидов на этапах развития мик роангиопатий у детей и подростков с СД типа 1.

Объем и методы исследования

Обследовано 138 детей (73 мальчика и 65 девочек), больнь СД типа 1. Давность заболевания до 3 лет была у 49 пациенте от 3 до 5 лет у 26 и более 5 лет — у 54 больных. Большинство Д| тей находились в фазе декомпенсации (НЬА1с>9%). Микроанп опатии диагностированы у 64 обследуемых, из них ретинопатия у 19 (14%), нефропатия — у 16 (11%), сочетанная патология — pi тинопатия и нефропатия — у 29 (21%) больных.

Давность СД до 6 лет была у 42 (43%) пациентов, от 7 до лет — 37 (38%), после 12 лет — 51 (39%). Контрольную группу с( ставили сибсы (54), что позволило лучше оценить влияние cpi довых факторов (одинаковые условия проживания, питания) i развитие изучаемой патологии и вклад генетических факторов.

Наряду с общепринятым клинико-инструментальным исс.'и дованием для диагностики диабетической ретинопатии использс вались критерии Е. Копег и М. Porta (1992). Скрининг диабет! ческой ретинопатии проводился с помощью исследования гла: ного дна методом прямой офтальмоскопии после расширен!-зрачка. Диагностика нефропатии проводилась согласно класс! фикации С. Mogensen и соавт. Из группы обследуемых 27 (309 детей имели семейные случаи СД типа 1, 38 (42%) детей — С типа 2, из них отягощенную наследственность по СД типа 1 и имели 11 (12%) детей.

Обследование здоровых сибсов включало подробный анал!

г

ика

Генетика

Таблица 1

ЧЇ її і

Показатель Контроль п=26 Сахарный диабет типа 1 Р*

общая группа, п= 67 мальчики, п= 36 девочки, п=31

ХС, ммоль/л 4,66±0,23 5,1710,16 5,01 ±0,16 5,37+0,29 0,049

ХС ЛПВП, ммоль/л 1,29±0,55 1,34+0,05 1,32±0,07 1,37±0,06 0,27

ХС ЛПНП, ммоль/л 2,87±0,21 3,12±0,13 3,08±0,15 3,19±0,23 0,20

ХС ЛПОНП, ммоль/г 0,50±0,25 0,67±0,04 0,66±0,06 0,69±0,06 0,005

ТГ, ммоль/л 1,10±0,11 1,49±0,09 1,45±0,14 1,55±0,11 0,003

ИА 3,58±0,26 3,66±0,22 3,83±0,34 3,47±0,29 0,89

I

по-

рв-

ать

зи-

pu-

I к 35-

Hire> и

UI-

КЬ

:о-

ЕК,-

(МХ

Mil.

Ж-

Sru-а ■ JC-и :и Т-

II.:

К-

<>-

II-

л-

,1М

Н-

Ь)

■Л

Достигнутый уровень значимости различий общей группы по сравнению с контролем.

анамнестических сведений, данные о перенесенных заболеваниях, наличии хронических очагов инфекций, аллергических реакций. Средний возраст здоровых сибсов ровнялся 15,1 + 1,2 лет.

Проводили исследование липидного спектра крови, определение активности ангиотензинпревращающего фермента сыворотки крови и молекулярно-генетические исследования крови.

Исследование липидного спектра крови включало определение уровня общего холестерина (ХС), триглицеридов ферментативным методом с помощью наборов «Biocon» (Германия). Содержание вычисляли по формуле: ХС ЛПОНП=ТГ/2,18; холестерин липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) вычисляли по формуле: ХС ЛПНП=ХС - (ХС ЛПВП + ХС ЛПОНП); коэффициент атерогенности (ИА) ТГ/2,18 — рассчитывали следующим образом: ИА=(ХС — ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП. Для определения активности ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) сыворотки крови использовали метод G. Maguire и С. Price (1985), модифицированный П.П. Голиковым и Н.Ю. Николаевой (1998).

