CC BY
32
УДК 575.15; 639.3.032:639.371.5
Крась С.1., астрант; (s_kras@inbox.ru) Тарасюк С.1., чл.-кор. УААН, д-р с.-г. наук (tarasjuk@ukr.net) Мар1уца А. Е. кандидат бюл. наук © 1нститут рибного господарства НААН Украгни
ГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА СТАДА АМУРСЬКОГО САЗАНА (Cyprinus carpió haematopterus) РИБОГОСПОДАРСТВА «Л1СНЕВИЧ1»
Проанал1зовано генетичну структуру популяцИ сазана амурського за п 'ятьма генетико-бюх1м1чними системами. Встановлено в1дхилення фактичного розподыу частот генотитв в1д очжуваного за локусом трансферину. Виявлено вгдмтностг м1ж фактичною гетерозиготностю за вс1ма дослгджуваними локусами, окргм естерази. Дтшли висновку про те, що оцтка пол1морф1зму за цими генетико-бюх1м1чними системами може бути складовою для об'ективног ощнки генетичног структури дослгджуваного племядра сазана амурського в майбутньому.
Ключовi слова: амурський сазан, молекулярно-генетичт маркери ,генетична структура, гетерозиготтсть, трансферин, естераза, альбумт.
Вступ. Ефективне ведення промислового ставового рибництва на територи Украши передбачае використання низки селекцшно-племшних методiв по тдвищенню продуктивност вирощуванно! риби. Оскшьки основним об'ектом промислового рибництва е короп, то для тдвищення продуктивност його вирощування в рибнш галузi на рибогосподарських пщприемствах використовуеться метод промислово! пбридизацп амурського сазана (Cyprinus carpió haematopterus ) з коропом з метою одержання гiбридiв першого поколшня, яю характеризуются значним проявом ефекту гетерозису [1] i е бшьш стшкими до захворювань та впливу негативних факторiв навколишнього середовища. Для забезпечення ставового рибництва чистопородним високопродуктивним племшним матерiалом амурського сазана потрiбно проводити мошторинг генетично! структури племшних стад з метою дослщження !! стану та виявлення змш у нiй, який надасть змогу в подальшому проводити ефективну роботу iз збереження i консолщаци. Незважаючи на велику кiлькiсть методiв, як дозволяють маркувати мiнливiсть генетичного матерiалу, до цього часу найбiльш доступним, iнформативним та надiйним залишаеться метод аналiзу генетично детермiнованого полiморфiзму бшюв з вiдомими бiохiмiчними функцiями.
Тому метою нашо! роботи було дослщження генетично! структури племшного стада амурського сазана рибогосподарства «ЛюневичЬ» з використанням генетико-бiохiмiчних маркерiв.
Матер1али i методи. Матерiалом для дослiджень була плазма i еритроцити кров^ ввдбрано! з хвостово! вени 29 плiдникiв амурських сазанiв племядра
© Крась С.1., Тарасюк С.1., Мар1уца А. Е., 2011
рибогосподарства «.ШсневичЬ». В якост консерванту використовували гепарин з розрахунку 25 МО на 1 мл кровь Ввдбрану кров фракщонували центрифугуванням впродовж 10 хвилин та 3,5 тис. об/хв. Отримаш фракци кровi - плазму та еритроцити - фасували у пробiрки типу Епендорф, заморожували i збер^али при температурi -18°С до проведення дослщжень. Методом електрофорезу в полiакриламiдному та крохмальному гелях здiйснювали розподш бiлкiв iз наступним гiстохiмiчним пофарбуванням з власними модифжащями [2, 3, 4]. Як молекулярно-бiохiмiчнi маркери для характеристики генетично! структури популяци використовували розподш частот алелей i генотитв локусiв, що кодують наступнi бшки i ферменти: трансферин (Tf), альбумш (Alb), естераза (Est) (К.Ф.3.1.1.1.), супероксиддисмутаза (SOD) (КФ 1.15.1.1) та каталаза (CAT) (КФ 1.11.1.6).
