CC BY
40Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 23 (62). 2010. № 4. С. 66-71.
УДК 575:631.147:577.182.72
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УТОЧНЕНИЯ ПУТЕЙ БИОСИНТЕЗА МОНОТЕРПЕНОИДОВ У МЯТЫ
Бугаенко Л.А.
РВУЗ «Крымский инженерно-педагогический университет», Симферополь, Украина
E-mail: kipubiology@gmaiL com
В статье представлены материалы,показывающие, что у Mentha canadensis L. функционируют два пути биосинтеза ментола (пиперитонный и пулегонный), которые подтверждены генетическими исследованиями и экспериментами по биотрансформации монотерпеноидов в культуре клеток in vitro. Ключевые слова: биосинтез, монотерпены, биотрансформация, in vitro.
ВВЕДЕНИЕ
Эфирные масла различных видов мяты включают большое (более 100) разнообразие монотерпеноидов циклического и ациклического строения, однако, как правило, в них преобладает один или несколько компонентов.
Рядом исследователей [1-5] предложены биогенетические схемы, согласно которым компоненты эфирных масел образуются путем последовательных превращений, начиная от геранилпирофосфата (рис. 1).
По существующим представлениям, превращение одного терпенового компонента в другой контролируется одним геном, кодирующим синтез соответствующего фермента. Если необходимый фермент отсутствует, последовательность цепи биосинтеза останавливается и происходит накопление предшественника. Преимущественное накопление того или иного предшественника в эфирном масле видов мяты и определяет разнообразие биохимического состава различных представителей рода Mentha L.
Ментол - основной компонент эфирного масла культивируемых видов мяты (M.piperita L. и M. canadensis L.) является конечным продуктом биосинтеза С-3 окисленных терпеноидов и образуется из его непосредственного предшественника ментона под контролем доминантного аллеля R [6]. Рецессивный аллель этого гена (r) не позволяет активно проходить данной химической реакции и растения, имеющие гомозиготный рецессивный генотип (rr), накапливают преимущественно ментон или его предшественники (С-3 - окисленные соединения - пулегон, пиперитон, пиперитенон и др.). Как правило, такие терпеноиды преимущественно синтезируют дикорастущие виды мяты. Кроме того, дикорастущие виды мяты могут синтезировать С-2 окисленные терпеноиды - карвон и его производные, а также ациклические терпеноиды - линалоол и линалилацетат [5, 7-10].
Рис.1. Схема биосинтеза терпеноидов у мяты.
Целью настоящего исследования явилось уточнение путей биосинтеза С-3 окисленных терпеноидов, конечным этапом которых является синтез циклического спирта - ментола.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследований служили культивируемые полиплоидные формы мяты, полученные в результате обработки колхицином видов М. canadensis (K59, K60) и M. piperita (А2). А также дикорастущие виды мяты M. spicata L, M. aquatica L., M.longifolia L. (Nath.) и др.
Для получения полиплоидных форм мяты проводилась обработка 0,25% водным раствором колхицина в течение 24 часов укорененных стеблевых черенков растений мяты. Для подтверждения полиплоидной природы полученных растений определялся размер устьиц и пыльцевых зерен, а также подсчитывалось соматическое число хромосом.
Массовая доля эфирного масла в воздушно-сухих листьях и соцветиях определялась методом А.С. Гинзберга [11] с последующим пересчетом на абсолютно сухую массу. Состав эфирного масла исследовался методом газожидкостной хроматографии на приборах Хром-3 и Хром-4. Колонка стальная, длина3,2 м, внутренний диаметр 3 мм. Неподвижная жидкая фаза карбовакс 20М (15%) на хроматоне N-AW- DMCS ), 125-160 мм, РНе = 2,5 атм. Температура
термостата колонки 130 и 1700С. Главные компоненты эфирного масла идентифицировали по времени удерживания с использованием чистых веществ. Для идентификации некоторых компонентов проводили их выделение с помощью препаративной хроматографии на колонке и в тонком слое в системе растворителей гексан- этилацетат (7:3) и исследовали методом ИК- и УФ- спектроскопии.
