CC BY
117
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 578.824.11:578.52].083.2
С.А. Чупин, Е.В. Чернышова, А.Е. Метлин
Генетическая характеристика полевых изолятов вируса бешенства, выявленных на территории Российской Федерации
в период 2008-2011 гг.
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных), 600901, г. Владимир
Была определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена N63 полевых изолятов вируса бешенства, выявленных в период 2008-2011 гг. в различных регионах Российской Федерации. Сравнение с ранее изученными изолятами и штаммами показало, что вновь выявленные изоляты можно отнести к 5 ранее описанным филогенетическим группам: Арктической, Центральной Российской, Евразийской, Северной Европейской и Кавказской. изоляты Арктической группы, выделенные в Республике Коми, идентичны ранее описанному штамму вируса бешенства из якутии. Это первый подтвержденный случай обнаружения вирусов бешенства Арктической группы в европейской части России.
Ключевые слова: вирус бешенства, филогенетический анализ
Genetic characterization of the Rabies Virus Field isolates Detected in Russian Federation within the Period 2008-2011
S. A. Chupin, E. V. Chernyshova, A. E. Metlin
Federal Center for Animal Health, 600901, Vladimir, Russia
sixty-three gene N fragments of rabies virus field isolates detected within the period 2008-2011 in different regions of russian Federation were sequenced. The comparison with previously tested isolates and strains has shown that newly isolated isolates can be placed into five previously described phylogenetic groups: Arctic group, central russian group, Eurasian group, northern European group, and caucasian group. The arctic group isolates detected in Komi republic were identical to previously described rabies virus strain from Yakutia. This is the first reliable case of detecting arctic group rabies virus in european part of russia.
Key words: rabies virus, phylogenetic analysis
Введение
В большинстве регионов России эпизоотическая ситуация по бешенству остается напряженной. На протяжении последних нескольких лет увеличилось число случаев заболевания среди диких животных, домашних плотоядных и сельскохозяйственных животных. Так, в 2010 г. были зарегистрированы 3923 вспышки заболевания [2]. Несмотря на это, к настоящему времени полная картина генетических особенностей отечественных изолятов вируса бешенства отсутствует. Ранее российские изоляты из некоторых регионов были охарактеризованы по гену N И.В. Кузьминым [8, 9] и А.Е. Метлиным [12]. В данной работе анализируются фрагменты гена N63 российских изо-лятов вируса бешенства из разных регионов страны и сравниваются с ранее выявленными на территории Российской Федерации изолятами и штаммами.
Материалы и методы
В работе использован патологический материал (головной мозг) от животных с подозрением на бешенство, поступающий на исследование в лабораторию бешенства Федерального центра охраны здоровья животных (ФГБУ ВНИИЗЖ, г. Владимир) из региональных лабораторий Российской Федерации. Для сравнительного анализа использовали нуклеотидные последовательности гена N штаммов вируса бешенства из базы данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Характеристика всех штаммов и изолятов вируса бешенства, применявшихся в работе, дана в таблице.
Выделение РНК, синтез кДНК и ПЦР-фрагмента гена N осуществляли, как описано ранее [11].
Полученные ампликоны секвенировали с применением праймеров, которые использовались в ПЦР, и набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (“Applied Biosystems”, США) на капиллярном ДНК-секвенаторе ABI Prism 3100 (“Applied Biosystems”, США). Анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета программ BioEdit version 7.0.5.2. Филогенетический анализ выполняли с помощью алгоритма neighbor-joining (NJ), встроенного в программу MEGA 3.1 [7]. Для оценки достоверности топологии филогенетического древа был проведен bootstrap-анализ с привлечением 1000 псевдореплик.
Результаты и обсуждение
При секвенировании ампликонов, полученных в ПЦР, были определены 63 нуклеотидных последовательности фрагмента гена N изолятов вируса бешенства длиной 334 нуклеотида (положение в гене N: 582-915).
На рис. 1 представлено древо, отражающее филогенетические отношения штаммов и изолятов вируса бешенства, выделенных в разное время на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья.