Статистичну обробку даних здiйснювали за допомогою комп'ютерно! програми "BIOSYS-1"[5].
Результати дослщження. У дослщжуванш популяцп нами було виявлено полiморфiзм по всiх дослiджуваних генетико-бiохiмiчних системах. Найбiльшу кiлькiсть алельних варiантiв мiстив локус залiзозв'язуючого бiлку плазми кровi трансферину, основною функцieю якого е транспорт iонiв залiза вщ ентероцитiв до клiтин [6], зокрема, еритробласив червоного кiсткового мозку де вщбуваеться синтез гемоглобiну. У багатьох вцщв риб трансферин кодуеться одним геном [1]. Високий рiвень полiморфiзму цього бiлка спричинений широким спектром алелей (вщ 2 до 13) [7].
У дослщжуванш популяци сазана амурського нами виявлено п'ять алельних форм за локусом трансферину: TfA, TfB, TfCi, TfC2, TfD. Найбiльшою була частота алельного варiанту TfA (табл.1), яка становила 0,276, найменшою - TfD (0,138). Аналiз генотитв показав, що iз 15 можливих наявн лише 12, серед яких генотип АС1 зустрiчався з найбшьшою частотою, тодi як генотипи ВВ, C1D, C2D були вiдсутнi. За локусом трансферину нами встановлено статистично достовiрну вщмшшсть фактичного розподiлу кшькост генотипiв по вiдношенню до очшувано! за законом Хардi-Вайнберга у дослщжуванш популяцп сазана. Рiвень фактично! гетерозиготност (табл.1) був вищий за очшуваний на 4%.
Естераза плазми кровi е ферментом класу гiдролаз, який каталiзуе реакцп розщеплення ефiрних зв'язмв карбонових кислот з нафтолом. У риб естерази е продуктами декшькох локушв i по багатьох iз них спостерiгаеться iндивiдуальна мiнливiсть [8]. У дослщжуванш груш сазана виявлено два алельш варiанти, фракци яких рiзняться за рухливiстю у полiакриламiдному гелi: EstF -бiльш рухливi та EstS - бiльш повшьш. Частота алельного варiанту EstF становила 0,706, а EstS - 0,293 (табл.1).
Таблиця 1
Розподш алельних частот, очжуваних i фактичних генотишв у популяцй' сазана амурського (Cyprinus carpió haematopterus) за
дослщжуваними ^ локусами
Локус Алелi Частота Генотипи Кшьккть генотишв 7 2
наявна 04ÍKyeaHa
Tf А 0,276 AA 1 2,2 17,38*
АВ 4 3,3
AC1 6 3,05
AC2 3 3,05
В 0,207 AD 1 2,2
BB - 0,043
BC1 1 0,079
BC2 2 0,079
Ci 0,190 BD 5 0,057
C1C1 1 0,036
C2 0,190 C1C2 2 0,072
C1D - 0,052
D 0,138 C2C2 2 0,036
C2D - 0,052
DD 1 0,019
H0 = 0,827 Hs = 0,791
Est F 0,706 FF 15 14,5 0,2
S 0,293 FS 11 12
SS 3 2,49
H0 = 0,379 Hs = 0,414
Alb A 0,310 AA 1 2,78 2,4
AB 16 12,41
B 0,690 BB 12 13,8
H0 = 0,550 Hs = 0,428
SOD F 0,603 FF 15 10,55 0,19
S 0,396 FS 10 13,85
SS 4 4,5
H0 = 0,517 Hs = 0,478
САТ F 0,310 AA 1 2,78 2,89
S 0,690 AB 16 12,41
BB 12 13,8
H0= 0,655 Hs = 0,498
He = 0,586 S. E. = 0.091
Примiтка. Тут i далi Ho - фактична гетерозиготнiсть; Hs - оч^вана гетерозиготнють;
Не - середня гетерозиготнiсть на локус; * - достовiрнiсть вщмшносп фактично! кiлькостi генотипiв вiд оч1кувано! за критерieм Пiрсонa при Р<0,05.
