CC BY
19
УДК 575.113
Коршний С.М., мол. наук. ствроб^ник © 1нститут свинарства ¡м. О. В. Квасницького УААН, Полтава (копппу sergey@mail.ru, pigbreeding@ukr.net)
ПОПУЛЯЦ1ЙНО-ГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕЛИКО1 Б1ЛО1 ПОРОДИ СВИНЕЙ ЗА М1КРОСАТЕЛ1ТНИМИ МАРКЕРАМИ
Популяцтно-генетична характеристика трьох популяцт свиней великог бшог породи (англтськог селекцп та внутртородних титв УВБ-1 та УВБ-2) одержана за анал1зом п 'яти мжросателтних локусгв. Вгдмгчено достовгрт в\дмтност\ м1ж популящями за алельними частотами, розподтом генотитв та р1внями гетерозиготност1, що свгдчить про змту алельного спектру внасл\док селекцтного тиску.
Ключо^^ слова: популяц1я, популяцтно-генетична характеристика, мжросателтш локуси, р1вень гетерозиготност1, генетична дистанщя
Вступ
На сьогодшшнш день доля велико! бшо! породи свиней вщ загального поголiв'я складае близько 80 %. Селекцшна робота з даною породою ведеться в трьох напрямках. Результатом чого стало створення трьох внутртородних титв: материнського типу свиней з покращеними вщтворювальними якостями - укра!нсько! велико! бшо!-1 (УВБ-1), батьювського з покращеними вiдгодiвельними якостями УВБ-2 та з покращеними м'ясними якостями - УВБ-3. В наш час для вивчення мжроеволюцшних процеЫв, дослщження генетично! рiзноманiтностi, фшогенетичних взаемовiдносин та корегування напрямку селекцiйно! роботи все частше залучають молекулярно-генетичнi маркери рiзних клаав.
Для розв'язання даних завдань в свт останнiм часом використовують гiперварiабельнi локуси геному - мiкросателiти. Мжросател^ш локуси описанi для широкого кола органiзмiв. Щодо генома свинi, то приблизно 13% генiв мiстять мшросател^и. Найчастiше зустрiчаються динуклеотиднi повтори типу АС^Т (3,9%) -в 181 ядерному геш [1]. Взагалi, на сьогодшшнш день для геному свиш вщомо близько 5 000 мiкросателiтних локуав. Слiд вiдмiтити !х високу, порiвняно з iншими маркерами, гетерозиготнiсть та мiнливiсть, що е потужним шструментом при вивченнi генетичного рiзноманiття та мжроеволюцшних процесiв в штучних популящях.
В данiй роботi проведено популяцшно-генетичну оцiнку мiнливостi типiв велико! бшо! породи, УВБ-1 та УВБ-2, яю виникли за 30 рокiв направлено! селекци. В якостi контрольно! групи обрана популящя тварин велико! бiло! породи англшсько! селекцi! (ВБА), оскiльки дат тварини мають спiльнi предковi форми з втизняними внутрiпородними типами.
© Коршний С.М., 2008
58
Матер1али 1 методи.
Тварини. В якост пщдослщних було ввдбрано 120 тварин трьох провщних племшних господарств Укра!ни, характеристика яких наведена в
таблиц 1.
Таблиця 1.
_Характеристика дослщжуваних популящй тварин._
Популяци Кшьшсть гол1в Господарство - власник тварин
УВБ-1 40 Племзавод "Комсомолець", Микола!вська обл.
ВБ англшсько! селекцп (ВБА) 40 Племзавод "Степний", Запор1зька обл.
УВБ-2 40 Племзавод "Любомир1вка", Дшпропетровська обл.