РЕЗУЛЬТАТЫ И обсуждение
Данные, полученные при изучении самоопыленных потомств 81 и М. spicata использованы для уточнения и дополнения схемы генетического контроля превращения терпеноидов на заключительных этапах, связанных с синтезом ментона и ментола.
Согласно биогенетической схеме Рейтсема [11] пиперитенон является общим предшественником для двух биосинтетических последовательностей :
1. пиперитенон 2* пиперитенон
Хефендель с соавторами [11] с помощью изотопных опытов подтвердили схему Рейтсема, однако они не смогли доказать роль пиперитенона как начального члена предполагаемой последовательности. Анализ полученных данных при изучении линий Si пиперитонной формы показал, что пиперитон и пулегон действительно могут иметь один предшественник, поскольку в одних растениях накопление большого количества одного из них ведет за собой почти полное отсутствие, второго, тогда как в других - эти компоненты могут находиться практически в равных количествах. Это подтверждается также наличием у растений одной из этих линий пиперитенона как основного компонента эфирного масла при наличии пиперитона. Полученные данные также показывают, что ментон и изоментон в действительности имеют общий предшественник, которым может являться пиперитон.
Биогенетические взаимоотношения отдельных компонентов эфирного масла были уточнены также с помощью опытов, проведенных при культивировании in vitro линий M. spicata. Были получены каллусные ткани из листьев линий M. spicata, синтезирующих в эфирном масле интактных растений преимущественно пулегон (56,5%) и пиперитон (21,8%). Установлено, что в каллусных тканях накапливалось эфирное масло, однако в значительно меньшем количестве, чем в интактном растении, при этом состав терпеновых компонентов был сходным, но по количественному их содержанию наблюдались различия. Содержание пулегона и пиперитона в эфирном масле, полученном из каллусов, составило 10,8 и 7,4 % соответственно. При этом увеличивалось содержание пиперитона, являющегося предшественником указанных компонентов.
Поскольку биосинтез отдельных компонентов эфирного масла контролируется генетически, специфическая биосинтетическая способность исследуемых линий M.
у пиперитон -щ ментон -^ ментол
пулегон -ментофуран
4 ментон _»г ментол
spicata должна быть отражена и в полученных из них каллусных тканях. Однако при генетически детерминированном синтезе отдельных терпенов, реализация генетической информации зависит также и от внешних факторов. Очевидно, условия, складывающиеся при культивировании данных форм мяты in vitro, не позволяют осуществляться этой информации на заключительных этапах биосинтеза терпеноидов.
Вопрос о соотношении путей биосинтеза различных предшественников ментола в конкретном растительном материале имеет большое значение в решении задач практической селекции при создании высокоментольных сортов. При гибридизации M. canadensis (4n)- генотип RRRR с линиями М. spicata генотип rr, синтезирующими в качестве основного компонента различные терпеновые соединения, окисленные при третьем углеродном атоме, - ментон, изоментон, пулегон и оксипиперитон, вскрыты генетические механизмы, обусловливающие повышенное накопление ментола у М. canadensis, и показана способность данного вида образовывать высокоментольные гибриды с широким набором дикорастущих видов и форм мяты. Самое большое число высокоментольных гибридов - 89,1 и 86,1 % получено при опылении К60 ментонной и оксипиперитонной линиями, Довольно большое количество (39,1%) таких гибридов получено и при скрещивании К60 с изоментонной линией, тогда как опыление пулегонной линией приводит к получению незначительного (6,8%) количества высокоментольных гибридов (>60% ментола). Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что в самом материнском растении М. canadensis K60 преимущественно действует путь синтеза ментона из пиперитона, тогда как пулегонный путь является менее эффективным. Исходя из данных, полученных при анализе потомства Fi от скрещивания К60 с изоментонной линией, следует, что у К60 и ее гибридов существует генетический механизм, допускающий изомеризацию изоментона в ментон.