У данш популяци виявили три можлив1 генотипи 3i значною перевагою гомозигот. Гетерозиготи становили 38% вщ загально! кшькосп генотишв. Значення оч1кувано! гетерозиготност по локусу естерази було вищим за наявну на
8,5% (табл.1). За локусом anb6yMiHy в амурського сазана, як i у бшьшосп шших видiв риб [1], виявлено два aлелi А i В. У данш популяци риб частше зустрiчaвся алель В (табл.1). Виявлено 3 i3 трьох можливих генотитв aльбумiну, серед яких переважали гетерозиготи (55% вiд загально! кiлькостi генотитв) та гомозиготи з генотипом ВВ (41%). Оч^вана гетерозиготшсть за даним локусом була меншою вiд наявно! на 22%.
Нами дослiджено полiморфiзм по локусах САТ та SOD у популяци сазана амурського.
Супероксиддисмутаза - ключовий фермент системи антиоксидантного захисту оргaнiзму, який здiйснюe дисмутацш реaкцiйно агресивного супероксидaнiонрaдикaлу до кисню та перекису водню. У ссавщв встановлено нaявнiсть двох аутосомних локуав SOD-S i SOD-М, якi кодують вiдповiдно цитозольну i мiтохондрiaльну форми ферменту [4]. 1ншими дослiдникaми у риб виявлено два локуси SOD-1 i SOD-2 [9].
У дослщжуванш популяци сазана нами виявлено два електрофоретичш вaрiaнти цього ферменту: F- швидкий i S - повшьний. SOD-F зустрiчaлaсь нaйчaстiше (табл.2). Статистично достовiрно! вiдмiнностi фактичного розподiлу генотитв вщ очiкувaного за законом Хард>Вайнберга нами не встановлено.
Каталаза е одним з нaйбiльш стiйких i активних ферментiв, що iнгiбують перекисш процеси, завдяки чому перекис водню не встигае окислити гемоглобш, утворити метгемоглобш i викликати передчасне пошкодження клiтини та гемолiз. Нами виявлений полiморфiзм по локусу САТ у дослщжуванш популяци сазана амурського, який мютив двi aлельнi форми: F- швидку i S - повшьну. За розподiлом алельних частот переважала швидка форма (табл.2). Очiкувaнa гетерозиготшсть була нижчою за наявну на 24%. Оскшьки розподш генотипiв статистично не вiдрiзнявся вiд теоретичного, то можна сказати, що дослщжувана популящя амурського сазана е врiвновaженою по даному локусу.
При оцiнцi динамши генетичного стану популяци важливим параметром е гетерозиготшсть (H). Мутацшний процес, рiзнi типи вiдбору, дрейф гешв та iншi фактори популяцшно! динамши часто впливають на гетерозиготнiсть популяци [10], особливо при обмеженому потощ гешв, тому li оцiнкa е необхщною умовою в популяцiйних дослщженнях. По величинi зростання гетерозиготностi за високополiморфними локусами можна робити ощнку про ефективну величину популяц^' батьюв [11], чи оптимальне кiлькiсне стввщношення самок i сaмцiв у популяци та ii величину [12]. З помiж шести дослiджених локусiв найбшьша рiзниця мiж фактичною гетерозиготнiстю i очiкувaною виявлена у локусах САТ i Alb (рис. 1).
Вщмшноси мiж наявною та очiковaною гетерозиготшстю у популяц^' говорить про випадковють у зростaннi частот окремих алелей у предкiв, що пов'язано iз недостaтнiм рiвнем обмiну генiв мiж субпопуляцiями амурського сазана через вплив iзоляцil на них. Одночасно вища фактична гетерозиготнiсть дослiджувaноl популяц^' по вщношенню до очiкувaноl з стввщношення Хард> Вайнберга вказуе на И високий потенцiaл генетично! мiнливостi.
□ наявна
□ оч[кувана
Tf Est Alb SOD CAT
Рис. 1. Р1вень наявноУ i о'пкуваноУ гетерозиготност1 по дослщжуваних локусах.
Висновки.
