CC BY
50
УДК 636.082:636.597 ББК 45.3 + 46.83
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВНУТРИПОРОДНЫХ ЛИНИЙ УТОК ПО ДАННЫМ РЕСТРИКЦИОННОГО АНАЛИЗА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК Долматова И.Ю., Ганиева И.Н.
У 6 внутрипородных линий пекинских уток с использованием эндонуклеаз рестрикции А1и1, 0йе1, ИаеШ и Нгп/1 изучен полиморфизм длин рестрикционных фрагментов в участке митохондриальной ДНК, кодирующем вторую субъединицу НАДН- дегидрогеназы (N02). Среди исследованных митохондриальных геномов изученных линейных субпопуляциях выявлено 11 митотипов мт ДНК. Выявлены характерные особенности частот их встречаемости для каждой изученной
линии .
В настоящее время при проведении генетического мониторинга сельскохозяйственных популяций по данным ряда авторов, отчетливо прослеживается тенденция утраты генетического разнообразия [1,2]. Поэтому, наряду с классическими зоотехническими приемами, включающими индивидуальный и групповой отбор по хозяйственно важным признакам продуктивности, практическая селекция должна следить за сохранением оптимального генного разнообразия и динамикой генетической изменчивости [2], количественная оценка которой может быть получена при изучении ДНК -маркеров. Одной из таких групп является ДНК митохондрий.
Митохондриальная ДНК эукариот представлена кольцевой молекулой размером от 15700 до 19500 пар нуклеотидов (пн), что в 2500 раз меньше наименьшей из геномных ДНК животных и локализована внутри митохондриального матрикса [3]. У позвоночных при определении полной нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК обнаружены 37 структурных генов (2 гена рРНК, 22 гена тРНК, 13 генов кодирующих белки) и некодирующая область, участвующая в репликации, которая называется Б-петлей [4].
Нуклеотидные последовательности митохондриальных ДНК стали уникальным ключом в изучении эволюции организмов [5-9]. Наследуется митохондриальная ДНК практически только от одного из родителей (в большинстве случаев является нейтральным маркером материнской линии). Вариабельность различных участков митохондриальной ДНК увеличивается в ряду: гены рРНК, гены тРНК, гены трех субъединиц АТФазы и семи субъединиц НАДН-дегидрогеназного комплекса, последовательность Б-петли. Эволюционная изменчивость митохондриальных генов, кодирующих синтез белков, также неодинакова. Наиболее консервативным является ген субъединицы I цитохромоксидазы, а гены субъединиц 5 и 6 НАДН-дегидрогеназного комплекса и субъединицы 8 АТФазы характеризуются наибольшей изменчивостью в процессе эволюции организмов.
Целью настоящей работы является анализ изменчивости мтДНК и определение генетической дифференциации внутрипородных линий уток Бла-говарского племптицезавода.
В работе использован материал, собранный в 1996-2004 гг. Объектом исследования служили утки пекинской породы, которые состоят из следующих внутрипородных линий :1)М1 и М2 -
соответственно отцовская и материнская линии пекинских уток, кросс Медео; 2)Б1 и Б2- соответственно отцовская и материнская линии кросса «Бла-говарский»; 3) БЦ1 и БЦ2-линии уток «Башкирской цветной» породы.
Исследовали участок мт ДНК в участке, кодирующем вторую субъединицу НАДН - дегидро-гиназы (ND2), имеющий длину 1057 пар нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность данного участка была получена из базы данных в «Интернет» и проанализирована при помощи компьютерной программы “Lasergene”. ДНК выделяли из крови с использованием стандартного фенол-хлороформного метода. Для ПЦР использовали пару олигонуклеотидных праймеров, синтезированных фирмой «Синтол» (г.Москва):
1) 5/ - ACCCCAGTCCTAGTCCTCAGTCTC^
2) 5/ - CTTCGGTTTAGGTGGGTGTTATCC-37
Исходную смесь для полимеразной цепной реакции готовили в объеме 25 мкл, содержащем 60 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 10 мМ ((NH4) 2SO4) 2804, 0,1% твин-20, 100мМ каждого из четырех dNTP 0,1 мкМ праймера, 20 - 25 нг геномной ДНК, 1 ед. Tag-полимеразы. Сверху наслаивали 20 мкл легкого минерального масла. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (Россия) в течение 30 циклов: 940С - 1 мин., 57,70С - 1 мин., 720С - 1 мин.