Анализ древа позволил отнести все исследован-
Контактная информация:
Чупин Сергей Александрович, канд. биол. наук; e-mail: chupinsergei@yahoo.com.
44
Характеристика изолятов и штаммов вируса бешенства, использованных в работе
Изолят/ штамм Регион Хозяин Источник данных Номер доступа в GenBank
48/2005 Республика Башкирия Кошка [11] DQ462433
40/2005 То же Рысь [11] DQ462431
51/2005 '' '' Собака [11] DQ462434
41/2005 '' '' Корова [11] DQ462432
1132/2009 Белгородская область Лиса Данное исследование JQ434351
1133/2009 То же " То же JQ434352
1139/2009 II II " " " JQ434353
RV1589 II II Кошка [8] AY352456
33/2002 II II Собака [11] AY705419
23/2002 II II Лиса [11] AY705417
41/2002 II II Свинья [11] AY705420
355/2010 Брянская область Волк Данное исследование JQ434337
364/2010 То же Лиса То же JQ434338
365/2010 " ” " " " JQ434339
369/2010 " " Собака " " JQ434340
RV262 " " Лиса [8] AY352457
33/2005 " " " [11] DQ462429
83/2011 Республика Бурятия Корова Данное исследование JQ434307
125/2009 Владимирская область Лиса То же JQ434312
612/2009 То же " II к JQ434343
613/2009 " " Собака к к JQ434344
696/2009 " " Лиса к к JQ434345
211/2010 " " Корова к к JQ434315
244/2010 " " " к к JQ434334
2070f Волгоградская область Лиса [8] AY352484
2072f То же " [8] AY352485
899/2009 Воронежская область " Данное исследование JQ434348
1/2002 То же " [11] AY705407
552/2010 Калинин- градская область Данное исследование JQ434341
1410/2008 Республика Коми Северный олень То же JQ434358
1411/2008 То же То же " JQ434359
1350/2008 Краснодарский край Собака " JQ434354
1352/2008 То же " " JQ434355
1353/2008 " " " " JQ434356
1356/2008 " " " " JQ434357
1305f " " Лиса [8] AY352461
10/2005 " " " [11] DQ462422
18/2005 " " Собака [11] DQ462424
RVHK Краснояр- Человек [8] AY352462
ский край
Изолят/ штамм Регион Хозяин Источник данных Номер доступа в GenBank
24/2009 Ленинградская область Енотовидная собака Данное исследование JQ434303
25/2009 То же То же То же JQ434305
595/2009 Московская область Лиса II II JQ434342
705/2009 То же " II II JQ434346
821/2009 " " Енотовидная собака II II JQ434347
1552/2008 Нижегородская область Коза II II JQ434360
1564/2008 То же Лиса II II JQ434361
104/2009 II II " II II JQ434308
110/2009 II II " II II JQ434309
111/2009 II II Собака II II JQ434310
217/2009 II II Лиса II II JQ434318
218/2009 II II " II II JQ434319
219/2009 II II " II II JQ434320
220/2009 II II " II II JQ434321
221/2009 II II " II II JQ434322
222/2009 II II " II II JQ434323
223/2009 II II " II II JQ434324
224/2009 II II " II II JQ434325
225/2009 II II " II II JQ434326
226/2009 II II " II II JQ434327
227/2009 II II " II II JQ434328
228/2009 II II " II II JQ434329
229/2009 II II " II II JQ434330
230/2009 II II " II II JQ434331
231/2009 II II " II II JQ434332
232/2009 II II " II II JQ434333
339/2009 II II Собака II II JQ434335
343/2009 II II " II II JQ434336
985/2009 II II Лиса II II JQ434349
990/2009 II II " II II JQ434350
8/2010 II II Кошка II II JQ434300
213/2010 II II Собака II II JQ434316
20/2002 II II Лиса [11] AY702677
623/2003 II II Собака [11] AY705425
184/2009 Новгородская область Енотовидная собака Данное исследование JQ434314
647/2003 Новосибирская область Лиса [11] AY705423
RVHN То же Человек [8] AY353865
RV257 Омская область Лиса [8] AY352464
3665f То же [8] AY352466
RV260 " " " [8] AY352465
3683c " " Корсак [8] AY352468
3678c " " " [8] AY352468
RV1590 Оренбургская область Человек [8] AY353874
45
Продолжение таблицы