Выделение тотальной ДНК проводили с помощью неэнзиматического метода [13]. Для генотипирования 1/D полиморфизма гена ангиотензинконвертирующего фермента (АСЕ) разделение продуктов амплификации проводили путем электрофореза в 2% агарозном геле с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете. Применяли следующую номенклатуру аллелей гена АСЕ: аллель I (490 п.н.) — наличие (инсерция) Alu-повтора, аллель D — его отсутствие (делеция). Для анализа рестрикционного полиморфизма Т174М гена ангиотензиногена (AGT) продукты амплификации подвергали гидролизу рестриктазой Bsp 191 («Си-бэнзим», Россия). При электрофоретическом разделении продуктов рестрикции выявляются 2 аллельных варианта: аллель Т (отсутствие сайта рестрикции) — один фрагмент длиной 303 п.н.; аллель М (присутствие сайта) — два фрагмента 211 п.н. и 92 п.н.

Методы статистческого анализа включали: дисперсионный анализ, линейный регрессионный, корреляционный анализ с определением ранговой корреляции, сравнение групп по критерию Стьюдента. Сравнение распределения генотипов и частот аллелей проводили с помощью критерия Х2 с поправкой Йетса на непрерывность. Оценку связи изменчивости количественных признаков с генетическим полиморфизмом проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия Манна-Уитни. Изучение ассоциации полиморфизма исследованных генов с патологией проводили с использованием теста на неравновесие при исследовании Transmission/Diseqilibrium Test (TDT) [11]. Взаимоотношения между результатами диагностического теста и реальным наличием или отсутствием заболевания вычисляли с по-

мощью расчета чувствительности теста Se, специфичности теста Sp, распространенности заболевания Р, прогностической ценности отрицательного результата -PV, прогностической ценности положительного результата +PV. Все расчеты по приведенным формулам выполняли с помощью программ Statistica 5.5., Microsoft Excel 97. Общая характеристика обмена липидов у обследуемых пациентов представлена в табл. 1.

Содержание ХС, ТГ, ХС ЛПОНП у детей с СД было повышенным по сравнению со здоровыми сибсами (контрольная группа) и зависело от наличия осложнений. Была отдельно выделена группа больных, у которых имелось сочетание диабетической нефро- и ретинопатии; согласно имеющимся данным, нарушения липидного обмена носят различный характер не только при наличии диабетической нефро- и ретинопатии, но и при их сочетании [10, 16].

Как видно из табл. 2 характеристика липидного спектра у данной группы больных имела свои особенности: статистически значимо повышался уровень ХС, ТГ, ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП. При формировании групп больных, имеющих только диабетическую нефро- или ретинопатию, не получено статистически значимых различий показателей липидного обмена по сравнению с группой без осложнений.

Для верификации достоверности полученных результатов мы провели оценку чувствительности и специфичности теста среди обследуемой группы пациентов (табл. 3). Нарушения липидного обмена у

Таблица 2

Показатель Обследуемые с нефро- и ретинопатией, п=21 Обследуемые без осложнений, п=18 Р*

ХС, ммоль/л 5,69+0,23 4,68±0,19 0,003

ХС ЛПВП, ммоль/л 1,35±0,08 1,37±0,08 0,92

ХС ЛПНП, ммоль/л 3,35±0,16 2,70±0,17 0,02

ХС ЛПОНП, ммоль/л 0,81 ±0,08 0,57±0,08 0,007

ТГ, ммоль/л 1,76±0,18 1,32±0,18 0,01

ИА 4,2±0,53 3,27±0,25 0,27

Достигнутый уровень значимости различий при сравнении групп больных с осложнениями и без осложнений.

Сахарный лиабет

Генетикс|

Показатель +РУ -РУ Бе Бр Р

ХС, ммоль/л 67 81 82 65 46

ХС ЛПНП, ммоль/л 67 31 56 42 68

ХС ЛПОНП, ммоль/л 43 56 90 56 27

ТГ, ммоль/л 33 94 88 52 22

детей с сочетанием диабетической нефро- и ретинопатии носили атерогенный характер и проявлялись в виде повышения уровня ХС, ТГ, ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП. Показатели ХС, ТГ и ХС ЛПОНП обладают наибольшей диагностической ценностью и имеют чувствительность более 80% при специфичности более 50%.