Вiдбiр проб кровь Вiдбiр проб кровi вiд свиней проводили в ранковi години до годiвлi з вушно! вени в полiетиленовi пробiрки з антикоагулянтом такого складу [2]: 35 г натрш лимоннокислого, 20 г глюкози, 0,03 г риванолу, 0,15 г левомщетину, доводили об'ем до 1000 мл дистильованою водою. Кров брали у стввщношенш антикоагулянт:кров 1:6
Видiлення ДНК. ДНК видшяли сольовим методом [3]. 5 мл кровi з антикоагулянтом змшували з 30 мл холодного (4 0С) буферу для лiзису клiтин (0,32М сахарози, 5 мМ Mga2, 1% Тритон Х-100, 0.01М трис-НС1 (рН 7,6)) i витримували при 4 0С 30 хв. Ядра клiтин осаджували центрифугуванням при 4000 об/хв., 30 хв. при 40С. Осад ресуспендували в розчиш, що мiстив 1,5 мл ^ ЕДТА (75 мМ Nаa, 25 мМ ЕДТА (рН 8,0), 200 мкл 10 % SDS, 25 мкл (10 мг/мл) проте!нази К та шкубували 16 годин при 37 0С. До одержаного лiзату додавали 0,75 мл 5М ацетату калш, рН 4,8, обережно перемшували, витримували 30 хв. при температурi 4 °С та центрифугували (40 хв. 5000 об/хв., 4 0С). До супернатанту додавали два об'еми холодного (40С) 96% етанолу та вимотували ДНК на скляну паличку. Пiсля пiдсушування при кiмнатнiй температура ДНК двiчi промивали 70% етанолом та розчиняли в 0,5 мл буферу ТЕ (10 мМ Трк-НС1 (рН 7,4), 1 мМ ЕДТА (рН 8,0)) або 0,5 мл деюшзовано! води. Проби ДНК збер^али при - 20 0С.
Амптфжащя. Зразки ДНК, що були видшеш даним методом були використанi для проведення ПЛР-амплiфiкацil з праймерами мжросател^них локусiв S0005, S0155, S0101, SW857 i SW240. Структура праймерiв наведена в таблищ 2. Амплiфiкацiю проводили в мультиплекснш технiцi iз застосуванням двох наборiв праймерiв: перший набiр - 4 праймера (локуси S0005 i S0155), другий набiр - 6 праймерiв для трьох локуав (S0101, SW857, SW240).
Зазначенi мшросател^ш локуси рекомендованi FAO для дослщження генетично! рiзноманiтностi [4], та схвалеш дорадчим комiтетом ФАО-ISAG для дослщження генетичних дистанцш [5].
Реакцiю проводили в 0,6-мл мiкроцентрифужних пробiрках на термоциклерi «Терцик - 2» НПФ «ДНК-технологии» Роая. 25 мкл ПЛР-сум^ мiстили: 2,5 мкл 10-ти кратного буфера, 1мкл 2,5 тМ dNTP, по 0,5 мкл (0,1 опт.
59
один.) праймерiв, 1,5 мкл 50 тМ MgQ2, ДНК свиней - до юнцево! концентрацп 1 мкг/мл, 2-3 од. ДНК-полiмерази ^егтш aquaticus («ТапотЫ», Росiя, м. Москва). На сумш нашаровували 25 мкл мшерального масла. Проводили 35 ци^в амплiфiкацi! за параметрами: 1 хвилина - 94 °С, 1 хвилина -60°С, 1 хвилина - 72 °С. Останнiй цикл амплiфiкацi!: 6 хвилин - 72 °С.
Таблиця 2.
Структура праймерiв для ПЛР- ампл1(1нкацп мiкросателiтних локусiв
Д НК свиш, що використаш в дослщженнях.