Изолят/ штамм Регион Хозяин Источник данных Номер доступа в GenBank
99 То же Кошка [8] AY352473
18/2002 Пензенская область Лиса [11] AY705412
RV245 Псковская область Человек [8] AY352475
RV1596 То же Лиса [8] AY352474
3/2002 Енотовидная собака [11] AY705418
188/2002 Рязанская область Корова [11] EF095203
634/2008 Саратовская область Данное исследование JQ4342299
213/2011 Тверская область Рысь То же JQ434317
96/2002 То же Лиса [11] AY705431
85/2002 '' ” Енотовидная собака [11] AY705427
RV241 Тульская область Человек [8] AY352477
RV234 То же Собака [8] AY352476
RV299 ” ” Лиса [8] AY352479
23/2010 Республика Тыва Данное исследование JQ434302
24/2010 То же Волк То же JQ434304
26/2010 ” ” Корова ” ” JQ434306
686cow ” ” ” [8] AY352482
3561d ” ” Собака [8] AY352481
857r Хабаровский край Енотовидная собака [8] AY352458
304c Читинская область Корсак [8] AY352459
SG21 Республика Якутия Песец [9] EF611828
3510w То же Волк [8] AY352486
SG23 ” Песец [9] EF611833
9215HON Венгрия Человек [6] U43025
RV308 Грузия ” [8] AY352497
A4795 США, Аляска Собака [8] AY352498
A0906 То же Песец [8] EF611856
1904/2003 Финляндия Лошадь [11] AY705415
113/1988 Енотовидная собака [11] AY705409
9342EST Эстония То же [6] U43432
9142EST ” ” ” [6] U22476
9339EST ” ” ” [6] U42707
EST/1990 ” Лиса [11] AY705429
124/1989 ” ” [11] AY705411
ные изоляты к 5 генетическим группам. Сравнение с ранее изученными штаммами вируса бешенства показало, что все исследованные изоляты относятся к какой-либо из ранее выделенных групп. И.В. Кузьмин и соавт. [8], изучая изоляты вируса бешенства, выде-
ленные на территории бывшего СССР, разделили их на несколько групп: A, B, C, D, UG. В другой работе [12] группы российских изолятов описаны как Евразийская, Северная Европейская, Центральная Российская, Кавказская. В обоих исследованиях топология древ совпадает. В данной работе мы будем придерживаться классификации, предложенной А.Е. Метлиным и соавт. [12] как более наглядной, поскольку она отражает географические особенности распространения различных генетических линий вируса бешенства.
По результатам филогенетического анализа 15 изолятов (из Брянской, Воронежской, Белгородской, Нижегородской, Саратовской областей, Республики Тыва, Республики Бурятия и Краснодарского края) были отнесены к Евразийской группе. Уровень различий между изолятами внутри группы составляет 0%—3,9%. Вновь выявленные изоляты отличаются от ранее изученных не более чем на 1,8%. Обращает на себя внимание тот факт, что в пределах этой группы некоторые изоляты, выделенные в географически удаленных друг от друга регионах, имеют значительное сходство. Например, изоляты 213/2010, 18/2002 и 1634/2008, выделенные в Нижегородской, Пензенской и Саратовской областях соответственно, идентичны друг другу на данном участке генома.
К вирусам Центральной группы отнесено 36 изоля-тов из Владимирской, Нижегородской, Московской и Тверской областей. Вновь выделенные изоляты отличаются от ранее изученных не более чем на 2,7%. Филогенетически вирусы Центральной группы близки к европейским штаммам вируса бешенства. Так, изолят RV262 из Брянска имеет 97,3% гомологию со штаммом 9215HON, выделенным в Венгрии. При анализе предсказанной аминокислотной последовательности было установлено, что изоляты Центральной группы обладают характерной особенностью нуклеопротеина - наличием в позиции 217 остатка валина, в то время как все представители остальных филогенетических групп из России имеют в этой позиции остаток изолейцина.
