CC BY
33
ISSN 0869-4362
Русский орнитологический журнал 1998, Экспресс-выпуск 43: 9-12
Дифференциация гена цитохрома b митохондриальной ДНК у трёх подвидов рябчика Bonasa bonasia
О.Т.Буторина, Л.Л.Соловенчук
Институт биологических проблем Севера ДВО РАН, Магадан, 685010, Россия Поступила в редакцию 9 июля 1998
Ареал рябчика Bonasa bonasia (Linnaeus, 1758) охватывает всю бо-реальную зону Евразии. На основе морфологических, экологических и этологических признаков внутри этого вида выделяют 11 подвидов, многие из которых слабо различимы (Потапов 1987). Изменчивость рябчика в размерах и окраске сравнительно невелика и чаще имеет клинальный характер. В настоящем сообщении приведены результаты анализа различий гена цитохрома b у трёх достаточно хорошо дифференцированных морфологически и экологически подвидов: kolymensis, yamashinai и septentrionalis. Их краткая характеристика приведена ниже по Р.Л.Потапову (1985, 1987).
В. Ъ. kolymensis Buturlin, 1916. Населяет северо-восточную часть ареала вида, бассейн Колымы и Охотское побережье на юг до р. Уд. Хорошо обособленная форма, отличающаяся относительно малой величиной тела и сильным развитием белого цвета в окраске оперения. В окраске верха у самцов преобладает чисто серый оттенок. Для этого подвида характерны короткие пальцы и оперён-ность цевки почти до основания. Как правило, колымские рябчики обитают в долинных лиственничниках и скалистых участках гор, предпочитая густые заросли ольхи, берёзы, ивы и чозении. Зимой питаются серёжками ольхи и берёзы, а также побегами и почками ив и чозении. Среди осенних кормов в годы урожая важную роль играют семена лиственницы, питание которыми способствует быстрому накоплению жировых резервов. Этим колымский рябчик также заметно выделяется среди других. Гнездится позднее рябчиков других подвидов.
В. Ъ. yamashinai (Momiyama, 1928). Островной сахалинский подвид похож на kolymensis общей светлой окраской оперения, но белого цвета в нём меньше. В частности, белая полоса на боках шеи значительно уже и не доходит до белого окаймления горлового пятна. Среди южных популяций встречаются особи с рыжеватым оттенком верха. Распространение ограничено островом Сахалин. Излюбленные места обитания — смешанные слегка разреженные нагорные и пойменные леса, преимущественно по берегам рек и ручьёв. Зимнее питание представлено почками и концевыми побегами ивы, почками и серёжками ольхи и берёзы, ягодами шиповника. Весною кормится на ягодах шикши, голубики, брусники.
В. Ъ. septentrionalis Seebohm, 1890. Общий тон окраски верха тела пепельно-серый, иногда с лёгким буроватым оттенком. Населяет северо-восток европейской части России, Предуралье, Урал, Западную и Восточную Сибирь за исключением северо-восточной части Азии, выходя к Охотскому морю около устья Амура. Южная граница распространения septentrionalis на русском Дальнем Востоке не выяснена. Обитает в урёме и нагорной тайге. Питание сибирского рябчика в осенне-зимний период несколько отличается от сахалинского и колымского.
В современной таксономии для филогенетических построений часто используют данные генетического анализа митохондриальной ДНК. Преимущества использования этой молекулы обусловлено следующими её свойствами: 1) высокой скоростью эволюции, превышающей скорость эволюции ядерной ДНК в 5-10 раз; 2) небольшим размером молекулы и присутствием в клетках множества копий; 3) гаплоидностью митохондриального генома и его наследуемостью по материнской линии без рекомбинаций (Avise 1994).
Цель данной работы — оценить степень генетической дифференциации гена цитохрома b митохондриального генома у трёх подвидов Bonasa bonasia, обитающих в Сибири и на Дальнем Востоке, и сопоставить полученные результаты с литературными данными об эколого-морфологической дифференциации этих подвидов.
Материал и методы
Тотальная ДНК, используемая в опытах, была получена из мышечной ткани рябчиков (всего 14 особей) из Сибири (я = 5), Сахалина (и = 4) и Магаданской обл. (и = 5) с помощью стандартного метода, включающего обработку 1% раствором додецилсульфата натрия в присутствии протеинкиназы К (10 мкг/мл) при 37°С в течение ночи, очищение фенольной экстракцией и осаждение этанолом. Ген цитохрома b был амплифицирован в ПЦР с применением олигонук-леотидных праймеров А и F, описанных у Seibold (1994). Амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей по 20 пМ каждого праймера, 2 мМ каждого дНТФ, 5 мкл 10-кратного Taq буфера, 2 ед. активности Taq-полимеразы (НПО “Фермент”, Вильнюс) и 200-300 нг тотальной ДНК. Режим ПЦР: 94°С — 1 мин, 50°С — 2 мин, 72°С —2 мин; 35 циклов. Для рестрикционного анализа амплимеров был использован следующий набор эндонуклеаз рестрикции: Hinf I, Нра II, Rsa I, Нае III, Alu I, Mbo I, Taq I, Mva I (НПО “Фермент”, Вильнюс). Рестрикцию проводили согласно рекомендациям фирм-изготовителей. Рестрикционные фрагменты разделяли электрофорезом в 8% полиакриламидном геле. В качестве маркёра размеров фрагментов использовали ДНК плазмиды pBR322, гидролизованную рестриктазой Hinf I. Визуализацию ДНК проводили в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.