Локус Мш. довжина Макс. довжина Послвдовшсть 5' - 3'
S0005 201 243 F: 5'-ТССГГСССГССТООТААСГА-3'
R: 5'-ОСАСТТССТОАТТСТОООТА-3'
S0155 146 172 F: 5'-ТОТТСТСТОТТТСТССТСТОТТТО-3'
R: 5 '-ОТТАААОТООАААОАОТСААТООСТАТ-3'
S0101 195 215 F: 5'-ОААТОСАААОАОТТСАОТОТАОО-3'
R: 5'-ОТСТСССТСАСАСТТАССОСАО-3'
SW857 134 156 F: 5'-ТОАОАООТСАОТТАСАОААОАСС-3'
R: 5'-ОАТССТССТССАААТСССАТ-3'
SW240 90 110 F: 5'-АОАААТТАОТОССТСАААТТОО-3'
R: 5'-АААССАТТААОТСССТАОСААА-3'
ДНК-типування. Електрофоретичне роздiлення фрагментiв ДНК проводили в 10 %, денатуруючому полiакрiламiдному гелi у 0,5-кратному трк-боратному електрофорезному буферi (ТВЕ), згiдно з методичними рекомендащями [6]. Електрофорез проводили у термостатованш електрофорезнiй камерi 1-3 годин при напрузi 2 вольта/см геля та температурi 50оС. Фарбування гелiв здiйснювали за допомогою бромистого етидш (0,5 мкг/мл) протягом 10 хв. з наступним вiдмиванням у дистильованш водi. Вiзуалiзацiю фрагментiв ДНК проводили в УФ свiтлi та фотографували на цифрову фотокамеру. Розмiри отриманих в ПЛР продуктiв визначали за допомогою маркеру молекулярно! маси pBR322/BsuRI.
Статистична обробка даних. Статистичну обробку даних проводили на персональному комп'ютерi з використанням програм BЮSYS-1 [7] та GENALEX 6 [8].
Результати дослщження.
Аналiз алельних частот п'яти мжросател^них локусiв у свиней велико! бшо! породи укра!нсько! селекци (внутрiпороднi типи УВБ-1 та УВБ-2) та англiйсько! селекцi! виявив достовiрнi рiзницi мiж популяцiями. Так, частота алеля №4 локусу S0005 в популяци ВБА склала 0,025 i достовiрно (р<0,05) вiдрiзнялася вiд тако! в популяцi! УВБ-2, де дорiвнювала 0,150. За алелем №5 цього ж локусу достовiрнi вiдмiнностi (р<0,01) спостерiгалися мiж популяцiями
60
УВБ-1 та ВБА, де частота дорiвнювала 0,125 в УВБ-1, у тварин ВБА даний алель був вщсутшм.
Знайдено вщмшност мiж популяцiями тварин i за частотами алелiв локусу S0155, зокрема по алелю №3 мiж ВБА та УВБ-2 (р<0,01, частоти алеля в популяцiях склали 0,025 та 0,238, вщповщно) i по алелю №4 мiж популяцiями ВБА та УВБ-1, з частотами 0,013 i 0,200 вщповщно, р<0,01.
За частотою алеля № 2 локусу S0101 також вiдмiчено вiрогiдну рiзницю мiж популяцiями УВБ-1 та ВБА.
За локусом SW857, частота алеля №3 достовiрно вiдрiзнялася (р<0,01) в популящях ВБА та УВБ-2, де значення частот дорiвнювало 0,125 i 0,413, вщповщно. Частоти алеля №5 достовiрно вiдрiзнялася в популяци УВБ -1 (р<0,05).
Найвищий рiвень iнформативностi щодо дослiдження внутршородно1 рiзницi мав локус SW240 оскiльки вiдмiчено найбiльшу кшьюсть маркерних алелiв, характерних для певно! дослщжувано1 популяци. Так, частота алеля №2 в популяци УВБ-1 дорiвнювала 0,338, тодi як у тварин УВБ-2 даний алель був вщсутшм (р<0,001). За алелем №3 достовiрну рiзницю вiдмiчено мiж популяцiями ВБА та УВБ-1, де частоти складали 0,025 i 0,250, вiдповiдно (р<0,01). Концентрацiя алеля №4 в популяци УВБ-1 (0,213) достовiрно вiдрiзнялась за другим порогом достовiрностi вiд частоти даного алеля в популящях ВБА i УВБ-2, де вона була однаковою (0,013). За алелем №5 найменша частота спостер^алась у тварин УВБ-1 (0,088), яка вiрогiдно вiдрiзнялась вщ тако! в популяци УВБ-2 (0,213), р<0,01. Частота алеля 6 даного локусу мала максимальне значення в популяци тварин УВБ-2 (0,300), в популяци ВБА частота дорiвнювала 0,188, щ значення достовiрно вiдрiзнялися за третiм порогом достовiрностi вщ тварин УВБ-1, де даний алель був вщсутшм. За частотою алеля №7 популящя тварин УВБ-2 вiдрiзнялися вщ популяци УВБ-1 (р<0,01), значення частот алелiв 0,263 i 0,038 вщповщно. За восьмим алелем достовiрна рiзниця виявилась мiж тваринами УВБ-2, де частота дорiвнювала 0,063, та УВБ-1, де даний алель був вщсутшм (р<0,05).