Таким чином, вщносно пiдвищена алельна i генотипова pi3HOMaHiTHiCTb генетично! структури дослщжено! групи амурського сазана, може бути обумовлена специфжою проведено! з нею селекцшно! роботи. Виявлений надлишок гетерозигот за окремими локусами свiдчить про наявшсть стабiлiзацiйних процесiв генетично!структури.
Обраш генетико-бiохiмiчнi системи, в поeднаннi з фенотиповими ознаками, можуть слугувати внутршньовидовими маркерами. Вони можуть бути використаш при характеристицi генофонду, для визначенш рiвня консолiдованостi та запасу генетично! мiнливостi популяцi! амурського сазана.
Л^ература
1. Кирпичников В. С. Гибридизация европейского карпа с амурским сазаном и селекция гибридов: Автореф. дис., д-ра биол. наук / В.С. Кирпичников. -1967. - 71 с.
2. Harris H. Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics./ H. Harris, D.Hopkinson. -Amsterdam: North-Holland Publ.Comp.,1976. -680p.
3. Gahne В. Horizontal polyacrylamide gradient gel electrophoresis for the simultaneous phenotyping of transferrin, post-transferrin, albumin and post-albumin in the blood plasma of cattle. / B. Gahne, RK Juneja, J.Grolmus. - Anim Blood Groups Biochem Genet.,-1977.-V.8,№3.-P.127-37
4. Глазко В.И. Генетика изоферментов сельскохозяйственных животных / В.И. Глазко. - ВИНИТИ. Сер. Общая генетика. - Итоги науки и техники, -1988. -Т.10. - 212с.
5. Swofford D. L. BIOSYS-1: a Fortran program for the comprehensive analysis of electrophoretic data in population genetics and systematic / D.L. Swofford, R.B. Selander / / J. Heredity. - 1981. - V. 72. P. 281-283.
6. Маслянко Р. П. Регулящя гомеостазу 3ani3a у тварин / Р. П. Маслянко, Л. Я. Пукало // Бюлопя тварин. - 2006. - Т.8, № 1-2. - С. 80-85.
7. Кирпичников В. С. Генетика и селекция рыб / В. С. Кирпичников. - Л.: Наука, 1987.-520 с.
8. Щербенок Ю. И. Связь полиморфных систем эстераз и трансферринов с хозяйственно важными признаками у карпа. /Ю. Щербенок. - Л.: -Биохимическая генетика рыб. Материалы 1-го всесоюзного совещания, 1973. -С.129-137.
8. Паавер Т. Биохимическая генетика карпа (Cyprinus сагрю L.) / Т. Паавер. - Таллин: «Валгус», 1983. - 122с.
10. Ли Ч. Введение в популяционную генетику / Ч. Ли . - М.: Мир, 1978. -
557 с.
11. Luikart G. Temporal changes in allele frequencies provide estimates of population bottleneck size / G. Luikart, J. M. Cornuet, F. Allendorf // Conservation Biology. - 1999. - V. 13, I. 3. - P. 523-530.
12. Ellen G. Using Maximum Likelihood to Estimate Population Size From Temporal Changes in Allele Frequencies / G. Ellen, W. Stalkin, M. Slatkin //
Genetics. - 1999. V. 152. - P. 755-761.
Summary
S. I. Kras, S.I. Tarasjuk, Mariutsa A.E.
Institute of Fisheries NAAS Ukraine GENETIC CHARACTERISTICS OF THE FLOCK AMUR CARP (Cyprinus carpio haematopterus) ON THE FISH-FARM "LISNEVYCHI"
Analyzed the genetic structure of populations of the Amur carp in five genetic-biochemical systems. Found deviations of the actual distribution of genotype frequencies expected for transferrin locus. Found to increase the actual heterozygosity for all loci studied, except esterase. Concluded that assessment of polymorphism of these genetic-biochemical systems can be a component for objective evaluation of control subjects populations genetic structure in the future.
Key words: Amur carp, molecular genetic markers, genetic structure, heterozyhotnist, transferrin, esterase, albumin.
Рецензент - к.б.н., доц. Божик В.Й.