Для рестрикционного анализа участка ND2 использовали 4 эндонуклеазы рестрикции Alu I (AGACT), BstDE I (прототип DdeI - CATNAG), Hae III (GGACC) и Hinfl (GAANTC). Рестрикцию проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя ферментов (ООО «Сибэнзим»). 8,5 мкл. амплифицированного образца инкубировали в течение 12 часов с 2,5 мкл рестриктазы в соответствующем с использованием ТВЕ-буфера, окрашивали бромистым этидием и выявляли в УФ - свете. В качестве маркёров молекулярной длины использовали маркёрные наборы фирмы «Сибэнзим» PBR322/AluI и pUC19/MspI.
Митотипическое разнообразие (h) рассчитывали согласно методике, предложенной Nei [10].
Для определения уровня полиморфизма митохондриальной ДНК рассчитывали также нуклеотидное разнообразие (п) на сайт [11]. В качестве меры сходства между двумя популяциями использовали показатель, основанный на угловом преобразовании частот [11].
Результаты амплификации сегмента N02 мтДНК, расположенного между участками, гомологичными праймерам 1 и 2, у исследованных внутри-породных линий уток, показали наличие продукта ПЦР длиной 1057 пн.
В таблице 1 приводятся результаты рестрикционного анализа этого участка митохондриального генома.
Электрофоретические спектры фрагментов, полученные после обработки каждой рестриктазой, обозначали заглавной буквой и составляли таким образом комбинированный митотип каждой особи и линии. На рисунке 1 приведены спектры рестрикционных фрагментов (митотипы), полученные при использовании названных рестриктаз. Среди исследованных митохондриальных геномов изученных линейных субпопуляциях выявлено 11 ми-тотипов, частота которых представлена в таблице 2.
Таблица 1.
Размеры рестрикционных фрагментов (пн) участка ND2 мтДНК линий уток
Рестрик- Вариант Рестрик- Вариант
таза А B C D таза А B C D E
Hae III 400 400 450 908 Alu I 908 657 908 657 908
280 280 280 657 657 450 657 450 450
220 220 220 400 220 270 450 270 270
200 150 280 200 200 220 200
150 90 270 70 180 200
100 200 90
90 180 70
100 Dde I 657 380 908 450
Hinf I 920 920 501 380 257 90 420
908 908 320 257 90 380
510 510 290 90 70 257
501 501 280 70 90
320 320 70
70 210 70
Рисунок 1. Спектры рестрикционных фрагментов, полученные при расщеплении ND2 -амлифицированного фрагмента мт ДНК внутрипородных линий уток рестриктазами Hae III, Hinf I, Alu I и Dde I. A, B, C, D, E- варианты расщепления, М - маркёр молекулярных масс.
Как видно из таблицы 2, в спектрах гаплоти-пов линий М1, М2, Б1, Б2 не было обнаружено чётких межлинейных различий. Вместе с тем, не выявлено гаплотипов, которые были бы общими для всех изученных линий. Наиболее частым гаплоти-пом для четырёх линий - М1, М2, Б1 и Б2 является гаплотип под номером 4, обозначенный как ААВВ.
Этот факт может быть объяснён близкими филоге-
Частоты митотипов мт ДНК
нетическими взаимоотношениями между названными линиями, поскольку линии Б1 (отцовская) и Б2 (материнская) кросса «Благоварский» были от-селектированы на основе родительских исходных линий М1 и М2 кросса «Медео», и как показывают проведенные ранее исследования [12], генетические расстояния между ними относительно невелики.
Таблица 2.