Для характеристики генетично1 мiнливостi використанi наступнi показники: фактична гетерозиготшсть, очiкувана гетерозиготнiсть та фшсацшний iндекс.
Рiвнi фактично1 гетерозиготностi за мжросател^ними локусами серед популяцiй велико1 бшо1 породи свиней були в межах 0,150 - 0,675. Мшмальним це значення було за локусом S0155, а максимальним за локусом S0005 в популяци УВБ-1 та за локусом S0101 в популяци УВБ-2.
В ходi наших дослщжень виявлено достовiрнi рiзницi мiж рiвнями гетерозиготностi фактично1 та оч^вано1.
Серед дослщжених популяцiй спостерiгаeмо дефiцит гетерозигот, що може бути результатом селекцшного тиску, внаслiдок якого iде вiдбiр гомозиготних тварин.
Щодо фiксацiйного iндексу, то його значення в уах популяцiях за всiма маркерами позитивш, що може свiдчити про певний стутнь iнбридингу в
61
популящях. З погляду на те, що даш популяци тварин е закритими, отримаш даш - це результат закономiрних генетико-популяцшних процесiв.
Таблиця 3
Генетична мшливкть в популящях свиней велико! бiло'l' породи свиней
Популящя Локус п Фактична гетерозиготшсть (Но) Оч1кувана гетерозиготшсть (Не) Фшсацшний вдекс
ВБА 80005 40 0,425 0,669 * 0,364
80155 40 0,350 0,633 * 0,447
80101 40 0,325 0,740 *** 0,561
SW857 40 0,625 0,782 0,201
8W240 40 0,475 0,652 0,271
По п'яти локусам 0,440 0,695 * 0,369
УВБ-1 80005 40 0,675 0,817 0,173
80155 40 0,275 0,809 *** 0,660
80101 40 0,275 0,759 *** 0,638
8W857 40 0,600 0,768 0,219
SW240 40 0,350 0,764 *** 0,542
По п'яти локусам 0,435 0,783 ** 0,446
УВБ-2 80005 40 0,575 0,722 0,203
80155 40 0,150 0,698 *** 0,785
80101 40 0,675 0,759 0,110
SW857 40 0,300 0,708 *** 0,576
8W240 40 0,600 0,778 0,229
По п'яти локусам 0,460 0,733 * 0,381
В середньому по трьом популящям 0,445 0,737 ** 0,399
Приметка: *, **, *** - р < 0,05, р < 0,01, р < 0,001 вщповвдно.
Також слiд вщм^ити достовiрнi вiдхилення в розподiлi генотитв мiж фактичними та очiкуваними значеннями за Гард>Вайнбергом. Серед дослiджених популяцш таю вiдхилення не були вiдмiченi тiльки за локусом SW240 серед тварин ВБА та УВБ-2, за локусом SW857 для тварин УВБ-1 та за локусом S0005 для тварин УВБ-2. Проте, в популяци ВБА вiдмiчено достовiрнi вiдхилення (р < 0,001) за локусами S0105, S0101, SW857 та (р < 0,01) за локусом S0005. В популяци УВБ-1 вiдмiчено достовiрнi вщхилення (р < 0,001) за локусами S0105, S0101, SW240, а за локусом S0005 за другим порогом (р < 0,01). Вщхилення в популяци УВБ-2 характеризуются достовiрною рiзницею в розподiлi генотипiв за локусами S0105 та SW857 за треим порогом
62
достовiрностi (p < 0,001) та за локусом S0101 за першим порогом достовiрностi (p < 0,05).