Имеются немногочисленные данные об ассоциации полиморфизма гена АСЕ с количественными показателями обмена липидов в различных популяциях и при сердечно-сосудистой патологии. В связи с этим особый интерес представляет изучение показателей липидного обмена у пациентов с СД типа 1 в зависимости от генотипов гена АСЕ. Показатели липидного обмена у пробандов с генотипами II, Ю, О О гена АСЕ представлены в табл. 4.

Различия уровней показателей липидного обмена у детей с СД типа 1 в зависимости от генотипов гена АСЕ не установлены.

Дополнительно проведена оценка распределения генотипов гена АСЕ в зависимости от компенсации жирового обмена, сравнивались частоты встречаемости генотипов в группах с удовлетворительной и

Таблица 4

Показатель Генотип II Генотип Ю Генотип 00 Р

ХС, ммоль/л 5,29+0,29 5,14±0,29 4,81 ±0,26 0,21

ХС ЛПВП, ммоль/л 5,64±4,29 5,19±3,79 6,20±4,94 0,55

ХС ЛПНП, ммоль/л 7,57±4,21 6,74±3,74 7,88±4,85 0,22

ХС ЛПОНП, ммоль/л 5,07±4,23 4,48±3,82 5,61 ±4,97 0,17

ТГ, ммоль/л 1,71+0,17 1,50±0,14 1,48±4,19 0,17

ИА 7,74±4,21 7,35±3,71 8,69±4,84 0,84

Таблица 5

Показатель Генотип ТМ+ММ Генотип ТТ Р*

ХС, ммоль/л 5,88 0,58 4,93 0,16 0,04

ХС ЛПВП, ммоль/л 12,32 10,96 3,23 1,86 0,69

ХС ЛПНП, ммоль/л 14,75 10,66 4,72 1,84 0,01

ХС ЛПОНП, ммоль/л 11,81 11,02 2,54 1,87 0,23

ТГ, ►л^лоль/л 1,86 0,3 1,47 0,09 \0,22

1 ИА 'і 15,4910,6 'і 5,21 1,84 | 0,07

' Уровень значимости различий при сравнении показателей липидного обмена у больных СД типа 1.

неудовлетворительной компенсацией жирового обмена. Статистически значимой разницы частоты встречаемости аллелей исследуемого полиморфизма в сравниваемых группах не найдено.

Анализ ассоциаций методом «случай-контроль» не обнаружил влияния на развитие диабетических микроангиопатий Т174М полиморфизма гена АвТ. Показатели липидного обмена у пробандов с генотипами ТТ, ТМ, ММ гена АвТ представлены в табл. 5. Полученные данные свидетельствуют, что пациенты с СД типа 1, гомозиготные по аллелю Т,| имеют статистически значимо более низкий уровень ХС и ХС ЛПНП и более удовлетворительное состояние жирового обмена по сравнению с пациентами с СД типа 1 гетерозиготами.

Сравнение распределения генотипов и частот аллелей Т174М полиморфизма гена АвТ у больных СД типа 1 в зависимости от компенсации жирового обмена показало, что в группе больных СД типа 1 с удовлетворительной компенсацией жирового обмена преобладает аллель Т (93 против 79%) и реже встречается аллель М (7 против 21%) по сравнению с больными СД типа 1 с неудовлетворительной компенсацией жирового обмена (табл. 6).

Не установлены значимые различия при сравнении показателей активности АПФ и генотипа полиморфизма гена АвТ среди обследуемых с СД типа 1.