Касаясь непосредственного предшественника изоментона следует отдать предпочтение пиперитону, поскольку дальнейшие превращения пулегона у К60 и ее гибридов происходит менее активно. Обнаружение М. Мареем с соавторами [12] формы, синтезирующей (-) - пиперитон, а также наши собственные данные о наличии в эфирном масле растений, полученных при самоопылении M. spicata K65, обоих изомеров пиперитона позволяет считать, что в качестве основного предшественника изоментона у изучаемой группы растений функционирует (-) - пиперитон.
Наличие двух путей биосинтеза ментона и ментола у M. canadensis было подтверждено в прямых экспериментах, проведенных нами совместно с С.А. Резниковой и В.С Родовым [13] по биотрансформации монотерпенов в культуре клеток in vitro этого вида. При инкубации ментона происходило его активное восстановление с образованием ментола и неоментола, что подтверждает роль ментона как непосредственного предшественника обоих стереоизомерных спиртов. Клетки M. canadensis К60 были способны к восстановлению пулегона и пиперитона с образованием ментона и изоментона и соответствующих им спиртов. При этом максимальный выход продуктов восстановления, среди которых преобладал ментол, был получен при трансформации пиперитона. Пулегон менее активно вовлекался в процесс восстановления. При введении в клеточную суспензию изоментона значительная часть его восстанавливалась и накаливался
преимущественно ментол. У M. piperita, для которой характерен более низкий уровень накопления ментола, напротив, пулегонный путь является основным источником образования этого компонента, тогда как роль пиперитона и изоментона незначительна.
Составление результатов биотрансформации ментона, изоментона, пулегона и пиперитона суспензионной культурой M. canadensis с результатами скрещивания этой формы с формами M. spicata, накапливающими те же монотерпены, позволяет уточнить присущие ей пути биосинтеза ментола.
Полученные данные хорошо согласуются друг с другом и указывают на преобладание у M. canadensis и ее гибридов пиперитонного пути синтеза предшественников ментола. При этом (-)-ментон, по-видимому, синтезируется из (+)- пиперитона, а (+)-изоментон из (-)-пиперитона. В дальнейшем осуществляется ферментативная изомеризация (+)- изоментона в (-)-ментон, превращаемый под влиянием аллеля R в (-)-ментол. Пулегонный путь синтеза ментона также функционирует у M.canadensis К60 и ее гибридов, однако его вклад в биосинтез ментола меньше, чем может быть обусловлено гетерозиготностью данной формы по гену Ps, контролирующему перевод пулегона в ментон.
А
. (+)-пулегок
в
Пиперитенон „ __ (-)-ментон-» С+^-ментол
^)((_)-пиперитон -—* (+)-иэонент<ж 1в
Рис.2. Уточненная схема генетического контроля биосинтеза ментола и его предшественников
Таким образом проведенные эксперименты позволили уточнить схему генетического контроля биосинтеза ментола, в том числе и на этапе превращения пиперитона в ментон и пиперитона в изоментон, обозначенного символами Р4 и 1т соответственно. Такая схема представлена на Рис. 2.
ВЫВОД
1. В результате проведенных генетических и биотехнологических исследований установлено, что M. canadensis обладает расширенным по сравнению с M. piperita возможностями взаимопревращения терпеновых компонентов, обусловленными генетически, что объясняет высокий уровень (до 85%) накопления ментола у этой формы и гибридов, полученных с ее участием.
2. Наличие двух путей (через пиперитон и пулегон) биосинтеза ментона и ментола у M. canadensis подтверждено в прямых экспериментах по биотрансформации монотерпенов в культуре клеток in vitro.
3. Показано, что у M. canadensis и ее гибридов преобладает пиперитонный путь синтеза ментола и его предшественников.
Список литературы
1. Reitsema R.N. A biogenetic arrangement of mint species / R.N.Reitsema // J. Am. Pharmacol. Assoc. -1958. - V. 47.- P. 267-269.