Четыре вновь выявленных изолята были отнесены к Северо-Европейской группе. Они отличаются от ранее выделенных вирусов той же группы на 1,5-2,4%. Изоляты из Ленинградской и Новгородской областей идентичны друг другу, а изолят из Калининградской области отличается от них на 0,9%.
Как в данной работе, так и в ранее проведенных генетических исследованиях [6, 12] практически все вирусы, выделенные в северо-западных регионах России (Ленинградская, Новгородская, Псковская, Калининградская области), а также в странах Балтии (Эстония, Финляндия), принадлежат к СевероЕвропейской группе. Этот факт противоречит результатам исследований, проведенных с помощью моноклональных антител (МКАТ). Так, М.А. Селимов и соавт. [3] изучали серологические свойства российских штаммов вируса бешенства с помощью МКАТ Р-41. МКАТ Р-41, полученное в результате иммунизации мышей изолятом вируса бешенства от песца из Якутии, селективно реагировало с нуклеокапсидом арктических изолятов этого вируса [13]. Согласно данным работы М.А. Селимова и соавт. [3], все исследованные штаммы, выделенные в Эстонии, Финляндии, Калининградской, Ленинградской и Псковской областях от енотовидных собак и лисиц, реагировали положительно с антителом Р-41. Было выдвинуто пред-
46
Рис. 1. Филогенетическое древо штаммов и изолятов вируса бешенства, построенное на основании нуклеотидных последовательностей фрагмента гена N по алгоритму NJ.
К названиям штаммов и изолятов добавлен регион происхождения. Знаком ♦ маркированы изоляты, впервые исследованные в данной работе. Цифрами в узлах древа показаны значения "bootstrap''-анализа; представлены значения, превышающие 70.
положение о том, что арктические вирусы были транслоцированы на эту территорию, а затем адаптировались к хозяевам новых видов.
Аналогичные результаты с использованием МКАТ Р-41 были получены А.Е. Метлиным и соавт. [10]. По всей видимости, если учесть, что вирусы бешенства из балтийских регионов генетически отличаются от арктических изолятов, МКАТ Р-41 не обладает исключительной специфичностью для вирусов Арктической группы. Возможно, это объясняется аминокислотной заменой аспарагина на глицин в позиции 115 гена N, которой обладают изоляты из обеих рассматриваемых групп по сравнению с вирусами из других филогенетических групп.
Замена на аминокислотный остаток глицина могла облегчить позитивную реакцию с МКАТ Р-41 [5].
Из оленеводческого хозяйства Республики Коми поступило на анализ три образца, полученных от северных оленей. Образцы были положительны на бешенство в РИФ и ОТ-ПЦР. Два из них (1410/2008 и 1411/2008) были отсеквенированы по гену N. Сравнительный анализ показал, что данные изоляты идентичны штамму SG23 вируса бешенства, выделенному в Якутии от песца в 1988 г., и характеризуются высоким уровнем гомологии (99,4-99,7%) с другими изолятами, выделенными в Якутии и на Аляске (см. рис. 1), которые, согласно работе И.В. Кузьмина и соавт. [9], относятся к филогенетической группе Арктическая, подгруппе Арктическая-2. Представляет интерес тот факт, что за 20 лет данная линия вируса на исследуемом участке генома не претерпела изменений. Для более подробного анализа изолята 1410/2008 была определена полная последовательность гена N. Сравнение полных последовательностей гена N изолята 1410/2008 и SG23 показало, что они отличаются четырьмя нуклеотидами, а по предсказанной аминокислотной последовательности идентичны. Если предположить, что с учетом времени выделения штамм SG23 является предком изолята 1410/2008, скорость фиксации замен составляет 1,4 • 10-4 замены на сайт в год. Аналогичное значение для скорости эволюции вирусов бешенства, относящихся к Арктической группе (1,2 • 10-4 замены на сайт в год), было получено И.В. Кузьминым и соавт. [9]. Выделение изолятов 1410/2008 и 1411/2008 является первым достовер-
ным случаем обнаружения вирусов бешенства Арктической группы на территории европейской части России. Ранее было отмечено, что очаги арктического бешенства приурочены к тундровому ландшафту - ареалу естественного распространения песца [3]. Учитывая значительное генетическое сходство изоля-
47
Рис. 2. Карта распространения изолятов и штаммов вируса бешенства, относящихся к различным генетическим группам, по
регионам России.