Таким образом, нами выявлены атерогенные нарушения липидного обмена в виде повышения уровня ХС, ТГ, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП в группе пациентов с сочетанием диабетической нефро- и ретинопатии. Впервые проведена оценка диагностической ценности и чувствительности обнаруженных изменений показателей липидного обмена при диабетической нефро- и ретинопатии. Известно, что тяжесть гиперлипидемии прямо пропорциональна прогрессированию ДН, а так как в группе пациентов с ДН основную часть составили больные с нефропатией в стадии микроальбуминурии, можно предполагать, что нарушения липидного обмена в данной группе носят минимальный характер. Оценка диагностической ценности и чувствительности обнаруженных изменений уровня активности АПФ

Таблица 6

Группа обследуемых Генотипы (п) Аллели(%)

ММ ТМ ТТ М Т

Пациенты с удовлетворительной компенсацией ’.М1ГО 0 8 52 7 93

" Пациенты с неудовлетворительной компенсацией 0 жирового обмена 1 1 5 1 7 21 79

16

2/2005

при микроангиопатиях свидетельствовала, что показатели уровня активности АПФ обладают чувствительностью более 70% при специфичности более 50%. Сочетание гиперлипидемии и повышения уровня активности АПФ может служить фактором повышенного риска развития и прогрессирования диабетических микроангиопатий.

Анализ ассоциаций исследуемых полиморфизмов генов АСЕ и АвТ с показателями липидного обмена обнаружил отсутствие ассоциации 1/Э полиморфизма гена АСЕ с характеристиками обмена липидов; обнаружена ассоциация Т174М полиморфизма гена АОТ с уровнем ХС и ХС Л ПН П. Гомозиготы ТТ имели статистически значимо более низкий уровень ХС и ХС ЛПНП по сравнению с группой гетерозигот по ТМ.

Лите;

1. Аметов А.С., Демидова Т.Ю. Дислипидемии при сахарном диабете 2 типа: Метод, пособие. М., 2001 с.32.

2. Дедов И.И. Введение в диабетологию. - М: Из-во Берег, 1998.-200 с.

3. Демуров Л.М. и др.// Молекулярная биология.- 1997.- Т. 31.- с. 59-62.

4. Оганов Р.Г., Александров А.А.// РМЖ,- 2002.-Т. 10., №11.-с. 15-17.

5. Северина А.С., Шестакова М.В.// Сахарный диабет.- 2001.- №3.-с. 59-60.

6. Чистяков Д.А. и др.// Молекулярная биология.- 1 999,- Т. 34 №2,- с. 211-213.

7. Шахмалова М.Ш. и др.// Актуальные проблемы современной эндокринологии.- С.-П., 2001.- с. 235-237.

8. Щербакова М.Ю. Дислипопротеидемии.// Лечащий врач,- 1999,-№7,- с. 2-5.

Выводы

1. Нарушения липидного обмена в виде атероген-ных проявлений, повышения активности АПФ способствуют развитию и прогрессированию диабетических микроангиопатий.

2. Обнаружена зависимость между тяжестью СД типа 1, показателями липидного обмена (ХС и ХС ЛПНП) и Т174М полиморфизма гена AGT. Гомозиготы ТТ имели более низкий уровень ХС и ХС ЛПНП.

3. Показатели липидного обмена, уровень АПФ (более 50 мкмоль/мин • л) могут быть использованы в качестве дополнительных критериев риска развития микроангиопатий.

атура

9. Юшков П.В. Морфогенез микроангиопатий при сахарном диабете. //Сахарный диабет.- 2001. №1.- с. 53-56.

10. Coonrod В. et а1 // Diabetes Care.-1993.-Vol. 1 6, №10. - р. 1376-1383.

1 1. Ewens F. Disease Association in the Transmission// Genetic Mapping. —

1999.- p.l. 12.1-1.12.15.

12. Festa A. et al// Diabetologia. - 1998. - Vol. 41, №3. - p. 350-356.

1 3. Fujisawa T. et al// Diabetologia. - 1 998. - Vol. 41, №1.- p. 47-53.

14. Lahiri D. // Biochem Biophis. Method. - 1 992.- Vol. 25.- p. 193-205.

15. Maser R. et al.// Diabetes Care.-l 993.-Vol. 16, №5.- p. 755-758.

1 6. Ritter M.// Clin Chim Acta.- 1 993.- Vol. 21 4, № 1p. 45-54.