2. Fujita Y. Problems in the genus Mentha (111) / Y. Fujita // Koryp. - 1960. - Vol. 59. - P. 41-42.
3. Battaile J. Biosynthesis of terpenes 11. The site and sequence of terpene formation in peppermint / J. Battaile, W.D. Loomis // Bio-chim. Biophys. Acta.-1961. Vol. 51.- P.545-552.
4. Loomis W.D. Biosynthesis and metabolism of monoterpenes / W.D. Loomis // In: Terpenoids in plants. -Acad. Press, New York. - 1967. - P. 59-82.
5. Loomis W.D. Biochemistry and physiology of lower terpenoids / W.D. Loomis, R. Croteau // In: Stracture, biogenesis, and distribution. Recent advancesin Phytochemismistri. - Acad. Press, New York and London.- 1973. - Vol. 6. - P. 147-185.
6. Murray M.J. The genetic basis for the conversion of menthon to menthol in Japanes mint / M.J. Murray // Genetics. -1960. - Vol. 45, № 7. - P. 925-929.
7. Hefendehl F.W. Monoterpene composition of a chemotype of Mentha piperita having high limonene / F.W. Hefendehl, M.J.Murray // Planta medica. - 1973b. - № 2. - P. 101-109.
8. Murray M.J. The genetic basis of acyclic oil constituents in Mentha citrate Ehrh. / M.J. Murray, D.E. Lincoln // Genetics. - 1970. - № 65. - P. 457-471.
9. Murray M.J. Genetic observation on Mentha oil biogenesis / M.J. Murray // An. Acad. Bras. Science. -1972. -Vol. 44. - P. 24-33.
10. Lawrence B.M. A study of monoterpene interrelation ships in the genus Mentha with special reference to the origin of pulegone and menthofuran / Lawrence B.M. // Doctoral thesis universiteit the Groningen, Netherlands. - 1978. - 302 p.
11. Hefendehl F.W. The biosynthesis of the originated monoterpenes in mint / F.W. Hefendehl, R.W. Underhill, F. Rudlof // Phytochemistry. - 1967. - № 6.- P. 823-835.
12. Murray M.J. Chemogenetic evidence supporting multiple allel controle of the biosynthesis of (-) -menthone and (+) - isomenthone stereoisomers in Mentha spicies / M.J. Murray, D.E. Lincoln, F.W. Hefendehl // Phytochemistry. - 1980. - Vol. 19, №10. - P. 2103-2110.
13. Резникова С.А. Генетический контроль биосинтеза терпеноидов у мяты. Сообщение 111. Особенности генетической регуляции биосинтеза ментола у Mentha canadensis L. / С.А. Резникова., Л.А. Бугаенко, В.С. Родов // Генетика. - 1985. - Т.ХХ1, № 1.-С. 95-102.
Бугаенко Л.А. Генетичш i бштехнолопчш аспекти уточнення шлях1в бшсинтезу монотерпено'щв у м'яти / Л.А. Бугаенко // Вчет записки Тавршського национального ужверситету iM. В.1. Вернадського. Серм , Долопя, xiMw". - 2010. - Т. 23 (62), № 4. - С. 66-71.
У статт представлен матерiали, яю показують, що у Mentha caladensis L. функцюнують два шляхи бюсинтезу ментолу (тпертонний i пулегшний), яю тдтверджет генетичними дослщженнями i експериментами по бютрансформацй монотерпетв в культурi клгтин in vitro. Krn4oei слова: бюсинтез, монотерпени, бютрансформащя, in vitro.
Bugaenko L.A. Genetic and biotechnological aspects of specification of ways biosynthesis of monoterpenoids in mint / L.A. Bugaenko // Scientific Notes of Taurida V.I. Vernadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2010. - Vol. 23 (62), No 4. - P. 66-71.
The article shows two ways of biosynthesis of menthol in Mentha canadensis L. (piperitonic and pulegonic), which have been confirmed by genetic research and experiments on biotransformation of monoterpens in culture of cells in vitro.
Keywords: biosynthes, monoterpens, biotransformation, in vitro.
Поступила в редакцию 12.11.2010 г.