Величину дивергенции между последовательностями каждой пары гаплоти-пов митохондриальной ДНК, выраженную как процент замен нуклеотидов на рестрикционный сайт, оценивали на основе модели эволюции митохондриальной ДНК Нея и Таджимы (Nei, Tajima 1981). Модель основана на предположении, что все 4 нуклеотида распределены вдоль ДНК случайным образом и эволюция происходит путём случайных замен на сайт для хиу последовательностей митохондриальной ДНК. Степень дивергенции нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК (Р ) определяли исходя из доли общих фрагментов (F) отдельно для каждого класса ферментов по формулам:
2Nxv
F=-—
(.пх +пу)
где ПХИ Пу— число фрагментов, полученных после рестрикции в митотипе X и У; Nyy — число одинаковых фрагментов в обоих митотипах (Avise 1994; Суханова и
др. 1996). Величина F рассчитана с помощью программы Restsite (МШег 1991).
Р = \ — {0.5 • [- F + (F + 8г)]},
где г — количество пар оснований, узнаваемое рестрикгазой. Значения Р были рассчитаны отдельно для ферментов, узнающих 4, 5 пар нуклеотидов (Avise 1994).
Результаты и обсуждение
Мы представляем данные рестрикционного анализа гена цитохрома b митохондриального генома рябчиков из трёх регионов, относимых к отдельным подвидам. При рестрикционном анализе ам-плимера длиной 1140 п.н., полученного в ПЦР, обнаружено 3 гапло-типа — А, В и С. Гаплотипы были получены объединением рестрикционных морф митохондриальной ДНК каждого подвида. Порядок рестрикционных ферментов в гаплотипе: Hinf I, Rsa I, Нра II, Нае III, Mbo I, Nva I, Taq I, Alu I.
A — AAAAAAAA; В — BBAAAAAB; С — ABAAAAAA.
Гаплотип А выявлен у kolymensis из Магаданской обл., В — у уа-mashinai с о-ва Сахалин, С — у septentrionalis из Красноярского края.
Гаплотип А отличается от гаплотипа В по 3 сайтам рестрикции для ферментов Hinf I, Rsa I, Alu I, В от С — по 2 сайтам рестрикции для эндонуклеаз Hinf I, Alu I, А от С — только по 1 сайту для рест-риктазы Rsa I.
Возникновение и/или потеря сайтов рестрикции возможны в результате точечных замен в изучаемом гене. В таблице представлены размеры полученных рестрикционных фрагментов.
Размер рестрикционных фрагментов гена цитохрома b у Bonasa bonasia
Фермент Размер, п.н. Морфы Фермент Размер, п.н. Морфы
А В А В
Hinf 1 430 + Нра II 1140 +
370 + + Нае III 340 +
270 + 220 +
220 + + 154 +
160 + 80 +
60 + + Mbo I 1140 +
50 + + Mva I 670 +
Rsa 1 500 + 400 +
310 + 70 +
270 + + Taq I 1140 +
190 + Alu I 800 + +
160 + + 340 +
145 + + 220 +
65 + + 120 +
При исследовании митохондриальной ДНК рябчиков внутрипо-пуляционного полиморфизма на нашем материале не обнаружено.
Степень дивергенции между гаплотипами А и В составила 1.56%, между С и В — 1.04%, А и С — 0.42%. Рассчитанный нами уровень дивергенции не превышает значений Р, вычисленных при генетической дифференциации особей на подвидовом уровне (Wagner, Baker 1990; Shields 1990; Masuda, Yoshida 1994).
Таким образом, полученные нами данные позволяют говорить о том, что рябчики, обитающие в Магаданской обл., генетически более удалены от рябчиков, населяющих Сахалин. Это связано с географической изоляцией популяций. Результаты рестрикционного анализа гена цитохрома b хорошо согласуются с существующей под-видовой систематикой Bonasa bonasia, распространённых в Сибири и на Дальнем Востоке (Потапов 1987). Приведённые данные свидетельствуют о том, что эволюционные изменения сравнительно небольшого, но достаточно консервативного участка митохондриальной ДНК хорошо согласуются с морфологической и экологической дифференциацией подвидов.
Литература
Потапов Р.Л. 1985. Отряд курообразные (Galliformes). Семейство тетеревиные (Tetraonidae). JL: 1-638.
Потапов P.JI. 1987. Отряд курообразные Galliformes // Птицы СССР: Курообразные. Журавлеобразные. М.: 7-260.
Суханова Л.В., Смирнов В.В. и др. 1996. Исследование популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius методом рестрикционного анализа митохондриальной ДНК// Вопр. ихтиол. 36, 5: 667-673.
Avise J.C. 1994. Molecular markers, natural history and evolution. Chapman & Hall. Masuda R., Yoshida M.C. 1994. A molecular phylogeny of family Mustelidae (Mammalia, Carnivora), based on comparison of mitochondrial cytochrome b nucleotide sequences///. Zool. Soc. Japan 11: 605-612.
Miller J.C. 1991. RESTS ITE: a phylogenetic program that sort raw restriction data I I J. Hered. 125: 873-879.
Nei М., Tajima F. 1981. DNA polimorphism detectable by restrictionendonucleases // Genetics 97: 145-163.
Shields G.F. 1990. Analysis of Pacific Black Brant (Branta bemicla nigricans) // Auk 107: 620-623.
Seibold I. 1994. Untersuchungen zur molekularen Phylogenie der Greifvogel anhand von DNA — Sequenzen des mitochondriellen Cytochrom b - Genes. Hartung-Gorre 1994: 31-32.
Wagner C.E. van, Baker A.J. 1990. Association between mitochondrial DNA and morphological evolution in Canada geese///. Mol. Evol. 31: 373-382.
Ю OS