При розрахунку генетичних дистанцш за Неем мiж дослщжуваними групами тварин (табл.4), максимальне значення дистанци спостерiгали мiж популяцiями ВБА та УВБ-1 - 0,356.
Таблиця 4
Генетичш дистанци Ds за Неем миж дослiдженими популящями
Популяци ВБА УВБ-1 УВБ-2
ВБА ***** 0,356 0,161
УВБ-1 ***** 0,304
УВБ-2 *****
Дещо меншою виявилась генетична дистанцiя мiж популяцiями УВБ-1 та УВБ-2 - 0,304. Мшмальним значенням дистанци характеризувалися популяци ВБА i УВБ-2 - 0,161. Найбшьша дистанцiя за Неем виявилась мiж тваринами УВБ-1 та ВБА, на нашу думку, е результатом селекци цих двох титв за рiзними напрямками продуктивностi. Висновки.
1. Виявлено достовiрну мiжпопуляцiйну рiзницю за алельними частототами п'яти локуав мшросател^но! ДНК.
2. В уЫх дослiджених популяцiях спостерiгаеться низький рiвень фактично! гетерозиготностi, що достовiрно вщмшний вiд очжувано!, що вказуе на наявшсть селекцiйного тиску та переважаючий вiдбiр гомозиготних тварин.
3. Позитивш значення фiксацiйного iндексу в уах дослiджених популяцiях може свiдчити про певний стутнь iнбридингу в популящях.
4. Достовiрнi вiдхилення виявленi в розподш генотипiв з очiкуваними при умовi генетично! рiвноваги за Гард>Вайнбергом, що також свiдчить про селекцшний тиск в дослiджених популяцiях.
5. Вщсутшсть генетично! рiвноваги за розподшом генотипiв в популяцiях тварин ВБ породи свщчить про залучення алелiв мiкросателiтних локусiв в селекцiйний процес i закрiпленню в популяцiях певних генiв, що вiдповiдають за прояв бажаних кiлькiсних ознак, формування груп зчеплення мiкросателiтних локусiв з кандидатними генами продуктивних якостей наклало вщбиток на популяцшно-генетичний баланс мiкросателiтних алелiв. Таким чином, результати проведених дослщжень протирiчать теори селективно! нейтральностi мшросател^них локусiв i надають можливiсть використання цих зручних iнформативних маркерних систем в практичнш селекцi!.
Лiтература:
1. Johansson M., Ellegren H., Andersson L. Cloning and characterization of highly polymorphic porcine microsatellites // J. Hered. - 1992. - Vol.83.-P.196-198.
2. Тихонов В.М. Иммуногенетика и биохимический полиморфизм домашних и диких свиней. - Новосибирск: Наука, 1991.- 300 с.
3. Соколов Б.П., Джемелинский В.В. Выделение высокомолекулярной эукариотической ДНК с использованием ацетата калия// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 1989.- N6.- С. 45-46.
63
4. Barker J.S.F., Hill W.G., Bradley D., Nei M., Fries R., Wayne R.K., Measurement of domestic animal diversity (MoDAD): original working group report, FAO, Rome, 1998.
5. Laval G., Iannuccelli N., Legault Chr. at al. Genetic diversity of eleven European pig breeds // Genet. Sel. Evol. 2000.- Vol. 32.- p. 187-203.
6. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Д. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Под ред. Баева А.А.- М.: Мир.- 1984.- 479 с.
7. Swofford D.L., Selander A.W.F. "Biosys-1" a FORTRAN program for the comprehensive analysis of electroforetic data in population genetics and systematic// J. Heredity.- 1981.- Vol.72.-P.281-283.
8. Peakall, R. and Smouse P.E. (2006) GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes. 6, 288-295/
Summary
The genetic-populations characteristics of three Large white breed pig populations (English selection and intrabreed types ULW-1 and ULW-2) is received by using five microsatellites. The significant difference between populations on allele frequencies, allocation of genotypes and heterozygosis levels, that testifies about change allele spectrum probably as a result of selection pressure and the directed selection.
Стаття надшшла до редакцИ 5.08.2008
64