Буквами обозначены генетические группы: А - Арктическая, Е - Евразийская, К - Кавказская, С - Северо-Европейская, Ц - Центральная.
тов из Республики Коми и Республики Якутия, можно предположить, что выраженная склонность песца к миграции [4] способствовала распространению вируса бешенства данной генетической линии из Сибири в европейскую часть страны.
В 2008 г. 3 изолята были выявлены в материале, поступившем из Краснодарского края (Сочи, Абинск). Анализ показал, что они относятся к Кавказской группе. Данные изоляты идентичны выделенному ранее изоляту 18/2005 из Краснодарского края и штамму RV308 из Грузии. Характерно, что практически все эти изоляты выделены от собаки (за исключением штамма RV308, выделенного от человека), в то время как другие изоляты из Краснодара - 1305f, 10/2005 - выделены от лисы и относятся к Евразийской группе.
Наибольшее количество изолятов (29) было выделено в Нижегородской области. Таким образом, для Нижегородской области на данный момент имеется наиболее репрезентативная выборка по сравнению с другими регионами страны. Это позволяет более подробно рассмотреть особенности распространения различных генетических вариантов вируса бешенства на определенной территории. В 2009 г. поступили 23 образца положительного на вирус бешенства материала, собранного в разных районах Нижегородской области, расположенных южнее р. Волги, что дает возможность сделать своего рода временной срез популяции вируса бешенства на этой территории. Согласно филогенетическому анализу, эти изоляты относятся к Центральной группе и их можно разделить на 2 линии: первая линия представлена изолятами 111/2009, 220/2009, 339/2009, 104/2009, 229/2009, 222/2009, 228/2009, 223/2009, 231/2009, к этой же линии относится изолят 8/2010, выделенный в 2010 г.; вторая линия представлена изолятами 221/2009, 226/2009, 217/2009, 218/2009, 990/2009, 110/2009,
230/2009, 232/2009, 225/2009, 343/2009, 224/2009, 227/2009, 985/2009, 219/2009, к этой же линии относится изолят 1564/2008, выделенный в 2008 г. Изоляты, относящиеся к первой линии, были выделены в Арзамасском, Кстовском, Дзержинском, Павловском, Навашинском, Богородском районах, а также в Нижнем Новгороде. Все эти районы расположены в западной части Нижегородской области южнее р. Волги. Изоляты, относящиеся ко второй линии, были выделены в Большемурашкинском, Спасском, Лысков-ском, Большеболдинском, Лукояновском, Воротынском, Пильнинском районах, которые расположены в восточной части области южнее р. Волги.
Полученные данные позволяют предположить, что вирусы каждой из двух генетических линий занимают свой ареал, причем ареалы этих линий граничат, но не пересекаются. Следует отметить, что в 2002 и 2003 гг. в Городецком районе Нижегородской области были выделены 2 изолята (20/2002 и 623/2003), которые по генетической структуре существенно отличаются от вышеописанных. Согласно филогенетическому анализу, эти изоляты относятся к Евразийской группе и проявляют наибольшее сходство (98,2 и 97,9%) со штаммом RVHN, выделенным в Новосибирской области. Поскольку данные о других изолятах, выделенных в Нижегородской области севернее р. Волги, отсутствуют, остается неясным, являются ли эти 2 изолята представителями местной популяции вируса бешенства или же они были занесены из других регионов страны. Другой изолят из Нижегородской области (1552/2008) был выделен в Большеболдинском районе в 2008 г. По генетической структуре он значительно (учитывая вариабельность группы) отличается от представителей вышеописанных линий (на 1,2 и 0,9%). Идентичные по генетической структуре изоляты были выделены в Московской и Тверской обла-
48