в различных линиях уток
Мито- тип Рестрикционные морфы Линия
М1 М2 Б1 Б2 БЦ1 БЦ2
1 АААА 10 12
2 АААВ 5 - - - - 1
3 ААВВ 1 - - 6 - -
4 АВВВ 14 13 10 8 - -
5 АВВЕ - - 2 - - -
6 АВВС - - 1 - - -
7 АВСЕ - - 1 - - -
8 АВВБ 1 - - - - -
9 АААС - 1 - - - 1
10 АААБ - - - - 5 -
11 ААББ 1
Всего 20 13 15 14 16 14
Высказанное мнение подтверждает тот факт, что названный гаплотип не встречается ни в линии БЦ1, ни в линии БЦ2 «Башкирской цветной породы» уток, хотя эти линии, в свою очередь, также были отселектированы на основе линий Б1 и Б2. Отсутствие гаплотипа ААВВ линиях БЦ 1 и БЦ2 можно объяснить тем, что они были элиминированы в результате случайного генетического дрейфа,
обусловленного эффектом родоначальника. В 1993 году в зональной «Благоварской» популяции уток пекинской породы, которые, как известно, характеризуются белым оперением, были выявлены несколько особей с цветным оперением (4 самца и 5 самок), которые и явились родоначальной группой для выведения башкирской цветной породы уток.
Таблица 3.
Митотипическое и нуклеотидное разнообразие в исследованных линиях уток
Линия уток Митотипическое разнообразие (И) Нуклеотидное разнообразие (п)
М1 0,466 0,024
М2 0,140 0,013
Б1 0,579 0,033
Б2 0,528 0,036
БЦ1 0,337 0,02
БЦ2 0,269 0,017
Для характеристики генетической дифференциации популяций используются показатели мито-типического и нуклеотидного разнообразия, которые представлены в таблице 3.
Показатель митотипического разнообразия (И) эквивалентен показателю ожидаемой гетерозигот-ности для диплоидных данных. Он характеризует
вероятность различия двух случайно выбранных в популяции гаплотипов.
Из таблицы 3 можно видеть, что митотипиче-ское разнообразие в исследованных линейных популяциях пекинских уток является не очень высоким по сравнению с другими популяциями [5-7] и колеблется в пределах от 0,14 до 0,579, причём линии благоварского кросса Б1 и Б2 характеризуются довольно высокими его значениями (0,579 и
0,528), а линии БЦ1 и БЦ2 башкирской цветной породы - сравнительно низкими (0,337 и 0,269). Соответственно этому и нуклеотидное разнообразие названных линий является высоким в митохондриальном геноме уток линий Б1 и Б2 (0,033 и
0,036) и незначительным в геноме линий БЦ1 и БЦ2.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ - Агидель (№ проекта 05-04-97940).
ЛИТЕРАТУРА
1. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях /Ю.П. Алтухов. М.: ИКЦ “Академкнига”, 2003. 431 с.
2. ГлазкоВ.И., Доманский Н.Н., Созинов А.А. // Цитология и генетика.1998. Т.32. №5.С.80-93.
3. Гречко В.В.// Генетика. 2002. Т. 38. № 8. С. 1013 - 1033.
4. Минченко А.Г., Дудырева Н.А. Митохондриальный геном. Новосибирск: Наука. Сибирское отделение, 1990. 194 с.
5. Adams J., Rothman E.D. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79, № 11. P. 3560-3564.
6. Barton N., Jones J.S. // Nature. 1983. Vol. 306, № 5941. P. 317-318.
7. Cann R.L., Wilson A.C. // Genetics. 1983. Vol. 104, № 4. P. 699-711.
8. Avise J.C., Saunders N.C. // Genetics. 1984. Vol. 108, № 1. P. 237-255.
9. Taylor J.W. // Exp. Mycol. 1986. Vol. 10, № 2. P. 259-272.
10. НейМ. Вопросы общей генетики. М.:Наука,1981. С.7-18.
11. Хуснутдинова Э. К. Молекулярно-генетическая характеристика популяции башкир и других народов Волго-Уральского региона: Автореф. докт.дисс. Москва, 1997. 35 с.
12. Долматова И.Ю., Саитбаталов Т.Ф., Гареев Ф.Т. // Генетика.2000. Т.36. №4. С. 532-539.
Поступила в редакцию 05.06.06 г.
